1. osa: neerude Hsa-miR-127-3p alareguleerimine aitab kaasa I tüüpi interferooni signaaliraja üleaktiveerimisele luupusnefriidi neerudes

Lisateabe saamiseks. kontaktitina.xiang@wecistanche.com

MikroRNA-d osalevad süsteemse erütematoosluupuse (SLE) patogeneesis ja on düsreguleeritud.neerudluupusnefriidi (LN) patsientidel, kuid nende patogeensed rollid LN-is on suures osas teadmata. Janus kinaas 1 (JAK1) vahendab paljude allavoolu signaaliradade aktiveerimistpõletikulinetsütokiinid, sealhulgas I tüüpi interferooni (IFN-I) signaalirada, mis on kriitilise tähtsusega SLE ja LN arengus. Seega on JAK1 nende jaoks tugev terapeutiline sihtmärkautoimmuunhaigused. Siiski on vähe uuringuid, mis näitavad JAK1 düsregulatsiooni autoimmuunhaiguste korral ja selle taga olevat molekulaarset mehhanismi. Selles kokkuvõtlikus aruandes näitame hsa-miR-127-3p, mikroRNA, mis on LN-ga patsientide neerukudedes allareguleeritud, inhibeerivat toimet IFN-I signaaliülekandele. Leidsime, et hsa-miR-127-3p üleekspressioon võib pärssida ISRE ja GAS vahendatud geeniekspressiooni indutseerimist, STAT1 ja STAT2 fosforüülimist ning IFN-I poolt stimuleeritud IFN-ga stimuleeritud geenide (ISG) ülesreguleerimist. Kuigi hsa-miR-127-3p antagonist võimendas IFN-I signaaliülekande aktiveerimist primaarsetes neeru mesangiaalrakkudes. Seejärel tuvastasime JAK1 hsa-miR-127-3p heauskse sihtgeenina ja näitasime hsa-miR-127-3p-le suunatud JAK1 seondumist selle 3'UTR-i ja kodeeriva piirkonnaga. Järjekindlalt leidsime, et hsa-miR-127-3p allareguleerimine oli seotud JAK1 ja ISG-de ülesreguleerimisega LN-patsientide neerukudedes. Meie andmed näitavad, et hsa-miR-127-3p neerude alareguleerimine aitab kaasa IFN-I signaaliraja üleaktiveerimisele LN-ga patsientide neerudes, soodustades JAK1 ekspressiooni, mis viitab hsa-miR-127-3p matkimisele. võib kasutada JAK1 ja IFN-I signaaliraja pärssimiseks LN-s.

Märksõnad: mikroRNA, hsa-miR-127-3p, I tüüpi interferoon, Januse kinaas 1, süsteemne erütematoosluupus, luupusnefriit
Lisatud teave:

Akadeemilises ringkonnas olemasolevate uurimisandmete põhjal võib arvata, et traditsioonilise hiina meditsiini immuunregulatoorset ja lahtistavat funktsiooniCistancheon suur kliiniline tähtsus organismi immuunsuse tugevdamisel ja COVID-iga patsientide taastumisel-19. Cistanche reguleerib immuunfunktsiooni peamiselt järgmiste punktide kaudu:

Tõhustada organismi immuunrakkude (makrofaagid, dendriitrakud, T-rakud, B-rakud, looduslikud tapjarakud (NK-rakud) jne) funktsionaalset aktiivsust;

Tõhustada immuunrakkude antigeenide töötlemist, fagotsütoosi ja tapmisfunktsioone; reguleerida tsütokiinide ja antikehade sekretsiooni immuunrakkude poolt;

Mõned teadlased on Cistanche kohta uurinudpolüsahhariididvaktsiini adjuvandina ja leidis, et Cistanche polüsahhariidid võivad parandada gripiviiruse vaktsiini humoraalse immuunvastuse rakulist immuunvastust, mis näitab, et Cistanche polüsahhariidid võivad parandada organismiimmuunfunktsioon; Eksperdid on kinnitanud, et sellel on positiivne mõju ka immuunregulatsioonile.

