1. osa: Anorgaanilise nitraadi renovaskulaarsed toimed pärast neerude isheemia-reperfusiooni

Lisateabe saamiseks. kontaktitina.xiang@wecistanche.com

ABSTRAKTNE

Taust: Neeruisheemia-reperfusiooni (IR) kahjustuson tavaline põhjusäge neerukahjustus(AKI), mis on seotud oksüdatiivse stressi ja lämmastikoksiidi (NO) bioaktiivsuse vähenemisega ning suurenenud riskiga haigestuda.krooniline neeruhaigus(CKD) ja südame-veresoonkonna haigused (CVD). Uutel redokstasakaalu taastavatel strateegiatel võib olla terapeutiline mõju AKI ja sellega seotud tüsistuste ajal.

Eesmärk: uurida nitraadi-nitriti-NO raja võimendamise terapeutilist väärtust IR-indutseeritud neeru- ja kardiovaskulaarse düsfunktsiooni tekke ajal.

meetodid: Isastele C57BL/6 J hiirtele anti naatriumnitraati (10 mg/kg, ip) või kandjat 2 tundi enne vasaku neeru sooja isheemiat (45 min), millele järgnes naatriumnitraadi lisamine joogivees (1 mmol/kg/). päeval) järgmise 2 nädala jooksul. Mõõdeti vererõhku ja glomerulaarfiltratsiooni kiirust ning koguti veri ja neerud ning neid kasutati biokeemilisteks ja histoloogilisteks analüüsideks ning neeruveresoonte reaktiivsuse uuringuteks. Mehhaanilistes uuringutes kasutati glomerulaarseid endoteelirakke, mis olid eksponeeritud hüpoksia-reoksügeniseerimisele koos angiotensiiniga Ⅱ või ilma.

Tulemused: IR seostati neerufunktsiooni languse ja veidi kõrgenenud vererõhuga koos neerukahjustuste, põletiku, endoteeli düsfunktsiooni, suurenenud Ang Ⅱ taseme ja Ang II vahendatud vasoreaktiivsusega, mida kõik nitraat leevendas. Lisaks taastas töötlemine nitraadiga (in vivo) ja nitritiga (in vitro) NO bioaktiivsuse ja vähendas mitokondriaalset oksüdatiivset stressi ja vigastusi.

Järeldused: Akuutne ravi anorgaanilise nitraadiga enne neeruisheemiat võib olla uudne terapeutiline lähenemine AKI ja kroonilise neeruhaiguse ning sellega seotud arenguriski ärahoidmiseks.südame-veresoonkonna düsfunktsioon.

Klõpsake, et jõuda tarnijani, et saada cistanche kogemusi

1. Sissejuhatus

Neeru isheemia-reperfusiooni (IR) kahjustus, mis on seotud siirdamise, südame šunteerimise operatsiooni ja šokiga, on suur oht ägeda neerukahjustuse (AKI) ja sellele järgneva kroonilise neeruhaiguse (CKD) tekkeks [1]. Selle aluseks olevad mehhanismid on keerulised ja hõlmavad reperfusiooniga seotud oksüdatiivset stressi, lämmastikoksiidi puudulikkust ja immuunrakkude aktivatsiooni, mis koos põhjustavad endoteeli düsfunktsiooni [2, 3]. Käimasolevad uuringud on keskendunud uute ja tõhusate ravimeetodite leidmisele AKI ja selle kroonilise neeruhaiguseks progresseerumise ennetamiseks ja raviks, nagu kaug-isheemiline eelkonditsioneerimine, ajutine lokaalne hüpotermia ja uued farmakoloogilised sekkumised [3,4].

