Ⅱ OSA: SARS-CoV-2 infektsioon Süüria hamstri mudelil põhjustab põletikku, aga ka I tüüpi interferooni reguleerimise häireid nii hingamisteede kui ka mittehingamisteede kudedes, sealhulgas südames ja neerudes

lisateabe saamiseks:ali.ma@wecistanche.com

Magen Ellen Francis, Una Goncin jt.

OSAKS KLIKI SIIA Ⅰ

Abstraktne

COVID-19(koronaviirushaigus 2019) põhjustatudSARS-CoV-2(raske ägeda respiratoorse sündroomi koroonaviirus 2) infektsioon on haigus, mis mõjutab mitmeid organsüsteeme. Mudel, mis kajastab kõiki haiguse kliinilisi sümptomeidCOVID-19, nagu ka kaugvedajate haigus, on vajalik. Uurisime peremeesorganismi vastuseid, mis on seotud infektsiooniga mitmes peamises organsüsteemis, sealhulgas hingamisteedes, südames janeerudpärastSARS-CoV-2Süüria hamstrite nakatumine. Leidsime põletikuliste tsütokiinide (IL-6, IL-1beeta ja TNF) ja II tüüpi interferoonide märkimisväärse suurenemise, samas kui I tüüpi interferoonid olid inhibeeritud. Kopsuvälise koe uurimine näitas põletikkuneerud, maks ja süda, millel puudus ka I tüüpi interferooni ülesreguleerimine. Histoloogiliselt oli südamel märke müokardiidi ja mikrotrombide kohtaneerudoli torukujuline põletik. Need tulemused annavad ülevaate mitmeorgani haigusest, mida põdevad inimesedCOVID-19ja võib-olla pikaajaline haigus inimestel, kellel on pärast ägedaid tagajärgiSARS-CoV-2(PASC). koroonaviirus 2) infektsioon võib mõjutada mitmeid organsüsteeme, sealhulgas hingamisteid, kuseteede, neuroloogilist süsteemi ja kardiovaskulaarsüsteemi. Selle haiguse asjakohaseks uurimiseks ja ravimeetodite hindamiseks on mudel, mis hõlmab kõiki haiguse kliinilisi sümptomeidCOVID-19on vajalik. On teada, et viirusinfektsiooni järgselt tekkivad kahjustused on sageli tingitud peremeesorganismi enda immuunvastusest. Seetõttu uurisime siin, kuidas immuunvastuseid reguleeritakse mitmes peamises organsüsteemis, sealhulgas hingamisteedes, südames janeerudpärastSARS-CoV-2Süüria hamstrite nakatumine. Leidsime põletikuliste tsütokiinide (IL-6, IL-1beeta ja TNF) ning viirusevastaste tsütokiinide, mida nimetatakse I tüüpi interferoonideks, märkimisväärselt suurenenud. Huvitaval kombel inhibeeriti viirusevastase vastuse I tüüpi interferoone hingamisteedes. Kopsuvälise koe uurimine näitas põletikkuneerud, maks ja süda, millel puudus ka I tüüpi interferooni ülesreguleerimine. Histoloogiliselt oli südamel märke müokardiidi ja mikrotrombide kohtaneerudoli torukujuline põletik. Need tulemused annavad ülevaate mitmeorgani haigusest, mida põdevad inimesedCOVID-19ja võib-olla pikaajaline haigus inimestel, kellel on pärast ägedaid tagajärgiSARS-CoV-2(PASC).

Click to Cistanche kasutab neerufunktsiooni jaoks

SARS-CoV-2 nakkus põhjustab märkimisväärset põletikku või immuunsüsteemi regulatsiooni südames, lümfisõlmedes ja põrnas ning eosinofiilide tunnuseid jämesooles

