Oksüdatiivne stress on erinevate metaboolsete haiguste üks olulisi eelkäijaid 2. osa

Palun võtke ühendustoscar.xiao@wecistanche.comrohkem informatsiooni

3. Arutelu

Vabad radikaalid võivad elektroni hankimiseks rünnata valke, lipiide või DNA-d, mille tulemuseks on mitmesugused terviseprobleemid. Sel põhjusel on oluline tasakaalustada keha antioksüdantide süsteemi ja oksüdatsioonil tekkivaid vabu radikaale. Selle tasakaalu halvenemisel tekib oksüdatiivne stress [29]. Oksüdatiivne stress on üks peamisi tegureid, mis põhjustavad mitmesuguseid kroonilisi häireid, nagu vähk, diabeet, südame-veresoonkonna haigused, Alzheimeri tõbi jne. Kuigi inimkehas on olemas antioksüdantsed süsteemid, mis võitlevad kudede ja elundite oksüdatiivsete kahjustustega, on need kaitsemehhanismid süsteemid võivad kaotada oma tõhususe erinevate tingimuste tõttu, nagu alkoholi liigtarbimine, suitsetamine, stress, krooniline narkootikumide tarvitamine, kiirgus jne [30]. Erinevad teaduslikud aruanded on näidanud, et sekundaarsed taimsed metaboliidid mängivad olulist rolli oksüdatiivse stressi ja selle kahjulike mõjude ennetamisel [13,14,31]Kuigi biosaadavus on oluline parameeter, mis mõjutab nende ühendite bioaktiivsust, ei ole seda arvesse võetud. enamik uuringuid. Siiski on hästi teada, et sekundaarsed metaboliidid alluvad struktuurimuutustele erinevate pH-tingimuste, ensümaatilise aktiivsuse ja kehatemperatuuri tõttu seedetraktis. Lisaks on sekundaarsete metaboliitide keemilised omadused, nagu molekulmass, polaarsus ja seostumisaste taimemaatriksi makromolekulidega, samuti olulised tegurid, mis mõjutavad nende biosaadavust [13]. Seega on ühendite või nende metaboliitide imendumine vereringesse pärast allaneelamist nende süsteemse füsioloogilise toime avaldamiseks hädavajalik. In vitro seedimise simulatsioonimudelid võivad anda tõendeid ainete võimalike biosaadavuse omaduste hindamiseks. Kuigi mis tahes funktsionaalse omaduse kinnitamiseks on vajalik kinnitus inimkatsetes, kasutatakse in vitro simulatsioonimudeleid laialdaselt alternatiivina in vivo uuringutele või inimkatsetele, mis on sageli eetiliselt vaieldavad, ressursimahukad, kallid ja aeganõudvad [32].

Lisateabe saamiseks klõpsake siin

Mitmed teadlased on uurinud ka Cistus liigi erinevatest organitest valmistatud ekstraktide antioksüdantset potentsiaali. Kirjanduse uuringu kohaselt on see esimene uuring Cistus liikide kohta fenoolsete ainete biosaadavuse ja nende mõju kohta antioksüdantsele aktiivsusele, kasutades in vitro seedimise simulatsioonimudelit. Karas et al. [33] väitsid, et 10 protsenti polüfenoolsetest komponentidest jääb taimses maatriksis seedimata ja 90 protsenti neist seeditakse mao- või soolefaasis (vastavalt ligikaudu 48 protsenti ja 52 protsenti). Nagu varem mainitud, mõjutas inimese in vitro seedimise simulatsiooniprotseduur negatiivselt kõiki fenoolikoguseid vesiekstraktides. Seega tuvastati kõigi ekstraktide biosaadavate proovide fenoolisisalduses märkimisväärne kadu. Lisaks olid IN proovide proantotsüanidiini üldkontsentratsioonid kõigis vesiekstraktides allpool tuvastamispiiri. Erinevad uuringud ajendasid ka seedimisprotseduuri negatiivset mõju taimeekstraktides sisalduvatele fenoolsetele ühenditele ja sellega seotud bioaktiivsusele. Näiteks teatasime Salvia virgata Jacqi kogu fenoolisisaldusest. Lisaks sellele kippusid ekstrakti peamiste metaboliitide, st rutiini ja rosmariinhappe, kogused vähenema [13]. Seevastu mitmed uuringud on andnud vastuolulisi tulemusi. Celeb jt uuringus. [34] täheldasid nad Hypericum perfoliatum L metanooliekstrakti biosaadavates proovides fenoolhappe, flavonoidide ja fenooli üldkoguste suurenemist. Tegelikult oli peamiste metaboliitide, kvertsitriini, klorogeen- ja gallushappe biosaadavuse suhe üle 100 protsenti . Need uuringud näitasid, et seedimisprotseduuri mõjud võivad olenevalt taimsetest materjalidest erineda. Nende erinevuste selgitamiseks on oluline arvestada seedesüsteemi toimemehhanismiga fenoolsetele ainetele. (bioflavonoidide eelised) Serra jt.[35] viitas sellele, et fenoolseid ühendeid leidub peamiselt glükosiidides, polümeerides ja estrivormides taimemaatriksis ning hüdrolüüsitakse seedesüsteemis enne imendumist. Erinevad tegurid võivad mõjutada fenoolsete ühendite struktuurseid muutusi seedetraktis. Näiteks suurema molekulmassiga ühendeid, nagu proantotsüanidiinid või protsüanidiinid, tuleb enne soolestikus imendumist hüdrolüüsida. Taimemaatriksi struktuur on ka fenoolide biosaadavuse oluline tegur; (osta cistanche)fenoolsed ühendid võivad seostuda taimemaatriksis makromolekulidega, nagu kiud, valgud ja lipiidimolekulid. Seega võivad ainult maatriksist vabanenud fenoolsed komponendid muutuda seedetraktist imenduvaks. Veelgi enam, soolestiku mikrobiota erinevad pH väärtused ja ensümaatilised toimed on muude oluliste tegurite hulgas, mis mõjutavad fenoolsete ühendite keemilise struktuuri muutumist [36]. Nende andmete valguses võime oletada, et sarnast tüüpi eksperimentaalsetest uuringutest saadud erinevad tulemused võivad olla tingitud seedimissüsteemi keerukusest ja taimse maatriksi koostisest. Nagu on näidatud tabelis 3, näitasid Cistus ekstraktide biosaadavad proovid nende madalama fenoolisisalduse tõttu nõrgemat antioksüdantset aktiivsust kui seedimata ja maojärgsetel analoogidel.