Gaasiline signaalmolekul lämmastikoksiid (NO) aitab oluliselt kaasa südame-veresoonkonna ja neerude homöostaasi reguleerimisele ning on näidanud, et see mängib infrapunavigastuste ajal kaitsvat rolli [5, 6]. Kuid isheemilise sündmuse ajal kahjustab hapnikupuudus endoteeli NO süntaasi (eNOS) funktsiooni, mis võib reperfusioonifaasis kaasa aidata isheemilise koe "tagasivoolu nähtusele". See omakorda levitab endoteeli ja tubulaarsete epiteelirakkude vigastusi [7], mis aitavad kaasa neerufunktsiooni langusele. Lisaks hüpoksiale isheemilisel perioodil eemaldab nikotinamiidadeniindinukleotiidfosfaadi (NADPH) oksüdaasi ja mitokondrite poolt reperfusioonifaasis liigselt tekitatud reaktiivsete hapnikuliikide (ROS) liigne tootmine NO [8]. Uued lähenemisviisid, mis vähendavad oksüdatiivset stressi ja säilitavad NO bioaktiivsust, võivad omada terapeutilist väärtust võitluses IR-indutseeritud neerupuudulikkuse vastu.

Anorgaanilist nitraati (NO3) ja nitritit (NOZ) peeti varem suhteliselt inertseks NO metabolismist saadud toodeteks. Enam kui kaks aastakümmet läbi viidud uuringud on aga näidanud, et need anioonid võivad järjestikuste redutseerimiste kaudu biokonversiooni teha ja moodustada taas NO ja teisi bioaktiivseid lämmastikoksiidi liike [9]. Selle alternatiivse nitraat-nitrit-NO raja aktiivsus suureneb hüpoksia ja madala pH-ga tingimustes, kui klassikaline NOS-süsteem võib muutuda düsfunktsionaalseks [10].

Toitumine, lisaks NOS-süsteemile, on oluline nitraadi ja nitritite allikas tsirkuleerivates nitraadides, kuna nitraadisisaldus on kõrge, näiteks rohelistes lehtköögiviljades. Nii eksperimentaalsetes kui ka kliinilistes uuringutes on anorgaaniliste nitraadide ja nitrititega toidulisandite kasutamist seostatud soodsate kardiovaskulaarsete toimetega, sealhulgas vererõhu langusega [11]. Organite kaitsvat toimet on näidatud ka eksperimentaalsetes maksa [12], aju [13], kopsude [14] ja südame infrapunakiirguse kahjustuse mudelites [12,15]. Anorgaanilise nitraadi ja nitriti potentsiaalne terapeutiline väärtus neeru infrapunakahjustuse korral on siiski vastuoluline. Nagu hiljuti läbi vaadatud [5], võivad nitritteraapiat kasutavate IR-mudelite tulemused olla tingitud erinevustest kasutatud annustes, manustamisviisis, ravi kestuses ja ka eksperimentaalses mudelis endast [16,17]. Mitmed eksperimentaalsed uuringud on näidanud nitraatide toidulisandite kaitsvat toimet südame-veresoonkonna haiguste mudelites mehhanismide kaudu, mis hõlmavad oksüdatiivse stressi summutamist ja NO bioaktiivsuse parandamist, samutipõletikulised reaktsioonid[5]. Praeguseks on vähe teadmisi anorgaanilise nitraadiga ravi mõju kohta neerude infrapunakahjustuse korral. Oleme varem näidanud, et krooniline toidueelne eeltöötlus nitraadiga nõrgendas järgnevaid IR-indutseeritud neerukahjustusi [18]. Siiski on vähem teadmisi nitraat-nitrit-NO raja võimendamise võimalikust väärtusest IR alguses, et vähendada AKI ja kroonilise neeruhaiguse tekke riski. Kui see on kaitsev, võib sellel olla laialdane kliiniline rakendus AKI väljakujunemise riskiga patsientidel, näiteks neil, kellel tehakse suur operatsioon.