Tistanche juure ja ekstrakti kohta lisateabe saamiseks klõpsake nuppu

SISSEJUHATUS

Teatud põletikulise tsütokineesi sobimatu ja ülemäärane tootmine, mis on süsteemse erütematoosluupuse (SLE) tekkeks kriitiline. Nende patogeensete tsütokiinide allavoolu signaaliradade aktiveerimise blokeerimine võib olla SLE (1) paljulubav terapeutiline strateegia. Selle arusaama kohaselt on antifrolumaab, I tüüpi interferooni (IFN-I) retseptori 1. alaühiku (IFNARl) vastane monoklonaalne antikeha, osutunud paljulubavaks SLE ravis, blokeerides IFN-I signaaliraja aktiveerimise (2). , mis on kriitiline SLE ja luupusnefriidi (LN) patogeneesis (3).

Januse kinaasid (JAK) on türosiinkinaasid, mis seonduvad tsütokiini retseptorite rakusiseste domeenidega ja edastavad aktiveerimissignaali signaaliülekande fosforüülimise ja transkriptsiooni (STAT) transkriptsioonifaktorite (TF) aktivaatori kaudu. JAK-STAT signaaliülekande rada kasutavad paljud tsütokiinid, nagu IFN-I, IL6 ja IL10, mis on seotud autoimmuunhaiguste, sealhulgas SLE patogeneesiga. Autoimmuunhaiguste raviks on välja töötatud väikese molekuliga JAK inhibiitorid, mis on võimelised samaaegselt inhibeerima mitut tsütokiini signaaliülekande rada. Võrreldes esimese põlvkonna pan-JAK inhibiitoritega näitavad hiljutised uuringud, et väga selektiivsed JAKI inhibiitorid võivad saavutada rahuldava terapeutilise efektiivsuse ka mitmete autoimmuunhaiguste korral, millel on väiksem kõrvaltoimete oht (4,5), mis näitab JAK1 olulist rolli autoimmuunhaiguste areng. Siiski on vähem uuringuid keskendunud JAK1 reguleerimisele autoimmuunhaiguste, näiteks SLE või LN-i tekke ajal.

MicroRNA (miRNA) on väikeste mittekodeerivate RNA-de tüüp. Oma seemnepiirkonna komplementaarse aluspaarimise teel 3'UTR-i või sihtmärk-mRNA kodeeriva piirkonnaga tunnevad miRNA-d ära ja pärsivad oma sihtgeenide ekspressiooni ning reguleerivad seetõttu erinevaid bioloogilisi funktsioone (6). MiRNA-sid on tunnistatud immuunvastuste kriitilisteks regulaatoriteks ja miRNA-de düsregulatsioon on seotud SLE patogeneesiga (7). Meie varasemad neerude miRNA profiilid avastasid LN-ga patsientide neerukudedes palju düsreguleeritud miRNA-sid (8). Nende düsreguleeritud miRNA-de funktsioonid on aga suures osas teadmata.

Siin skriinisime LN-patsientide neerudes 9 konserveerunud allareguleeritud miRNA-d nende regulatiivse rolli osas IFN-I signaalirajas ja tuvastasime hsa-miR-127-3p IFN-I signaaliraja negatiivse regulaatorina ja kinnitas seda rolli neeru mesangiaalrakkudes. Tõestasime, et JAK1 on hsa-miR-127-3p heauskne sihtmärk. Meie andmed viitavad sellele, et hsa-miR-127-3p allareguleerimine aitab kaasa IFN-I signaaliraja üleaktiveerimisele LN-ga patsientide neerukudedes ning hsa-miR-127-3p jäljendid võivad olla JAKl alternatiiviks. inhibiitor LN-i ravis.