Cistanchesaabparandada immuunsust

Lisaks näitasid mõlemad C. salufoliuse ekstraktid DPPH, CUPRAC, FRAP ja TOAC testides paremat antioksüdantset aktiivsust võrreldes teiste liikidega. Lisaks näitasid mõlemad C. paroiforuse ekstraktid kõrgemat DMPD radikaale püüdvat aktiivsust kui teiste liikide ekstraktid. Nagu on näidatud tabelis 1, on fenoolide, flavonoidide,cistanche bienfaitsC. salviifolius'e fenoolhappe sisaldus oli kõrgem kui teistes proovides. Seega võib C. salviifoliuse ekstraktide kõrgem antioksüdantne potentsiaal olla seotud selle fenoolisisaldusega.

Lisaks võib biosaadavate proovide antioksüdantide potentsiaalide, süsivesikutega seotud ensüümide inhibeeriva toime ja AGE-de vähenemine olla seotud flavonoidglükosiidide markeride vähenemisega. Kuid Cistus ekstraktid sisaldasid ka muid fenoolseid aineid, nagu on näidatud joonisel 1. Seetõttu on vaja ekstraktide üksikasjalikku kromatograafilist analüüsi, et jälgida seedimise mõju bioloogilisele aktiivsusele.

Taimeekstraktide seedeensüüme inhibeeriv potentsiaal on viimasel ajal sünteetiliste inhibiitorite ohutuse tõttu rohkem tähelepanu äratanud. Seetõttu määrati mitmetes uuringutes taimeekstraktide pärssiv toime ja seda toimet seostati üldiselt fenoolsete ainetega, nagu flavonoidid, fenoolhapped, proantotsüanidiinid jne. Sun et al. [37] väitsid, et polüfenoolsed ühendid avaldavad oma inhibeerivat toimet, seondudes ülalnimetatud ensüümidega hüdrofoobsete jõudude ja mittekovalentsete sidemete abil. Seetõttu on o-amülaasi ja a-glükosidaasi ensüümi aktiivsuse pärssimine polüfenoolide poolt seotud nende molekulaarstruktuuridega. Kuigi seda interaktsioonimehhanismi on uuritud erinevate tehnikatega, nagu inhibeerimise kineetika, molekulaarne dokkimine, fluorestsentsi kustutamine jne, ei ole veel kindlat järeldust tehtud [38]. Paljud uuringud on aga teatanud, et taimeekstraktide seedeensüümide pärssimine on otseselt seotud nende fenoolisisaldusega. Sarnaseid uuringuid Cistus liikide ensüümi inhibeeriva toime kohta on samuti varem kirjeldatud. Sayah et al. [39] uuris C. monspeliensis'e ja C. saluifoliuse 8{{10}} protsendi metanooli- ja vesiekstraktide -amülaasi ja -glükosidaasi inhibeerivat toimet. Nende tulemused olid kooskõlas käesoleva uuringuga, mis näitas, et C. salvifoliuse vesiekstrakt näitas kõrgemat o-glükosidaasi (ICso ug/mL:0.95±0.14) ja -amülaasi (IC5{) {55}} ug/mL: 217,1 ± 0,15) inhibeeriv toime kui C. monspeliensis'e vesiekstraktil (IC50 ug/mL∶ 14,58 ± 1,26) ja （IC50 4 g/mL: 886,10 ± 0,10). Mõlema vesiekstrakti inhibeerimismäärad nendele ensüümidele olid kõrgemad kui võrdlusühend akarboos (ICso ug/mL: 18,01±2.00) Sarnaselt meie uuringuga leiti korrelatsioon ensüümi inhibeerimise määra ja koguväärtusega. fenoolide ja flavonoidide kogused. C. saloijfoliuse vesiekstrakti fenooli- ja flavonoidide üldsisaldus (vastavalt 408,43 ± 1,09 mg GAE ja 140{39}}±1,15 RE) olid kõrgemad kui C. monspeliensise vesiekstraktis (261,76 ± 1,9 mg GAE ja GAE 78.