Selles uuringus kasutasime neerude IR-kahjustuse hiiremudelit, et uurida ägeda nitraadiravi võimalikke eeliseid vahetult enne isheemilist sündmust. Seda kombineeriti mehhaaniliste ex vivo anumauuringute ja in vitro rakukultuuri katsetega nitrititöötlusega. Me oletasime, et nitraadi-nitriti-NO raja võimendamine soodustaks neerude kaitset IR-kahjustuse eest oksüdatiivse stressi ja NO bioaktiivsuse ning mitokondriaalse funktsiooni moduleerimise kaudu.

2. Meetodid

2.1.Reaktiivid

Kui pole öeldud teisiti, saadi kõik reaktiivid ettevõttest Sigma-Aldrich, Rootsi.

2.2. Loomad ja neeruisheemia-reperfusioonimudel

C57BL/6 J hiired (isased, 10 nädalat) saadi ettevõttest Janvier Lab-oratories (Prantsusmaa) ja neid hoiti meie loomapidamisasutustes Karolinska Instituudis kontrollitud kliimatingimustes 12-tunnise valguse/pimeduse tsükliga ning neid hoiti tavalise näriliste toiduga ja kraaniveega. Kõik loomkatsed kiideti heaks piirkondliku loomkatsete eetikakomitee poolt (protokolli ID: N139/15) ja need viidi läbi vastavalt riiklike tervishoiuinstituutide (NIH) juhistele ja EL-i direktiivile 2010/63/EL. loomkatsed.

Pärast 1-nädalast aklimatiseerumist manustati hiirtele platseebot (NaCl) või naatriumnitraati (NaNO3) intraperitoneaalselt (10 mg/kg) 2 tundi enne vasaku neeru ühepoolset isheemiat. Parem neer vaadati üle, aga muidu jäeti terveks. Näidisoperatsioonid tehti samamoodi, kuid ilma vasaku neeru klambrita. Hiired anesteseeriti isofluraaniga ja kehatemperatuuri hoiti 37 ± 0,5 kraadi juures, kasutades kogu operatsiooni vältel soojenduslampi ja isejälgitavat kuumutuspatja. Pärast operatsiooni raviti hiiri kas naatriumnitraadiga (1 mmol/kg/päevas) või platseeboga 2 nädalat kuni lõpetamiseni.

2.3. Vererõhu mõõtmine

Enne lõpetamist mõõdeti hiirtel vererõhku, kasutades mitteinvasiivset sabamanseti meetodit. Hiiri konditsioneeriti 10 minutit soojal plaadil temperatuuril 35 °C ja asetati seejärel plastist kinnititesse. Saba külge kinnitati pneumaatilise pulsianduriga mansett ja vererõhu väärtused registreeriti CODA süsteemiga (Kent Scientific, Torrington, CT, USA). Loomi treeniti soojendusplaadil olevate piirajatega vähemalt kolm päeva enne vererõhu mõõtmist. Süstoolne, diastoolne ja keskmine arteriaalne rõhk koguti 3 järjestikuse päeva jooksul ning hindamiseks koostati kõigi aktsepteeritud väärtuste individuaalne mediaan.

2.4.Koesaak

Enne lõpetamist pandi hiired metaboolsetesse puuridesse, et koguda uriini glomerulaarfiltratsiooni kiiruse (GFR) arvutamiseks. Seejärel anesteseeriti loomad isofluraaniga ja vereproovid koguti madalama õõnesveeni kaudu. Kõiki proove tsentrifuugiti kohe 6000 x g, 4 °C juures 5 minutit EDTA (Sigma-Aldrich, Stockholm, Rootsi) juuresolekul, lõppkontsentratsiooniga 2 mM. Plasmaproovid viidi üle uutesse katsutitesse ja külmutati kohe kuivas jääs ning lõpuks säilitati -80 kraadi juures. Neerud ekstraheeriti ja lõigati mitmeks osaks ex vivo veresoonte funktsiooni katseteks (interlobaararterid ja aferentsed arterioolid), histoloogia ( HE ja PAS värvimine) ning apoptoosi ja põletiku kvantifitseerimine (Tissue-Tek optimaalse lõiketemperatuuri (OCT) ühendi manustamine ja külmutamine TUNEL ja F4/80 värvimiseks).