Põletiku immuunmarkereid, adaptiivset immuunsust ja viirusevastaseid vastuseid hinnati ka mittehingamisteede kudedes koos kudede histopatoloogiaga. Uurisime mediastiinumi lümfisõlme, südant,neerud, põrna, maksa ja jämesoole immuunsihtmärkide reguleerimiseks, mis on liigitatud ülaltoodud I tüüpi IFN-i, II tüüpi / üldise IFN-i vastuse ja kaasasündinud / adaptiivsete vahendajate (joonis 6), samuti immunopatoloogia (joonised 7 ja S4) järgi. Kui histopatoloogia esialgne hindamine viitas spetsiifiliste immuunmehhanismide kaasamisele (joonis S4), viidi läbi kõrge eraldusvõimega skaneerimine, et saada teavet põhjalikumalt (joonis 7). Mediastiinseid lümfisõlmi ei õnnestunud 15. päeval taastada. Vastavad tähtsused geeniekspressioonile on toodud S2 tabelis. I ja II tüüpi IFN vastused kõigis kopsuvälistes organites, välja arvatud maks, olid sarnased kopsude ja nina turbinaatidega (joonis 6). Geeniregulatsiooni iseloomustas I tüüpi reaktsioonide vähenemine ja II tüüpi vastuste suurenemine. STAT2 vähenes oluliselt mediastiinumi lümfisõlmes,neerud, põrn ja jämesool. Südames oli IRF1 oluline ja püsiv langus, samas kui jämesooles oli IFN-beeta langus (joonis 6). Seevastu täheldati IFN-gamma märkimisväärset suurenemist mediastiinumi lümfisõlmedes janeerudning vähemal määral südames ja põrnas. CXCL10, T-rakkude kemoatraktant, tõusis kõrgele tasemele põrnas, maksas ja mediastiinumi lümfisõlmes, kus regulatsioon oli lümfisõlmes kahefaasiline (joonis 6). Kaasasündinud/adaptiivsete vahendajageenide reguleerimist põrnas ja lümfisõlmedes täheldati kõigi uuritud immuunsihtmärkide puhul, välja arvatud TGF-beeta, IL-5R ja CCR3, mis ei olnud tõhusalt reguleeritud. Täpsemalt on oluline reguleerida CD3, CD4, CD8A, IL-2, IL-21, IL-10, IL-4, IL-5, IL{{13 }} ja IL-12 täheldati nendes sekundaarsetes immuunorganites. Kaasasündinud/adaptiivsete immuunmediaatorite reguleerimine oli eriti huvitav südames, kus IL-2, IL-10, IL-4 ja IL-5 suurenesid 100 korda võrreldes algtasemega. . Põletikuliste tsütokiinide kõrgeim ülesreguleerimine tuvastati südames, millele järgnesid neerud, maks ja mediastiinumi lümfisõlmed. Südames suurenes IL{20}} märkimisväärselt varakult ja koos TNF-iga püsis see 15. päeval kõrgemal. IL-6 ja IL-1beeta indutseeriti samuti ajutiselt südamekoes 5. ja 8. päeval (joonis 6). Histoloogilise analüüsi abil täheldati olulisi muutusi südames (joonis S4). Kõrge eraldusvõimega pildistamisel leiti tõendeid mikrotrombide (joonis 7A, valged nooled) ja müokardiidi (joonis 7B, valged nooled) kohta südames. CD14, IL-1beeta ja TNF reguleeriti neerudes varakult üles, kuid vähenesid 8. päeval 12. pii-ni (joonis 6), mis langes kokku põletikuliste rakkude infiltratsiooniga neeru ja võimaliku ägeda neerukahjustuse või torukujulise vigastusega (näidatud valgete nooltega, joonis 7C). IL-6 ekspressioon püsis maksas, kus hilistel ajahetkedel suurenes ka IL-1beeta. Mediastiinumi lümfisõlmes oli IL-12 kahefaasiline suurenemine koos IL-6 ja TNF-i mööduva tõusuga, vastavalt 12, 8 ja 11 korda. Jämesooles oli oluline IL-5, IL-5R ja CCR3 reguleerimine koos eosinofiilide infiltratsiooniga (joonis 7D), kuid minimaalne muude kaasasündinud/adaptiivsete vahendajate regulatsioon. Kopsuväliste elundite analüüsiga kaasas analüüsisime loomade verekeemiat aja jooksul, et hinnata elundi talitlushäireid (S5 joonis 1). Maksafunktsiooni tunnusena analüüsisime glükoosi, albumiini, aluselist fosfataasi, alaniintransferaasi, vere uurea lämmastikku, üldbilirubiini ja kogu valku [27]. Neerude hindamiseks analüüsiti kaltsiumi, kaaliumi, albumiini, amülaasi, vere uurea lämmastikku ja kogu valku [27]. Seedetrakti tervist hinnati naatriumi, kaaliumi ja aluselise fosfataasi [27] abil. Südamefunktsiooni mõõdeti naatriumi, kaaliumi ja alaniini transferaasi [27] abil. Globuliinide ülesreguleerimist hinnati antigeense stimulatsiooni märgiks[27]. 14 uuritud molekulist olid nakatunud loomadel kontrollidega võrreldes märkimisväärselt suurenenud ainult amülaasi ja glükoosi sisaldus, saavutades maksimumi vastavalt 1700 U/L ja 280 mg/dl päeval 8 pi. Lisaks olid kaaliumi kontsentratsiooni ([K pluss ]) muutused kõige märgatavamad ja näisid uuringuperioodi jooksul enamasti ajaga seotud olevat, kuna enamikul isikutel oli [K pluss] tõus ja suurim muutus oli 15. päeval. albumiinis oli samuti märkimisväärne, kuid paljudel loomadel kerge. Valgu üldkontsentratsioon suurenes veidi enamikul katsealustel, kuid muutus on suhteliselt kerge ja tõenäoliselt kliiniliselt ebaoluline. Teised maksamarkerid saavutasid haripunkti aja jooksul hiljem, sealhulgas glükoos (280 mg/dl) 8. päeval, aluseline fosfataas (ALP) 12. päeval (3 U/L) ja vere uurea lämmastik (BUN) (22 mg/dl). 15. päeval. Alaniintransferaas (ALT), kuigi saavutas haripunkti 2. päeval, oli kõrge 12. päeval, veidi alla 100 U/L, mis viitab võimalikule maksakahjustusele. Neerumarkerid saavutasid haripunkti ka hiljem, amülaasi (1700 U/L) 8. päeval ning kaaliumi ja BUN (vastavalt 12 ja 22 mg/dl) 15. päeval. BUNil oli väheste eranditega võimalik ajast sõltuv kontsentratsiooni tõus. Kaltsium seevastu saavutas haripunkti 2. päeval 2,6 mg/dl, kuid langes võrdlusvahemikku. Seedetrakti ja südame tervise markerid, nagu naatrium, näitasid minimaalset regulatsiooni, samas kui [K pluss ] suurenes kogu nakkusliku aja jooksul suhteliselt lineaarselt, saavutades haripunkti 15. päeval (12 mg/dl). ALP (gastrointestinaalne marker) oli kõrge 5. ja 8. päeval 3 u/l juures ja ALT (südamemarker) tõusis nakatunud hamstrite puhul võrreldes nakatumata hamstritega 2., 8. ja 12. päeval 75–100 U/L, kuid erinevused ei olnud märkimisväärsed. Lõpuks saavutas globuliin maksimumi 2. päeval 0,6 g/dl ja vähenes aja jooksul suhteliselt lineaarselt. Kokkuvõttes näitab vereanalüüs mõningast reguleerimishäiret kopsuvälistes organites, samuti antigeenset stimulatsiooni vastuseksSARS-CoV-2.