{47}}±1,15 RE vastavalt). Orhan et al. [40] uuris ka C.laurifoliuse lehtede 80-protsendiliste vesi- ja etanooliekstraktide seedeensüüme inhibeerivat potentsiaali. Nende tulemuste kohaselt näitas 80% etanooliekstrakt (71,7% ±0,6) tugevat amülaasi inhibeerivat toimet võrreldes vesiekstraktiga (39,3% ±2,2) kontsentratsioonil 1 mg/ml. Nad väitsid, et fenoolsed ühendid, eriti flavonoidid, mõjutavad otseselt insuliini sekretsiooni, takistades beeta-rakkude apoptoosi ja toetades diabeedivastast toimet. See hüpotees, mis on korrelatsioonis meie tulemustega, näitab, et C. salviifolius'e vesiekstraktide ND proovis oli suurim flavonoidide ja fenoolide kogusisaldus ning suurim amülaasi ja o-glükosidaasi inhibeeriv toime. Nagu on näidatud tabelis 4, avaldas C. salviifoliuse vesiekstrakt seedeensüüme paremini inhibeerivat toimet kui teised ekstraktid. Lisakscistanche kolesteroolVesiekstraktide IN proovid sisaldasid madalamaid fenooli ja flavonoidide koguseid kui ND proovid ja näitasid seega käesolevas töös madalamat ensüümi inhibeerivat aktiivsust. Kuigi seedimisprotseduur mõjutas ekstraktide fenoolisisaldust negatiivselt, oli neil siiski märkimisväärne seedeensüüme inhibeeriv toime. Mitmetes uuringutes teatati, et flavonoidglükosiidid on tugeva amülaasi ja glükosidaasi inhibeeriva potentsiaaliga taimeekstraktide peamised metaboliidid[41-43]Kuigi fenoolsete ühendite seedeensüüme inhibeerivat mehhanismi ei ole veel avaldatud, on struktuur Mõnede fenoolsete komponentide, näiteks flavonoidide, fenoolhapete, proantotsüanidiinide ja tanniinide kohta on läbi viidud aktiivsuse seoste uuringuid. Flavonoidide struktuuri ja aktiivsuse seose uuringud näitasid, et C-tsükli C2=C3 kaksikside suurendab selliste ühendite seedeensüümide inhibeerimispotentsiaali. Kuna see side suurendab elektronide tihedust, suureneb flavonoidi ja ensüümi interaktsiooni tugevus [44]. Lisaks soodustavad C-5 ja C-7 hüdroksüülrühmad flavonoidide amülaasi inhibeerivat potentsiaali. Samuti tehti ettepanek, et flavonoidide skeleti hüdroksüülimine mõjutab positiivselt nende a-amülaasi ja -glükosidaasi ensüümi inhibeerimispotentsiaali[45]. Nagu varem märgitud, olid kõik käesoleva uuringu markerflavonoidid flavonoolglükosiidid, mis kandsid ülalkirjeldatud struktuurseid nõudeid. Kuid pärast in vitro seedimist vähenes nende seotud aktiivsus vesiekstraktide biosaadavates proovides märkimisväärselt.

Üldiselt on taimeekstraktide inhibeeriv potentsiaal AGE-de suhtes seotud mitme faktoriga, st nende fenoolisisaldus, antioksüdantide potentsiaal, metallide kelaatimise võime, valkude interaktsioonid ja AGE-retseptoreid blokeerivad toimed [13]. Nagu on näidatud tabelis 4, näitasid vesiekstraktide biosaadavad proovid madalamat AGE inhibeerivat aktiivsust võrreldes ND proovidega, kuna in vitro seedimine mõjutas negatiivselt ekstraktide fenoolisisaldust. Praeguste uuringutulemuste kohaselt on C. vesiekstrakti ND proov.cistanche ja tongkat ali reddit) saluifoliusel oli kõrgeim AGE inhibeeriv toime ning fenooli- ja flavonoidide üldsisaldus. Võrdluseks näitas C. monspeliensise vesiekstrakti IN proov kõige nõrgemat AGE inhibeerimispotentsiaali, mida võib seostada selle madalaima flavonoidide ja fenoolide üldsisaldusega. Kuna flavonoidid on laialt levinud taimeekstraktides, puuviljades, köögiviljades ja jookides, on mitmed uuringud intensiivistunud flavonoidide inhibeerimispotentsiaali kohta AGE moodustistes. Samad flavonoidid, mis selles uuringus määrati markerfenoolideks, olid ka teistes uuringutes markerühenditena[46-48].