2.5. Nitraadi, nitriti, cGMP, kreatiniini, vere uurea lämmastiku (BUN) ja angiotensiin II mõõtmine

Nitriteid ja nitraate analüüsiti HPLC (ENO-20) abil, nagu eelnevalt kirjeldatud 【19】. Plasmaproovid (10 ul) süstiti Hamiltoni süstlaga HPLC süsteemi. Seejärel eraldati nitrit ja nitraat pöördfaasi/ioonivahetuskromatograafiaga, millele järgnes nitraadi redutseerimine nitritiks kaadmiumi ja redutseeritud vase abil. Nitrit derivatiseeriti Griessi reagendi abil diasoühendite moodustamiseks ja tuvastati 540 nm juures. cGMP lagunemise vältimiseks viidi plasma tuubidesse, mis sisaldasid PDE inhibiitorit BMX (3-isobutüül-1metüülksantiini; Sigma-Aldrich #I5879), et saada lõppkontsentratsiooniks (10 μM). Proovid võeti seejärel külmutada ja säilitada temperatuuril -80 kraadi enne cGMP analüüsimist ELISA komplektiga (GE Healthcare #RPN226) vastavalt tootja juhistele.

Plasma ja uriini kreatiniinitasemed tuvastati kreatiniini kolorimeetriliste analüüsikomplektide abil (Cayman Chemical, #700460 ja #500701). GFR hindamiseks kasutati kreatiniini kliirensi valemit (CLcr =Urinecrx Urine flow/Plasmacr). Plasma BUN-i tasemed tuvastati BUN-i kolorimeetrilise tuvastamise komplekti (Invitrogen, #EIA-BUN) abil. Ang tasemeid plasmas ja neerukudedes mõõdeti, kasutades Ang ⅡI ELISA komplekti (Cloud-Clone Corp., nr CEA005Mu) vastavalt tootja juhistele. Kuid koeekstrakti valmistamine erines veidi soovitusest. Kudele lisati 10 mahuosa 50 mM HCl 50% EtOH-s ja kuumutati 10 minutit 100 kraadi juures, tsentrifuugiti 10 000×g 10 min. Seejärel proovid külmutati ja säilitati enne analüüsimist -80 kraadi juures. Kõik neeldumisnäidud tehti SpextraMax iD3-s firmast Molecular Devices.

2.6. Interlobaararterite isoleerimine ja perfusioon

Neerud koguti pärast ohverdamist ja neid hoiti jääkülmas füsioloogilises soolalahuses (PSS) kuni interlobaarsete arterite isoleerimiseni. Neerude interlobaararterid lõigati lahti (2 mm pikkused) ja paigaldati a

müograafikamber (mudel 620 M, Danish Myo Technology, Taani) koos PS-idega, nagu eelnevalt kirjeldatud [20]. Isomeetriline pinge registreeriti Powerlabi süsteemiga (Powerlab 4/30, AD Instruments, Austraalia). Pärast paigaldamist tasakaalustati veresooni 20 minutit süsihappegaasiga (95% O2; 5% CO2) mullitavas PS-s temperatuuril 37 kraadi, pH 7,4. Seejärel määrati arterite puhkepinge nagu eelnevalt kirjeldatud [21], mis on vastavalt Mulvany normaliseerimisprotseduurile [22]. Pärast teist tasakaalustamist lisati arteriaalse ringi elujõulisuse hindamiseks 0,1 mol/L KCl.