Joonis 6. SARS-Cov-2 infektsioon hamstritel põhjustab põletikuliste ja immuunmediaatoritega seotud geenide arvu suurenemist valitud ekstrapulmonaarsetes organites, mis võib viidata müokardiidile, adaptiivsele immuunevolutsioonile ja eosinofiilide infiltratsioonile jämesoolde.qRT-PCR viidi läbi RNA-ga, mis eraldati mediastiinumi (M) lümfisõlmest, südamest, neerust, põrnast, maksast ja jämesoolest.SARS-CoV-2nakatatud hamstrid. Proove hinnati I tüüpi interferooni vastusega (IFN-beeta, STAT2, IRF1, IRF3, TLR3), II tüüpi interferooni vastusega (IFN-gamma, IRF2, STAT1, CXCL10) ja kaasasündinud/ adaptiivne vahendaja (CD3, CD4, CD8, CD19, IL-2, TGF-beeta, IL-21, IL-10, IL-4, IL-5, IL-5R, IL-13, IL-12, CD14, CCR3, PKR, CCL20, CCL22, IL-1beeta, IL-6, TNF) geenid hamstri järjestuste jaoks spetsiifiliste PCR-praimerite võimendamine (tabel 1). Voldimuutus arvutati ΔΔCt abil algtaseme suhtes (päev 0), kasutades majapidamisgeenina BACT-d. N on kõigi ajapunktide jaoks 3.

Arutelu

AlgseltSARS-CoV-2Arvati, et infektsioon põhjustab peamiselt hingamisteede haigusi, kuid nüüd on see selgeCOVID-19on paljude nägude haigus, mis mõjutab mitmeid organsüsteeme[25,26]. Et paremini mõista haiguse päritolu ja lugematuid inimestel kogetud kliinilisi sümptomeid, uurisime nii hingamisteede kui ka mittehingamisorganite immunopatoloogiat.SARS-CoV-2Süüria hamstrite nakatumine. Nakatumine 105 TCID50SARS-CoV-2põhjustas kerge kuni mõõduka kliinilise haiguse. Nakkuslik viirus sisaldus peamiselt hingamisteedes, kuigi viiruse RNA esines kõigis hinnatud kudedes. Peremeesreaktsiooni profiilide koostamine hingamisteedes tuvastas I tüüpi IFN-i vastuse pärssimise koos II tüüpi IFN-ide, põletikuliste tsütokiinide, kaasasündinud ja adaptiivsete tsütokiinide samaaegse suurenemisega. Kopsuväliste organite uurimisel leiti sarnane profiil I ja II tüüpi IFN-i signaalide puhul; samas tuvastati ka koespetsiifiline immuunregulatsioon. Täpsemalt tuvastati kaasasündinud ja adaptiivsete vahendajate märkimisväärne ekspressioon südames ja põrnas. Kuna viirusevastane ravi ajalSARS-CoV-2infektsioon on efektiivne ainult lühikese aja jooksul[28], raskeCOVID-19arvatakse, et see on düsreguleeritud immuunvastuse tagajärg[29]. Immuunpatogeneesi mõistmine on oluline terapeutiliste sihtmärkide tuvastamiseks ja ägedate mitterespiratoorsete sümptomite raviks.COVID-19sealhulgas südamepekslemine või migreen ja pikemaajalised seisundid taastumisfaasis, nagu post-ägedad tagajärjedSARS-CoV-2infektsioon (PASC), mida nimetatakse ka pikaks COVID-iks[30].