Sarnaselt seedeensüümide inhibeerimisega stimuleeris flavonoidide AGE inhibeerivat aktiivsust C2=C3 kaksikside ning A- ja C-tsüklite hüdroksüülimine. Kuid suhkru kinnitumine flavonoidide luustikule põhjustab inhibeeriva aktiivsuse vähenemist [49]. Teisest küljest Cervantes-Lauren jt.[50] viitas sellele, et glükosiidide flavon{5}} omas suuremat AGE inhibeerimispotentsiaali kui teistel flavonoidglükosiididel. See hüpotees võib olla selgitus AGE inhibeerimise vähenemisele biosaadavates proovides. Näiteks ei tuvastatud kvertsitriini ja hüperosiidi C. monspeliensise vesiekstrakti biosaadavates proovides, mis on C. monspeliensise IN proovide madalama aktiivsuse põhjuseks võrreldes teiste liikide ekstraktidega. Kuigi kvertsitriini C. saloifoliuse vesiekstraktis ei tuvastatud, võib selle kõrge AGE inhibeerimisaktiivsuse põhjuseks olla oluliselt suurem kogus hüperosiidi ja salidrosiidi. Üldiselt täheldati positiivset korrelatsiooni proovide flavonoidide markersisalduse ja nende AGE-de inhibeeriva potentsiaali vahel.

4. Materjal ja meetodid

4.1.Kemikaalid

Kõik katsetes kasutatud viited, ensüümid ja kemikaalid osteti firmalt Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA). Katsetes kasutati analüütilise kvaliteediga materjale.

4.2.Taimeproovid

C.creticuse ja C.saloifoliuse õhust osad koguti Yeditepe ülikooli ülikoolilinnakust (Kayisdagi, Istanbul) 2018. aasta aprilli viimasel nädalal. C.mon-speliensis'e ja C. paroifloruse õhust pärit osad koguti Alacant Kutlu Aktase lähedalt Balaji, Cesme, Izmir 2018. aasta mai teisel nädalal. C. laurifoliuse õhust pärit osad koguti Kemer-Doganhisari maanteelt Konya osariigis 2018. aasta juuni esimesel nädalal. Prof dr Erdem Yesilada autentis taimseid materjale. C. creticuse (YEF18013), C. Lauri foliumi (YEF18017), C. monspeliensise (YEF18015), C. paroifloruse (YEF18016) ja C. salvifoliuse (YEF18014) vautšeri proove hoiti Pharmacognoy Department of Herbariumis. farmaatsia, Yeditepe ülikool, Istanbul, Türgi. 4.3.Ekstraheerimise protseduur

Vesiekstraheerimine valiti, kuna seda kasutatakse traditsioonilises meditsiinis tavaliselt valmistamise tehnikana. Cistus liigi jämedalt õhu käes kuivatatud ja pulbristatud õhust osad (100 g) ekstraheeriti kuuma destilleeritud veega (80 kraadi, 1,5 L) loksutamisseadmega 15 min. Seejärel filtriti vesiekstraktid läbi filterpaberi ja aurustati alandatud rõhul kuivaks. Pärast lüofiliseerimisprotseduuri lõpetamist lahustati ekstraktid destilleeritud vees edasiseks töötlemiseks (lagundamata proov: ND) (ekstraktide saagis: C.creticus 13,04%, C.laurifolus 15,7%, C.monspeliensis 12,8%. 14,94 protsenti C. parviflorus’e puhul, 14,74 protsenti C.salvifolius’e puhul). 4.4. In vitro seedimise simulatsioonimeetod