2.7. Aferentsete arterioolide isoleerimine ja mikroperfusioon

C57BL/6 J hiired anesteseeriti inhaleeritava isofluraaniga ning neerud eemaldati ja viilutati kiiresti, nagu eelnevalt kirjeldatud [23-25]. Neerulõigud asetati jääkülma Dulbecco modifitseeritud Eagle’i söötmesse (DMEM). Üksik aferentne arteriool koos kinnitatud glomerulusega lõigati stereomikroskoobi all mikrodissekteeriti ja viidi üle

reguleeritud temperatuuriga kamber pöördmikroskoobi laval. Glomerulus fikseeriti hoidva mikropipetiga ja aferentne arteriool kanüüliti ja perfuseeriti mikropipettide komplektiga. Perfuseeritud aferentse arteriooli intraluminaalne rõhk hoiti katsete ajal 60 mmHg juures. Dissektsiooni ja sellele järgneva mikroperfusiooni aeg oli piiratud 120 minutiga pärast hiire surmamist, nagu eelnevalt kirjeldatud [26]. Pärast 30-minutilist tasakaalustamisperioodi 37 kraadi juures saadi kumulatiivsed annuse-vastuse kõverad Ang II suhtes (10-12 kuni 10-8 mol/L). Iga Ang II kontsentratsiooni perfuseeriti 2 minutit, konstriktiivne reaktsioon registreeriti ja seejärel mõõdeti aferentse arteriooli läbimõõt.

2.8. Histoloogiline uuring

Neeruproovid koguti ja fikseeriti 4% paraformaldehüüdi lahuses. Fikseeritud neerukoed sisestati parafiini ja seejärel viilutati ja värviti histoloogiliseks hindamiseks hematoksüliin-eosiini (H&E) või perioodilise happe Schiffiga (PAS). Analüüsiks kasutati igast katserühmast nelja juhuslikult valitud looma. Kümme juhuslikult valitud välja igast sektsioonist jäädvustati 400-kordse suurendusega. Kõik morfomeetrilised analüüsid viidi läbi pimendatud viisil.

2.9. TUNEL värvimine

TUNELi värvimiseks kasutati OCT-ga manustatud neeruproove. 6-μm paksuseid sektsioone inkubeeriti 20 ug/ml proteinaas K-ga 15 minutit toatemperatuuril ja TUNELi reaktsioonid viidi läbi Click-iTTM Plus TUNEL testiga (Invitrogen C10618, USA), järgides tootja juhiseid. Protokolli lõpus viidi läbi DAPI värvimine. Kvantifitseerimiseks valiti juhuslikult kolm looma ja kolm kujutise väliala (200 ×) ning pildistati Zeiss LSM800-Airy konfokaalse mikroskoobi abil, positiivsed signaalid kvantifitseeriti ImageJ/Fiji tarkvara abil ja arvutati positiivsete signaalide suhe DAPI-sse.

2.10. Kudede immunofluorestsentsvärvimine ja konfokaalne mikroskoopia (F4/80)

Neerud külmutati ÜMT-s (Tissue-Tek, Torrence, CA, USA) ning lõigud (6 μm) valmistati ette ja töödeldi edasi. Külmutatud sektsioone pesti 1 × PBS-ga ja blokeeriti 2% BSA-ga PBS-is 30 minutit ning inkubeeriti seejärel anti-F4/80-ga (1:50, BIO-RAD Cl: A3-1) üleöö 4 kraadi juures. külmkambris ja seejärel sekundaarse antikehaga (1:200 Cell signaling Tech #4417) toatemperatuuril 1 tund, millele järgnes vastuvärvimine 300 nmol/L DAPI(4'6-diamidino-2-phenyl) -indool, divesinikkloriid, Invitrogen) 3 minutit. Immunofluorestsentssignaalid visualiseeriti Zeiss LSM{23}}Airy konfokaalse mikroskoobi all. kolm looma ja kolm pildi väliala (200 ×) valiti juhuslikult. F4/80 positiivsed signaalid kvantifitseeriti ImageJ / Fiji tarkvara abil ja arvutati positiivsete signaalide ja DAPI suhtena.