MATERJALID JA MEETODID

Reaktiivid

Universaalne I tüüpi interferoon pärines ettevõttest R&D Systems (kat. 11200-1). miRNA jäljendid, miimikakontrollid ja mutantsed hsa-miR-127-3p (5'UgccuagCGUCUGAGCUUGGCU3') pärinesid ettevõttest Gene-

Pharma.Hsa-miR-127-3p antagomir pärines ettevõttest ReboBio. Plasmiidide üksikasjad on järgmised:

pISRE- ja pGAS-lutsiferaasi reporterplasmiidid pärinesid firmast Clontech Laboratories. psiCHECK2 ja pRL-TK vektorid olid firmalt Promega Biotech. ja pcDNA3.1 vektorid olid firmalt Invitrogen.

psiCHECK{0}}JAK1-3'UTR reporterplasmiidi konstrueerimiseks kasutati inimese JAK1 3'UTR fragmenti (mis sisaldas ennustatud hsa-miR-127-3p seondumiskohta) amplifitseeriti standardsete PCR meetodite abil (praimerid on loetletud tabelis S1) ja seejärel sisestati psiCHECK2 vektorisse.

psiCHECK2-JAK1-3'UTR-mutantse reporterplasmiidi konstrueerimiseks kasutati psiCHECK2-JAK-i ennustatud hsa-miR-127-3p sidumissaiti (5'GATCTGA3') 1-3'UTR reporterplasmiid muteeriti (5'CTAGACT3'), kasutades KOD-Plus-Mutagenesis Kit (TOYOBO) (praimerid on loetletud tabelis S1).

pcDNA3.{1}}JAKlt plasmiidi konstrueerimiseks amplifitseeriti inimese JAK1 kodeeriva piirkonna fragment (mis sisaldas ennustatud hsa-miR-127-3p sidumissaite), kasutades standardseid PCR tehnikaid (praimerid on loetletud tabelis S1) ja seejärel sisestati pcDNA3.1( pluss )-5'HA vektorisse.

pcDNA3.{1}}JAKlt-mutantse plasmiidi konstrueerimiseks muteeriti pcDNA3.1-JAKlt plasmiidi ennustatud hsa-miR-127-3p sidumissaidid (5tcgAtcGgaGcctcaaga aggAtcTggt3') 'tcgTtcCgaCcctcaagaaggTtcAggt3), kasutades KOD-Plus-Mutagenesis Kit (TOYOBO) (praimerid on loetletud tabelis S1).

Kõik plasmiidid kontrolliti sekveneerimisega.

Rakukultuur

Hela rakud, HepG2 rakud ja K562 rakud olid pärit rakupangast, Shanghai bioloogiateaduste instituutidest, Shanghai, Hiina. Muteeritud JAK1(9)-ga U4A rakud kinkis Y.Eugene Chin Soochowi ülikoolist. Kleepuvaid rakke (Hela, HepG2 ja U4A) kultiveeriti DMEM-is (Gibco), millele oli lisatud 10 protsenti FBS-i (Gibco) ja 100 ug/ml penitsilliini-streptomütsiini (Gibco). Suspensioonirakke (K562) kultiveeriti RPMI 1640-s (Gibco) koos 10% FBS-i (Gibco) ja 100 ug/ml penitsilliini-streptomütsiini (Gibco). Inimese primaarsed neeru mesangiaalrakud (HRMC-d) (kat. 4200, ScienCellTM Research Laboratories) kultiveeriti Mesangial Cell Mediumis (Cat.4201, ScienCellTM Research Laboratories) vastavalt tootja juhistele. Kõiki rakke hoiti 37 kraadi juures 5% CO2 atmosfääris.

Transfektsioon ja stimulatsioon

Lutsiferaasi reportertesti jaoks külvati Hela rakud või HRMC-d 96-süvendiga plaadile ja transfekteeriti ISRE- või GAS-lutsiferaasi reporteriga (100 ng süvendi kohta), pRL-TK plasmiidiga (10 ng süvendi kohta) koos näidatud miRNA jäljendajatega. (100 nM) või antagomiire (500 nM), kasutades Lipofectamine 2000 (Invitrogen). 12 tundi hiljem stimuleeriti transfekteeritud rakke Universal I tüüpi interferooniga (1000 U/ml) 8 tundi enne mõõtmist.

Hsa-miR-127-3p sihtsaitide kontrollimiseks JAK1 mRNA 3'UTR-is külvati Hela rakud 96-süvendiga plaadile ja transfekteeriti psiCHECK2-JAK1-3-ga. 'UTR(või psiCHECK2-JAK1-3'UTR-mutant või psiCHECK2) plasmiidid (20 ng/süvend) koos näidatud miRNA jäljendajatega (100 nM), kasutades

Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Transfekteeritud rakke kultiveeriti 24 tundi enne mõõtmist.