Inimese seedimise simulatsiooni mudelit rakendati Cistus proovidele in vitro, järgides varem Celeb jt poolt kirjeldatud meetodit.[34] Esmalt lahustati 1 g NaCl ja 1,6 g pepsiini 500 ml destilleeritud vees, et saada simuleeritud maovedeliku lahus (SGF). Hiljem viidi SGF lahuse pH 2-ni HCl-ga (5 M); 17,5 ml sellest lahusest segati 2,5 ml taimeproovidega ja see segu pandi 2 tunniks 37-kraadisesse loksutavasse veevanni, et imiteerida seedesüsteemi peristaltilisi liikumisi. 2 tunni pärast pandi proovid ensümaatiliste reaktsioonide inaktiveerimiseks jäävanni; 2 ml proove jäeti edasisteks katseteks kõrvale "maojärgseks" (PG) prooviks. Külmades proovilahustes paiknes tselluloosdialüüsi membraan, mis oli laetud õige koguse NaHCO3-ga (1 M, pH 7); seega matkiti imendumist seedetraktist. Seejärel ühendati lahustega 4,5 ml sapphapete/pankreatiini lahust ja segu inkubeeriti veel 2 tundi 37 °C juures. Lõpuks saadi dialüüsimembraani sees olev vedelik "biosaadavaks" prooviks (IN). Pärast protseduuri lõppu säilitati kõiki proove -20 kraadi juures edasisteks katseteks. 4.5. Fenoolse profiili in vitro hindamine 4.5.1. Üldfenoolisisalduse analüüs Proovide üldfenoolisisalduse spektrofotomeetriline määramine viidi läbi 96-süvendplaadi matriitsis vastavalt Baraki jt varem kirjeldatud meetodile【32】; 75 uL NagCO3 (20 protsenti H2O-s). ) lisati 20 μL värskelt valmistatud proovi- ja võrdluslahustele. Seejärel ühendati seguga 100 µl Folin-Ciocalteu reaktiivi. Pärast 30-minutilist inkubeerimisperioodi toatemperatuuril pimedas mõõdeti neeldumist lainepikkusel 690 nm. Kalibreerimiskõvera loomiseks kasutati võrdluslahusena erinevates kontsentratsioonides gallushapet ja üldfenoolisisaldust väljendati gallushappe ekvivalentidena (GAE). 4.5.2. Flavonoidide kogusisalduse analüüs Proovide flavonoidide kogusisalduse spektrofotomeetrilist määramist juhiti 96-süvendplaadi mallis vastavalt Bardakci et al. poolt eelnevalt selgitatud meetodile. 【51】; 150 μL 75% etanooli, 10 μL alumiiniumkloriidi ja 10 uL 1 M naatriumatsetaattrihüdraati ühendati eraldi 50 uL proovi- ja võrdluslahustega. Seejärel inkubeeriti neid segusid pimedas toatemperatuuril 30 minutit. Pärast inkubatsiooniperioodi arvutati neeldumine lainepikkusel 405 nm. Kvertsetiini kasutati võrdluslahusena erinevates kontsentratsioonides kalibreerimiskõvera loomiseks ja flavonoidide kogusisaldus esitati kvertsetiini ekvivalentidena (QE).

4.5.3.Fenoolhappe üldsisalduse analüüs

Proovide fenoolhappe üldsisaldust mõõdeti spektrofotomeetriliselt, järgides varem Barak et al. kirjeldatud protseduuri. [52]. Esiteks lahustati Arnowi reaktiivi saamiseks destilleeritud vees õiges koguses naatriumnitritit ja naatriummolübdaati. Seejärel ühendati 1 ml proove eraldi 1 ml Arnow reagendi, 1 ml 0,1 M HCl ja 1 ml 1 M NaOH-ga. Seejärel reguleeriti segu ruumala destilleeritud veega 10 ml-ni ja neelduvus loeti kohe 490 nm juures. Kalibreerimiskõvera saamiseks kasutati võrdluslahusena erinevates kontsentratsioonides kofeiinhapet ja kogu fenoolhappe sisaldus anti kofeiinhappe ekvivalentidena (CAE).

4.5.4. Proantotsüanidiini üldsisalduse analüüs

Proovide proantotsüanidiini kogusisalduse spektrofotomeetriline määramine viidi läbi 96-kaevuplaadi mallis, järgides Baraki jt meetodit. [11]. Lühidalt, 25 uL proovilahuseid segati vastavalt 150 uL 4% vanilliini ja 75 uL HCl lahusega (32%). Pärast 15-minutilist inkubeerimist pimedas toatemperatuuril reguleeriti neeldumine 492 nm-ni. Kalibreerimiskõvera saamiseks kasutati võrdluslahusena erinevates kontsentratsioonides katehhiinhüdraati. Kontrolllahusena kasutati metanooli. Proantotsüanidiini kogusisaldus proovides märgiti katehhiini ekvivalentidena (CE).

4.6. Vabade radikaalide eemaldamise aktiivsuse testid 4.6.1. DPPH radikaali püüdmise aktiivsuse test

Proovide DPPH radikaale püüdev aktiivsus määrati 96-süvendplaadi mallis Celeb jt poolt modifitseeritud meetodil.[53] Alguses valmistati värskelt 150 uM DPPH lahust. Seejärel segati 200 μL DPPH lahust 25 uL proovilahustega. Seejärel inkubeeriti seda segu 50 minutit pimedas toatemperatuuril. Neelduvus arvutati lainepikkusel 540 nm. Võrdluslahusena kasutati butüülhüdroksütolueeni (BHT) erinevates kontsentratsioonides. Kontrolllahusena kasutati metanooli. Proovide aktiivsus esitati kui EC50, mis vastab kontsentratsioonile, mis näitab 50% aktiivsust.