2.11. Rakukultuur

Roti glomerulaarseid endoteelirakke (GEC) (DSMZ ACC262, Saksamaa) kasvatati RPMI1640 (Gibco 21870-076) söötmes, mis sisaldas 10 protsenti veise loote seerumit ja 2 m ML-glutamiini (Gibco 25030-082), penitsilliini ja streptomütsiini. (50 mg/l, Gibco 15140-122). Rakke hoiti temperatuuril 37 kraadi 5% CO2-sisaldusega niisutatud atmosfääris. Hüpoksiakatsetes inkubeeriti rakke HBSS-s (Gibco 14025-092) seerumivaba söötme asemel 1% hapnikuga kambris temperatuuril 37 °C 2 tundi. Rakke inkubeeriti 30 minutit enne hüpoksiat nitritiga (10 μM) koos ksantiinoksidoreduktaasi (XOR) inhibiitori febuksostaadiga (100 nM) või ilma. Rakkude elujõulisust hinnati PrestoBlue⑧ testiga (Invitrogen, A13261 ja A13262) ning rakkude suremust hinnati Trypaan Blue väljajätmistestiga (Sigma, T8154-20 ML).

2.12. Mitokondriaalse ROS-i tuvastamine

Mitokondriaalse superoksiidi tasemed tuvastati fluorogeense värvainega (MitoSOXTM, Invitrogen M36008). Pärast töötlemist inkubeeriti endoteelirakke 10 minutit 2 μmol / l MitoSoxiga söötmes 37 kraadi juures. Seejärel pesti rakke kaks korda 1 × HBSS-ga ja mõõdeti fluorestsentssignaal (SpectraMax iD3 lugeja, Molecular Devices, USA) ja normaliseeriti rakkude elujõulisusele.

2.13. Immunoblotanalüüs

Külmutatud neeruproovid või endoteelirakud lüüsiti puhvris, mis sisaldas 10 mmol/L Tris-HCl pH 8, 150 mmol/L NaCl, 5 mmol/L EDTA, 60 mmol/L N-oktüülglükosiidi, 1 protsenti Triton X{{9 }}, proteaasi inhibiitorite kokteil ja proteaasi fosfataasi inhibiitorid. Raku- või koelüsaate tsentrifuugiti 5 minutit 10,000 × g juures 4 kraadi juures. Supernatandid/valgud kanti üle uutesse katsutitesse ja kvantifitseeriti Bio-Radi abil.

valgu analüüs. Samaväärses koguses valke sisaldavaid valguekstrakte analüüsiti, kasutades {{0}} protsenti naatriumdodetsüülsulfaat-polüakrüülamiidi geelelektroforeesi (SDS-PAGE). Valgud kanti immobilon-polüvinülideendifluoriidmembraanile 1 tunniks 300 mA juures. Membraanid blokeeriti 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 150 mM NaCl ja 0,1 protsendi Tween 20 (TBS-T), mis sisaldas 5 protsenti rasvavaba. piimapulber 1 tund ja immuuntuvastatud TFAM-i (1:2000, ab131607), anti-OXPHOS-i (1:1000, ab110413), vinkuliinivastase (1:5000, ab129002) (Abcam Cambridge, UK) ja anti-antikehadega -Lõhustatud kaspaas-3 (1:1000, #9664) (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA). Kõik immunoblotanalüüsi sekundaarsed antikehad pärinesid ettevõttest Cell Signaling Technology. Western blot'ide puhul kuvatakse täiendavas failis kärpimata, märkustega täispikad MW-markeritega kujutised.

2.14. Statistiline analüüs

Rühmade vahelisi võrdlusi analüüsiti ühe- või kahesuunalise ANOVA abil, millele järgnes soovitatav post-hoc test. Andmed on esitatud kui keskmine ± SEM. Kõik statistilised arvutused tehti Graphpad Prism 8 abil.0. Statistiline olulisus määrati p<>