Joonis 7. Valitud kopsuvälistel organitel on pärast SARS-CoV-2 nakatumist selge patoloogia koos mikrotrombide ja müokardiidi tunnustega südames, torukujuliste kahjustustega neerudes ja eosinofiilide infiltratsiooniga jämesooles.Süda, neer ja jämesool koguti igalt loomalt lahkamisel ja fikseeriti 10-protsendilises formaliinis enne parafiiniploki sisestamist. Kuded värviti H&E-ga. Südamekudedes ilmnesid mikrotrombid (valged nooled) mitme päeva jooksul (A), samuti müokardiit 8. päeval (valge nool) (B). Neerul oli äge vigastus / torukujuline vigastus (valged nooled) (C). Jämesooles oli eosinofiilide infiltratsioon (valged nooled) (D). Värvitud kuded visualiseeriti ja pildistati Aperio ScanScope XT slaidiskanneriga. Näidatud pildid esindavad kolme looma rühma kohta ajapunkti kohta.

Peamine nakkuskoht, mis mõjutab edasikandumistSARS-CoV-2inimestel on hingamisteed. Seetõttu oli meie uurimise esialgne fookus hingamisteed, sealhulgas sellega seotud immuunvastused ja immunopatoloogia. Siin oleme näidanud nii ülemiste kui alumiste hingamisteede infektsiooni ja sellega seotud haigust pärast SARS-CoV-2 nakatumist Süüria hamstritel. Kopsu viirusnakkus viis raske patoloogiani, mida iseloomustab põletikuliste rakkude infiltratsioon, mille tulemuseks oli 5. päeval bronhopneumoonia ja 8. päeval hemorraagia. Need leiud olid kooskõlas SARS-CoV-2 infektsiooniga varasemates Süüria hamstri uuringutes[19, 20, 31, 32] ja suuremad loommudelid, sealhulgas reesusmakaagid[33], samuti mõnel inimesel tuvastatud raske kopsupõletikCOVID-19patsiendid[34-36]. Andmete järjepidevus toetab hamstri kasutamist modelleerimiseksSARS-CoV-2inimese hingamisteede haigus ja sellega seotud immunopatoloogia. Samuti märkisime, et mõned hamstrid kogesid suuremat kaalukaotust, mis oli korrelatsioonis suurema viiruskoormusega. Erinevus kaal võis olla tingitud hamstrite loomulikust instinktist toitu põskede sisse peita, ebatõhusast pookimisest või peremeesorganismile omased omadused, mis võivad põhjustada erinevat kaalukaotust ja viiruse replikatsiooni selles loomakarjas. Kuna kõiki loomi kontrolliti toidu säilitamise suhtes nende suus ja kõik loomad olid selle suhtes positiivsedSARS-CoV-2viirus, meie arvates ei peegelda see tulemus ei kaalumisvigu ega halba nakatamist. Vaja on rohkem tööd, et teha kindlaks, kas Süüria hamstrite ja Charles Riveri vahel on geneetilisi erinevusi. Loomakarja puhtuse mõistmine annab olulist teavet nende loomade kasutamise kohta SARS-CoV-2 terapeutilistes uuringutes ja kui neid teadmisi on võimalik kasutada raskema hamstri arendamiseks.SARS-CoV-2mudel. Oma uuringus tuvastasime ka peamiste põletikuliste geenide, nagu IL-6 ja TNF, ülesreguleerimise kopsudes ja ninaturbinaatides, mis kinnitas varasemat immuunmudelit hamstritel[32,37]. Need leiud on olulised, kuna on näidatud, et need põletikulised markerid ennustavad rasket haigust inimeste vereanalüüsi kaudu[38-42]. SARS-CoV-2 peremeesorganismi vastuse põhjalikum analüüs hamstrite hingamisteede kudedes on tehtud transkriptoomilise sekveneerimise analüüsi abil[43,44]. Hoagland ja kolleegid hindasid tema kopseSARS-CoV-2nakatunud hamstrid peremeesorganismi immuungeeni reguleerimiseks ja avastasid meie PCR tulemustega kooskõlas oleva IL-6, TNF ja IL-1beeta[43] silmatorkava ülesreguleerimise. Teises uuringus näitas üherakulise sekveneerimise analüüs silmapaistvat T-raku vastust, sealhulgas IFN-gamma ja IL-2[44] ülesreguleerimist – kaks markerit, mille puhul täheldasime samuti kopsudes tugevat ekspressiooni. Lisaks näitasid meie kopsude analüüsid T-raku markerite CD3, CD4 ja CD8A ülesreguleerimist. Oluline on see, et meie käesolevas uuringus esitatud qRT-PCR analüüs on kooskõlas nende teiste uuringutega, kinnitades seega qRT-PCR kasutamist hamstris SARS-CoV{{ 13}} mudel. Meie qRT-PCR-profiilid pakuvad sihipäraseid biomarkereid, mida saab hõlpsasti kasutada. Meie uuringut ja tõlgendust piiras ainult patogeneesi analüüsi olemasolu. Tulevased uuringud peaksid kasutama meie immuuneesmärkide paneeli, et kasutada seda vaktsiini- ja terapeutilistes uuringutes.