4.6.2.DMPD radikaali eemaldamise aktiivsuse test

Proovide DMPD* (N,N-dimetüül-p-fenüleendiamiin) radikaali püüdev aktiivsus viidi läbi 96-süvendplaadi matriitsis vastavalt meetodile, mida on varem kirjeldanud Inan et al. [13]. Esiteks, 10{{10}} mM DMPD pluss lahus, 0,05 M FeCl; 6H2O lahus ja 0,01 M atsetaatpuhver valmistati värskelt. Seejärel segati 1 ml DMPD lahust, 100 ml atsetaatpuhvrit ja 0,2 ml FeCl3-6H2O lahust ning hiljem ühendati 15 uLof proovilahust 210 µL selle seguga. Pärast 50-minutilist inkubeerimisperioodi pimedas toatemperatuuril mõõdeti neeldumist lainepikkusel 492 nm. Troloxi kasutati võrdluslahusena erinevatel kontsentratsioonidel, et saada kalibreerimiskõver. Proovilahuste kontsentratsioonid olid 1 mg/ml. Proovide DMPD radikaalide eemaldamise aktiivsus märgiti Troloxi ekvivalentidena (TE). 4.7.Metalli redutseeriva aktiivsuse testid

4.7.1. Raudmetalli redutseeriva antioksüdandi võimsuse test (FRAP)

Proovide FRAP aktiivsuse määramine viidi läbi 96 süvendiga plaadi mallis, järgides Bardakci jt varem kirjeldatud protseduuri [54]. Katse alguses moodustati FRAP reaktiiv atsetaatpuhvri, raudtripüridüültriasiini ja FeCl;6H2O lahuste segamisel. Pärast seda pandi FRAP-reagent 30 minutiks 37-kraadisesse ahju. Seejärel ühendati 10 uL proovilahuseid vastavalt 30 μL destilleeritud vee ja 260 uL FRAP reagendiga. Pärast inkubeerimist 37 kraadi juures 30 minutit reguleeriti neeldumine 593 nm-ni. Standardkõver koostati, kasutades tulemuste hindamiseks raudsulfaadi (025-2 mM) erinevat molaarsust. BHT-d kasutati võrdluslahusena erinevates kontsentratsioonides. Proovide FRAP aktiivsused esitati mM FeSO4-na 1 g kuivekstraktis.

4.7.2. Vaski vähendava antioksüdantide mahu test (CUPRAC)

Proovide CUPRAC-i aktiivsus määrati 96-kaevuplaadi mallis Celeb et al. modifitseeritud meetodil. 【31】; 43 uL proovilahustele lisati eraldi 85 μL CuSO4 (10 mM), neokupriini ja ammooniumatsetaadi lahuseid ning 51 uL destilleeritud vett. Pärast inkubatsiooniperioodi (20 minutit) 50 kraadi juures veevannis mõõdeti neeldumist lainepikkusel 450 nm. Askorbiinhapet kasutati võrdluslahusena erinevates kontsentratsioonides, et saada kalibreerimiskõver. Proovide CUPRAC-i aktiivsused esitati askorbiinhappe ekvivalentidena (AAE). 4.8. Kogu antioksüdandi aktiivsuse test (TOAC)

Proovide kogu antioksüdantse aktiivsuse määramine viidi läbi 96-süvendplaadi mallis, järgides Celeb et al. [55]. Alguses segati TOAC lahuse saamiseks teatud kogus monoaluselist naatriumfosfaati, ammooniummolübdaattetrahüdraati ja väävelhapet. Seejärel lisati 30 µl proovilahustele 300 µl TOAC lahust. Pärast inkubeerimisperioodi 95 kraadi juures veevannis 90 minutit määrati neeldumine 690 nm juures. Askorbiinhapet kasutati võrdluslahusena erinevates kontsentratsioonides, et saada kalibreerimiskõver. Proovide TOAC aktiivsused esitati askorbiinhappe ekvivalentidena (AAE). 4.9. Biosaadavuse indeksi hindamine

Biosaadavuse indeks (BAvI) arvutati vastavalt Inani jt poolt kirjeldatud teoreetilisele võrrandile.[13]

BAVI=CIN/CND Biosaadavuse indeksit (BAvI) kirjeldati kui fenoolide arvu suhet biosaadavas proovis (IN) ja seedimata proovis (ND) leiduvate fenoolide arvu suhet. 4.10. Markerflavonoidide kvantifitseerimine HPTLC abil