Lutsiferaasi aktiivsust mõõdeti Dual-Luciferase Reporter Assay Systemiga (Promega Biotech) vastavalt juhistele.

Hsa-miR-127-3p sihtsaitide kontrollimiseks JAK1 mRNA kodeerivas piirkonnas külvati U4A rakud 6-süvendiga plaadile ja transfekteeriti pcDNA3.1-JAKlt (või pcDNA3. 1-JAK1t-mutant) plasmiidid (lug/süvend) koos näidatud miRNA jäljendajatega (100 nM), kasutades Lipofectamine 2000 (Invitrogen).

Muudel eesmärkidel transfekteeriti Hela rakke või HRMC-sid miRNA jäljendajatega (100 nM) või antagomiiridega (500 nM), kasutades Lipofectamine RNAiMaxi (Invitrogen). 24 tundi hiljem stimuleeriti transfekteeritud rakke Universal I tüüpi interferooniga (1000 U/ml) 6 tundi. (mRNA kvantifitseerimiseks või mikrokiibi jaoks) või 10 minutit või 15 minutit (Western blot jaoks).

Geeniekspressiooni kvantifitseerimine

Kogu RNA ekstraheeriti TRIzol reagendiga (Invitrogen). cDNA sünteesiti PrimeScript RT reaktiivikomplekti (Takara) abil. Geeniekspressioon määrati SYBR Premix ExTaq komplekti (Takara) abil. RPL13a kasutati mRNA kvantifitseerimise võrdlusgeenina. Hsa-miR-127-3p ekspressioon määrati TaqMan MicroRNA Assay komplekti (Applied Biosystems) abil. RNU48 kasutati miRNA kvantifitseerimise võrdlusgeenina. Amplifikatsioon viidi läbi ABI vii7 reaalajalise PCR süsteemiga (Applied Biosystems). Suhteline avaldis arvutati 2-meetodi abil. Induktsioonivolt arvutati proovi geeni suhtelise ekspressiooni jagamisel eksperimentaalsetes rühmades (miRNA jäljendajad või IFN-I stimulatsiooniga antagomiir-transfektsiooni rühmad) stimuleerimata kontrollproovi sama geeni suhtelise ekspressiooniga (transfektsioon puudub, ei IFN-I stimulatsioon). Praimerid on loetletud tabelis S2.

Western Blot

Kasutati täisrakulüsaate. Valgud eraldati 10% SDS-PAGE abil, kanti elektriliselt PVDF membraanidele (EMD Millipore) ja sondeeriti näidatud antikehadega. Ribad visualiseeriti Pierce ECL Western Blotting Substrate'iga (Thermo ScientificTM). Teave antikehade kohta oli tabelis S3.

Mikrokiip

Kogu RNA ekstraheeriti TRIzol reagendiga (Invitrogen) proovidest, mis on näidatud jaotises TULEMUSED ja allutati mikrokiibi analüüsile. Kõik mikrokiibi katsed viidi läbi, kasutades Shanghai Biotechnology Corporationi massiivi Affymetrix U133 plus 2.{2}}. Lühidalt, kogu RNA-d kontrolliti RIN-numbri osas, et kontrollida RNA terviklikkust seadmega Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Kvalifitseeritud kogu RNA-d puhastati täiendavalt RNeasy mikrokomplektiga (Cat # 74004, QIAGEN, GmBH, Saksamaa) ja RNaasivaba DNaasi komplektiga (Cat # 79254, QIAGEN, GmBH, Saksamaa). Seejärel amplifitseeriti, märgistati ja puhastati RNA proovid GeneChip 3'IVT Express Kitiga (Cat#901229, Affymetrix, Santa Clara, CA, USA), järgides tootja juhiseid biotiiniga märgistatud cRNA saamiseks. Massiivi hübridiseerimine ja pesemine viidi läbi, kasutades hübridisatsioonis GeneChip① Hybridization, Wash and Stain Kit (Cat#900720, Affymetrix, Santa Clara, CA, USA).