Viirusevastane vastus on oluline viiruse esmaseks kontrollimiseks viiruse replikatsiooni aktiivse hävitamise ja immuunstimulatsiooni kaudu, et piirata levikut teistesse rakkudesse. Pärast viiruse või viirusantigeenide olemasolu kindlakstegemist on interferoonide indutseerimine keskse tähtsusega rakkudes antimikroobse seisundi loomisel, kus interferoonide ja teiste kaasasündinud tsütokiinide vaheline tasakaal on tõhusaks tegevuseks ülioluline[45]. Hiljuti on I tüüpi interferoonide (IFN-alfa ja IFN-beeta) inhibeerimist seostatud raskete haigustegaCOVID-19mis viitab sellele, et viirus on võimeline blokeerima viirusevastast immuunsust, mis suurendab patogeneesi [14,46,47]. Meie uuringus leidsime, et hamstrid, kes on nakatunudSARS-CoV-2neil on prototüüpne II tüüpi IFN-vastus. Seevastu IIFN-i tüüpi vastus on allareguleeritud, mida tõendab IFN-beeta geeniekspressiooni vähenemine ja I tüübi antagonisti IRF2 geeniekspressiooni suurenemine. Paljud uuringud on näidanud I tüüpi IFN-i reaktsioonide halvenemist pärast SARS-CoV-2 infektsiooni in vitro[14, 48-51]. Siin kirjeldatud IFN-i düsregulatsiooni ei ole raskekujuliste inimeste hingamisteede kudedes veel analüüsitudCOVID-19, kuid vere süsteemsed immuunanalüüsid on näidanud sarnaseid tulemusi[14,46,47,52]. Kuigi I tüüpi interferooni vastuseid inhibeerivaid mehhanisme ei ole täielikult välja selgitatud, on selle düsregulatsiooniga seotud viirus- ja peremeesfaktorid [53,54].