Salidrosiidi, hüperosiidi ja kvertsitriini kontsentratsioonide kvantitatiivne määramine kõigis Cistus liikide vesiekstraktide simulatsiooniproovides (ND, PG, IN) viidi läbi kõrgefektiivse õhukese kihi kromatograafia (HPILC) abil (CAMAG, Muttenz, Šveits). järgides Guzelmeric jt poolt valideeritud meetodit. [16]. Hüperosiid, salidrosiid ja kvertsitriin valmistati kontsentratsioonides 25,50 ja 10{{30}} ug/mL ning värskelt valmistatud proovilahuste kontsentratsioonid reguleeriti 10 mg/ml. Need lahused kanti normaalfaasi klaastagusega silikageeliplaatidele (20 cm × 10 cm, Merck, Darmstadt, Saksamaa) teatud kogustega (1-5 μL standardlahused ja 5 μL proovilahused), kasutades 100 μl süstlaid. Hamilton, Bonaduz, Šveits) Pealekandmisprotseduur viidi läbi prooviaplikaatoriga Linomat 5. Arenguprotsess viidi läbi automatiseeritud arenduskambris (ADC 2) ja etüülatsetaat: diklorometaan, äädikhape, sipelghape: vesi (10:25:10). :10:10:10 me). Kui hüperosiidi ja kvertsitriini analüüsiti spektrofotomeetriliselt lainepikkusel 260 nm, siis salidrosiidi kogust mõõdeti UV-skanneriga lainepikkusel 330 nm. Standardite Rf väärtused määrati hüperosiidina (≈0,35), kvertsitriinina (c0,45) 0,65). Korrelatsioonikoefitsiendid (r²) leiti markerflavonoidide kvantifitseerimiseks on × 0,98.

4.11. Inhibeeriv toime diabeediga seotud ensüümidele 4.11.1. - glükosidaasi inhibeeriv aktiivsus

-Cistus liikide vesiekstraktidest saadud seedimata ja biosaadavate proovide glükosidaasi inhibeerivat toimet uuriti vastavalt meetodile, mida on varem selgitanud Balan et al. [56]. Esiteks segati õiges koguses naatriumfosfaati ja dinaatriumfosfaati 100 mM fosfaatpuhvriga (pH7). ac-glükosidaasi ensüüm lahustati fosfaatpuhvris, et saada -glükosidaasi lahus (0,2 U/mL). Seejärel ühendati 170 uL fosfaatpuhvrit, 20 μL -glükosidaasi lahust ja 20 μL proovilahuseid ning inkubeeriti 37-kraadises ahjus 15 minutit. Seejärel lisati segule 20 uL 2,5 mM p-nitrofenüül- -D-glükopüranosiidi lahust 100 mM kaaliumfosfaatpuhvris (pH 7,0) ja inkubeeriti veel 37 kraadi juures 15 minutit. Seejärel lisati reaktsiooni peatamiseks segule 80 µl 0,2 M naatriumkarbonaadi lahust. Neeldumist mõõdeti 405 nm juures. Võrdlusena kasutati erinevate kontsentratsioonidega kvertsetiini lahust. Tulemusi hinnati inhibeeriva aktiivsuse protsendina Cistus liikide vesiekstraktide ND ja IN proovide kontsentratsioonides 1 mg/ml ja 0,5 mg/ml.

4.11.2. - Amülaasi inhibeeriv aktiivsus

Cistus liikide vesiekstraktidest saadud seedimata ja biosaadavate proovide amülaasi inhibeeriv aktiivsus määrati Balani jt poolt eelnevalt kirjeldatud protseduuri järgi.[56] Proovide a-amülaasi inhibeeriva toime spektrofotomeetriline määramine viidi läbi DNS (3,5-dinitrosalicylic acid) reagendiga. Nagu meetodis öeldud, moodustub maltoos tärklise muundamisel ja leeliselise DNS-i kollane värvus muutub tärklisest toodetud maltoosi tõttu oranžikaspunaseks. Seega valmistati 96 mM DNS lahus naatriumkaaliumtartraadi lahuse (lahustatud 2 M NaOH-s) ja teatud koguse DNS-i (lahustunud destilleeritud vees) segust. Seejärel valmistati 20mM naatriumfosfaatpuhver 6,7 mM NaCl-ga (a-amülaasi ensüümi kofaktor) temperatuuril 20 kraadi (pH: 6,9). ensüüm a-amülaas (1 U/mL) ja tärklis (10 mg/ml) lahustati selles puhvris. Pärast seda segati 50 μL naatriumfosfaatpuhvrit ja 10 μL a-amülaasi ensüümi lahust 20 μL proovilahustega. Seda segu inkubeeriti 37 kraadi juures 45 minutit. Pärast inkubatsiooniperioodi lisati segule 20 μL tärkliselahust. Veel üks inkubatsiooniperiood algas 37 kraadi juures 45 minutit. Proovide suhtes rakendati sama protseduuri ilma o-amülaasi ensüümi lahuse lisamiseta, mida nimetatakse "proovi taustaks". Kontrollrühma uuriti sama protseduuriga proovilahuste puudumisel. Neeldumist mõõdeti 540 nm juures. Akarboosi kasutati võrdluslahusena erinevates kontsentratsioonides. Tulemused esitati inhibeeriva aktiivsuse protsendina 1 mg/ml ja 0,5 mg/ml ND ja IN proovides Cistus liigi vesiekstraktidest. 4.11.3.VANUST pidurdav aktiivsus