Ahi 645 (Cat#00-0331-220V, Affymetrix, Santa Clara, CA, USA) ja Fluidics Station 450(Cat#00-0079, Affymetrix, Santa Clara, CA, USA) järgisid tootja juhised. Slaidid skaneeriti GeneChipScanner 3000(Cat#00-00212, Affymetrix, Santa Clara, CA, USA) ja Command Console Software 3.1 (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA) abil vaikeseadetega. Algandmed normaliseeriti MAS5.0 algoritmiga ja imporditi programmi Gene Spring Software 11.0 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Diferentsiaalselt ekspresseeritud geenide saamiseks kohandatud P-väärtusega 2007 kasutati paaritu testanalüüsi Benjamini-Hochbergi korrektsiooniga.<0.05. overlapping="" differentially="" expressed="" genes="" in="" ifn-α="" treated="" hela="" cells(upregulated="" or="" downregulated="" by="" 1.5-fold)="" between="" different="" comparison="" pairs="" (hsa-mir-127-3p="" mimics="" vs="" mock,="" hsa-mir-127-3p="" mimics="" vs="" negative="" control="" mimics,="" and="" hsa-mir-127-3p="" mimics="" vs="" hsa-mir-127-3p="" mutant="" mimics)="" were="" calculated.="" all="" the="" hsa-mir-127-3p="" inhibited="" genes="" were="" retrieved="" and="" subjected="" to="" the="" enrichment="" analysis="" of="" the="" cis-regulatory="" motifs="" at="" the="" upstream="" of="" these="" genes="" using="" the="" iregulon="" plugin="" on="" the="" cytoscape="" platform(10).="" the="" effect="" of="" hsa-mir-127-3p="" on="" the="" induction="" of="" the="" interferon-stimulated="" genes="" (isgs)from="" a21-gene="" ifnsignature="" (8)by="" ifn-α="" in="" hela="" cells="" was="" also="">

Ago2 siduv RNA immunosadestamine Hela rakud külvati 10 cm tassile ja transfekteeriti hsa-miR-127-3p või hsa-miR-127-3p mutandiga kontsentratsioonis 100 nM. Transfekteeritud rakke kultiveeriti üleöö. Seejärel pesti rakke külmas PBS-is ja kaabiti. Immunosadestamine töödeldi EZ-Magna RIPRNA-siduva valgu immunosadestamise komplektiga (Cat.{9}}, Millipore) ja RIPAb pluss Ago2 (kat. 03-110, Millipore). 10 protsenti kogu lüsaadist kasutati sisend ja ülejäänud 90 protsenti kogu lüsaadist kasutati immunosadestamiseks. Iga rühma RNA proove kasutati komplementaarse DNA sünteesimiseks PrimeScript RT reaktiivikomplektiga (Takara). JAK1 ekspressioon kvantifitseeriti SYBR Premix ExTag komplekti (Takara) abil. Hsa-miR-127-3p ekspressioon määrati TaqMan MicroRNA Assay komplekti (Applied Biosystems) abil. Amplifikatsioon viidi läbi ABI vii7 reaalajalise PCR süsteemiga (Applied Biosystems). Praimeri järjestused on toodud tabelis S2.

Neeruproovid

Neeru biopsiad (n=14) saadi Shanghai Ren Ji haigla biopangast. Kõigilt patsientidelt saadi kirjalik teadlik nõusolek. Uuringu kiitis heaks Shanghai Ren Ji haigla teaduseetika nõukogu. Kõik LN-ga patsiendid (klass IV-V) vastasid American College of Rheumatology kriteeriumidele LN(11) jaoks. Normaalse kontrollrühma (n=11) proovid pärinesid neeruvähiga patsientide (I-II staadium) normaalsetest parakartsinoomi neerukudedest, kellel ei olnud anamneesis autoimmuunhaigusi. Kliinilist teavet kõigi teemade kohta kirjeldati meie eelmises artiklis (8).

Statistika

Andmeid analüüsiti ja joonistati GraphPad Prismiga (versioon 6.{5}}2). Kahe või enama sõltumatu rühma võrdlemiseks kasutati Mann-Whitney U-testi ja ühesuunalist dispersioonanalüüsi (ANOVA). Korrelatsiooniuuringuteks kasutati Spearmani korrelatsioonitesti. P väärtused alla 0,05 loeti statistiliselt oluliseks.