Interferooni vastuse düsregulatsioon on strateegia, mida viirused kasutavad peremeesorganismi immuunsuse vältimiseks. Varasemad uuringud peremeesorganismi vastuse kohta SARS-CoV (raske ägeda respiratoorse sündroomi koroonaviirus 1) ja MERS-CoV (Lähis-Ida respiratoorse sündroomi koronaviirus) infektsioonile viitavad sellele, et seda strateegiat kasutavad mitmed koroonaviirused[55-59]. Xia jt 2020. aasta uuring. määras, et see kõrge patogeensusega koronaviiruste poolt kasutatav düsregulatsioon ulatubSARS-CoV-2näidates, et kõik need kolm beeta-koronaviirust reguleerivad I tüüpi interferooni rada alla. Täpsemalt, NSP1, NSP6 ja NSP13[50] häirivad IFN-beeta translatsiooni, blokeerides NSP1 [60] puhul peremeesorganismi ribosoomi või suunates NSP13 puhul IFN-beeta induktsiooniks vajalikke ülesvoolu valke [61]. muudSARS-CoV-2viirusvalgud on samuti seotud interferooni alareguleerimisega[62]. ORF3b ja ORF9b on mõlemad spetsiifiliselt suunatud mitokondriaalsele viirusevastasele signaalvalgukompleksile, et pärssida I tüüpi IFN signaaliülekannet [63, 64]. Mõjutavad peremeesteguridSARS-CoV-2nakkuse tagajärjed hõlmavad vanust ja sugu; lisaks on interferooni düsregulatsiooniga seotud ka kaasuvad haigused[65]. Uuriti Trouillet-Assenti jt 2020. aasta uuringutCOVID-19patsientide ravitulemused kohortis, kuhu kuulusid I tüüpi IFN-i süsteemselt ekspresseerivad isikud ja isikud, kellel oli oluliselt madalam nii IFN-alfa kui ka beeta tase. Nad leidsid, et patsiendid, kellel puudus I tüüpi interferooni ekspressioon, olid vanemad ja tõenäolisemalt mehed, võrreldes nendega, kes ekspresseerisid I tüüpi IFN-e[66. Sarnases uuringus tuvastati naistel oluliselt kõrgem IFN-alfa2 süsteemne tase võrreldes meeste tasemega|67]. Hiljutises uuringus avastasime, et vanematel täiskasvanud isastel tuhkrutel oli täiskasvanud emasloomadega võrreldes hilinenud I tüüpi interferooni vastus, kusjuures isastel puudusid oluliste viirusevastaste geenide, sealhulgas OASL, MIX1 ja IDG15 indutseerimine, mis langes kokku suurenenud viiruskoormusega[68]. Meie praeguses hamstri mudelit kasutavas uuringus olid kõik meie loomad isased, mis viitab sellele, et meie täheldatud I tüüpi interferooni düsregulatsiooni täielikuks mõistmiseks on vaja uurida soolisi eelarvamusi. Praegu pole teada, miks või kuidas mõjutavad peremeesorganismi tegurid interferooni vastuseidSARS-CoV-2. Bastardi jt uuringus tuvastati I tüüpi interferoonide vastaste autoantikehade olemasolu meestel, kellel on raskekujuline haigus.COVID-19[69]. See annab võimaliku selgituse immuunmehhanismide kohta, mis on seotud I tüüpi interferooni vastuste vähenemisega inimpatsientide alarühmas. Meie praeguses uuringus, kus kõik hamstrid olid täiskasvanud isasloomad, interferooni vastuste vähenemise mehhanism ootab edasist uurimist. Veelgi enam, immuunprofiil, mille oleme tuvastanud koos hingamisteede patoloogiaga, viitab sellele, et hamstrid on ideaalne mudel nende mehhanismide uurimiseks ja selliste ravimite testimiseks nagu I-tüüpi interferoonid [48, 49, 70] või interferoon lambda [Z1, Z2], mõlemad on näidanud ravi efektiivsustCOVID-19patsientidel [Z3-75], kuid vaja on rohkem uurida.