Cistus liikide vesiekstraktidest saadud seedimata ja biosaadavate proovide AGE inhibeeriv toime määrati Starow-icz et al. kirjeldatud meetodil. [57]. Enne mis tahes protsessi valmistati värskelt 1 mg/mL ja 0,5 mg/mL ND ja IN proovid. Seejärel lisati 1 ml ND ja IN proovilahustele 1 ml veise seerumi albumiini (BSA) lahust kontsentratsiooniga 10 mg/ml. Kontrollproovid valmistati ilma ND ja IN proovilahuseid lisamata ning tühjad proovid valmistati ilma 0, 5 M glükoosi lisamata. Seejärel inkubeeriti kõiki ettevalmistatud proove 40 tundi raputatavas veevannis 55 kraadi juures. Pärast inkubatsiooniperioodi lõppu kasutati fluorestsentsi intensiivsuse arvutamiseks Thermo ScientificTM VarioskanTMLUXmultimode mikroplaadilugejat 370 nm ergastuse/440 nm emissioonivahemikus. Kvertsetiini kasutati võrdluslahusena erinevates kontsentratsioonides.

5. Kokkuvõtted

Käesolevas uuringus uuriti kõigi Türgi taimestikus registreeritud Cistus liikide vesiekstrakte nende fenoolsete profiilide ning in vitro antioksüdantide ja diabeedivastaste potentsiaalide osas. Kuna keetmine või infusioon on traditsioonilises meditsiinis levinud vorm, on vesiekstraktide kasutamine aktiivsuse hindamiseks eksperimentaalsetes uuringutes eriti oluline. Teisest küljest läbivad vesiekstrakti hüdrofiilsed koostisosad seedetraktis pärast allaneelamist mitmeid metaboolseid muutusi. Seetõttu tuleks traditsiooniliste ravimvormide aktiivsuse õigeks hindamiseks uurida ka biosaadavate metaboliitide aktiivsust.

See on esimene uuring, mis uurib inimese in vitro seedimise simulatsiooni meetodi tagajärgi Türgi Cistus liikidele. Lisaks uuriti selles uuringus esimest korda Türgi Cistus liikide inhibeerimispotentsiaali AGE-dele. Lisaks määrati salidrosiidile, hüperosiidile ja kvertsitriinile markerflavonoidid ning nende kontsentratsiooni muutusi jälgiti in vitro seedimise protseduuris. Kuigi seedetrakti seedimise protseduurid mõjutasid ekstraktide fenoolisisaldust ning diabeedivastast ja antioksüdantset toimet negatiivselt, oli neil siiski märkimisväärne bioaktiivsus. Tulemuste kohaselt tuvastati C. salviifolius'e ekstrakt fenoolisisalduse ning antioksüdantse ja diabeedivastase toime poolest kõige võimsama taimena. Kokkuvõtteks võib öelda, et Türgi Cistus liikide õhust osadel on rikkalik fenoolisisaldus ning potentsiaalne antioksüdant ja diabeedivastane toime. Kuigi biosaadavuse hindamiseks kasutati in vitro seedimise simulatsiooni meetodit, ei pruugi see täielikult jäljendada organismis esinevaid metaboolseid radu. Seetõttu on fenoolsete ühendite biosaadavuse ja nende osa teatatud farmakoloogiliste mõjude üksikasjalikuks hindamiseks vaja täiendavaid in vivo ja kliinilisi uuringuid.

Autori kaastööd:Kontseptualiseerimine, YI, EC, EY; metoodika, YI, SA, IK, EÜ formaalne analüüs, YI, IK.-C., SA; uurimine, YI, IK.-C, SA; ressursid, YI, IK.SA, EC ja EY; andmete kureerimine, YI, IK-C., SA; kirjutamine - YI, kirjutamine - läbivaatamine ja toimetamine, YI, EC, EY; visualiseerimine, YI; järelevalve, ECja EYKõik autorid on käsikirja avaldatud versiooni läbi lugenud ja sellega nõustunud.

Rahastamine:See uuring ei saanud välist rahastamist. Institutsioonilise läbivaatamise nõukogu avaldus: Ei kohaldata. Teavitatud nõusoleku avaldus: Ei kohaldata.

Andmete kättesaadavuse avaldus:Selles uuringus esitatud andmed on vastava autori nõudmisel kättesaadavad.

Huvide konfliktid:Autorid ei kinnita huvide konflikti.

Näidiste saadavus:Autoritelt pole ühendite näidiseid saadaval.

See artikkel on välja võetud ajakirjast Molecules 2021, 26, 5322. https://doi.org/10.3390/molecules26175322 https://www.mdpi.com/journal/molecules