COVID-19on haigus, mis hõlmab nii hingamisteede kui ka mittehingamisorganite patogeneesi[25,26, kuigi peremeesorganismi reaktsioonist väljaspool hingamisteid on vähe aru. Meie uuringus tuvastasime vRNA mitmes kudedes väljaspool hingamisteid, sealhulgas mediastiinumi lümfisõlmes, südames, neerus, maksas, põrnas ja jämesooles. Viiruse RNA olemasolu võib näidata elusviiruse replikatsiooni ja koeinfektsiooni, kuid see võib esineda ka ilma elusviiruseta. Me ei leidnud märkimisväärset elusviirust väljaspool hingamisteid, mis viitaks minimaalsele kopsuväliste organite infektsiooni esinemisele. Siiski võib viiruse RNA olemasolu olla kliinilise haiguse ja sellega seotud mehhanismide jaoks oluline. Viiruse RNA esinemine võib olla tingitud viirusest veres, mida transporditakse süsteemselt, või viirusantigeenist, mille antigeeni esitlevad rakud transpordivad immunoloogiliselt olulistesse kudedesse, nagu põrn ja mediastiinumi lümfisõlmed. Viiruse RNA olemasolu võib mängida rolli immuunvastustes ja sellega seotud patogeneesis nendes kudedes. Seetõttu uurisime immuunsüsteemiga seotud peremeesreaktsioone kudedes, mis olid viiruse RNA suhtes positiivsed. Kuigi leidsime põletikuliste ja II tüüpi interferooni geenide ülesreguleerimise kõigis mittekopsukudedes, oli kõige silmatorkavam vastus immuunmoduleerivate tsütokiinide suurenemine südames. Meie analüüs tuvastas südames tsütokiinide, sealhulgas IL-10, IL-2, IL-4, IL-5, IL-5R, IL{ {12}}, CD14 ja CCR3, kus mõned tsütokiini mRNA transkriptid suurenesid 100- korda. Kuigi valitud tsütokiine võivad siin toota erinevad T-rakkude alamrühmad, viitab TGF-beeta puudumine T-regulatoorsete rakkude olemasolule vähem tõenäoliseks. Lisaks vähendab IL-13 puudumine TH2 vastuse tõenäosust. Lisaks T-lümfotsüütidele võib IL-10, TNF ja IL-6 geeniekspressiooni suurenemist seostada monotsüütide või makrofaagidega[76]. Seda toetab veelgi CD14 suurenemine[76]. IL-5, IL-5R, IL-4 ja CCR3 ekspressioon viitab samuti eosinofiilide esinemisele[77]. Paljud kliinilised uuringud on nüüdseks tuvastanud südame seotuseCOVID-19[78-84]. Tegelikult on hinnanguliselt umbes 30 protsenti inimestest, kes on sellest paranenudCOVID-19teil on teatud tüüpi südamekahjustus85]. Saksa uuring 100 kohtaCOVID-19patsiendid leidsid, et müokardipõletik oli tavaline isegi kuid pärast taastumistSARS-CoV-2infektsioon[84]. Testitud kohordis esines 78 protsendil patsientidest südamega seotud sümptomeid, olenemata nende raskusastmest.COVID-19raskusaste[84]. Monotsüüdid kuuluvad rakutüüpide hulka, mis teadaolevalt tungivad südamesse müokardipõletiku korral, tekitades IL-10, IL-1beeta, IL-6 ja TNF [86], samuti IL-12[87,88], mis kõik olid südames ülesreguleeritud pärastSARS-CoV-2inokuleerimine meie praeguses uuringus. Lisaks veel üks südameprobleemide alamhulk, mis on seotudCOVID-19on omistatud eosinofiilidele, mille tulemuseks on eosinofiilne müokardiit[89]. Teised viirused põhjustavad teadaolevalt pärast nakatumist eosinofiilset müokardiiti[90-93]. See patoloogia tuleneb tavaliselt sellest, et viirus nakatab südamekudesid, näiteks Coxsackievirus B3 infektsiooniga[94]. aastal on diagnoositud eosinofiilne müokardiitCOVID-19Patsientidel, mille lahkamisel ilmnes südamekoes põletikuliste rakkude, sealhulgas lümfotsüütide, makrofaagide ja silmatorkavalt eosinofiilide infiltratsioon [89]. Sel juhul leiti eosinofiilide arvu suurenemine ja üldine põletik südames, hoolimata sellest, et surma hetkel südames elusviirus puudus[95]. Leidsime oma uuringus tõendeid eosinofiilse müokardiidi histopatoloogias ja ka südames leitud tsütokiini allkirja kohta. Meie uuringus on võimalik, et eosinofiilid põhjustavad põletikulise vahendatud kardiomüopaatiat IL-4 ülesreguleerimise kaudu, mis suurenes geeniekspressiooni osas hamstrite südames 8. päeval pärast SARS-CoV-2 inokuleerimist. Kaaliumisisalduse suurenemine ja alaniini transferaasi vähene tõus nakatunud hamstrite plasmas võisid samuti toetada südame düsregulatsiooni. Seda silmas pidades pole mehhanismid, mis reguleerivad COVID-iga seotud südamekahjustusi,{7}} ikka veel teada. Arvestades südame kaasatuse levimustCOVID-19patsientidel on vaja rohkem uuringuid, et mõista haiguse mehhanisme. Siin oleme esitanud tõendeid selle kohta, et hamstrid võivad olla kasulikud südamekahjustuse mehhanismide mõistmiseksSARS-CoV-2infektsioon ja selle patoloogia ravimeetodite hindamine.

Immunoloogiliselt viitavad meie analüüsid põrnas ja mediastiinumi lümfisõlmedes adaptiivse immuunsuse esilekutsumisele. Mediastiinumi lümfisõlm tuvastas T-rakkudega seotud geenides märkimisväärse kahefaasilise regulatsiooni koos CD3, CD4, IL-2, IL-21, I-10, IL{ geeniekspressiooni ülesreguleerimisega. {6}}, IL-5 ja IL-13 päeval 2 ja 15. See profiil viitab antigeeni varasele esitlusele dreneerivas lümfisõlmes vahetult pärast dendriitrakkude poolt kopsuinfektsiooni, mida päev toetab 2 IL-12 tootmise ülesreguleerimine lümfisõlmedes [96,97]. Dendriitrakkude migratsioon, mis viib T-rakkude aktiveerumiseni, kulmineerub lõpuks IL-2-ga, mis stimuleerib T-rakkude kasvu ja proliferatsiooni[98]. Nakatunud hamstrite globuliinide tase veres 2. päeval pärast nakatumist toetab ka varajast antigeenset stimulatsiooni. IL-4, IL-5 ja IL-13 ülesreguleerimine viitab TH2 moonutatud reaktsioonile[99]. Varased uuringud on näidanud, et see on asümptomaatiline või kergeCOVID-19Juhtudel, kus immuunsüsteem kaldus süsteemse TH2 suunas, mida iseloomustas IL-4 ja IL-10[100]. IL-10, regulatiivse tsütokiini sisalduse suurenemine, reguleeriti meie uuringu 2. päeval samuti üles. Meie andmed näitavad, et aktiveeritud T-rakud värvatakse elusa viirusinfektsiooniga kudedesse, nagu nina turbinaadid, kus täheldasime T-rakkudega seotud geenide suurenemist 5. päeval pärast inokuleerimist. Geenide sekundaarne ülesreguleerimine lümfisõlmedes 15. päeval viitab samuti T-rakkude alamhulkade laienemisele. Nakkuslike viiruste puudumisel võib see olla T-rakkude alamhulkade arvu suurenemine, mis aitavad otseselt kaasa mäluvastuse arengule. Kuna keskmälu T-rakud toodavad ka IL-2[101], võivad meie andmed, mis näitavad IL-2 suurenemist 15. päeval pärast inokuleerimist, viidata T-rakkude mälule. IL-21 oli 15. päeval enim reguleeritud T-rakkudega seotud geen. IL-21 toodetakse peamiselt T-folliikulite abistajarakkude poolt, alamhulgast, mis aitab idukeskuse B-rakke[102], eriti B-d. rakud afiinsuse küpsemise ja mälu arengu suunas. B-raku marker CD19 suurenes ka lümfisõlmes, geeniekspressiooni tipp saavutas päeval 15.A 2021. aasta uuringus, mille autoriteks on Lakshmanappa jt.SARS-CoV-2infektsioon reesusmakaakidel, mis näitab tugevat T-raku vastust mediastiinumi lümfisõlmes koos CD4 spetsiifilise suurenemisega, samuti T-folliikulite abistajarakkude markereid CD28 ja CXCR5 [103]. Võimalik, et meie uuringus täheldatud suurenenud T-raku geeniekspressioon viitab ka idukeskuse vastusele. Kõrgenenud süsteemset T-rakulist vastust on täheldatud ka SARS-CoV-2-ga patsientidel, kellel taastub ja areneb pikaajaline mälu [97,104]. Vaktsiiniuuringute jaoks oleks kasulik sügavam analüüs koos idukeskuse reaktsioonide markeritega lümfisõlmede hindamiseks.

Lümfisõlmede suurenenud aktiivsus võib samuti viidata patogeneesile. Lümfisõlm oli ainus mittehingamisorgan, kus elusviirus tuvastati. Lümfisõlmede ja põrna elusat viirusinfektsiooni on täheldatud inimestel, kes suriSARS-CoV-2[105]. Kaneko jt uuringus võeti surnud inimese lümfisõlmede ja põrna proovidCOVID-19patsientidel puudusid BCL6 pluss B-rakud, aga ka terved idukeskused üldiselt. Autorid oletasid, et see oli halva humoraalse reaktsiooni põhjuseksSARS-CoV-2[106]. Kuna tuvastasime tugeva neutraliseeriva antikeha vastuse, mis tuvastati 8. päeval pärast nakatumist, mis langes kokku viiruse leviku vähenemisega, on tõenäolisem, et meie uuringu lümfisõlmedes leitud elusviirus viitas funktsionaalsetele B-rakkude reaktsioonidele ja idukeskuse reaktsioonid.

Põrnas ilmnesid ka silmapaistvad immuunvastused, mida iseloomustas geeniekspressiooni lineaarne suurenemine 8. päevast 15. päevani. See hiline ülesreguleerimine korreleerub tüüpilise põrna kaasamisega immuunvastusega patogeenidele, mis tekiks pärast aktiveerimist lokaalsetes äravoolusõlmedes[107]. Põrn, lümfoidne organ, aktiveerib vastusena viiruse antigeenile ka T- ja B-rakke. CD3, CD4, IL-2 ja I-21 kõrge geeniekspressioon viitab T-follikulaarsele rakule. samuti germinaalkeskusest sõltuv B-rakkude aktiivsus, nagu nägime lümfisõlmes[108]. Lisaks võib põrna vastus olla vireemia tagajärg, kus plasmatsütoidsed dendriitrakud (pDC-d) osalevad viiruse antigeeni tuvastamises TLR7 ja TLR9 kaudu CD8 pluss T-rakkude ja Natural Killer T (NKT) rakkude aktiveerimise jaoks. Mõlemad rakutüübid toimivad viirusega nakatunud rakkude puhastamisel pärast põrnas aktiveerimist IFN-beeta ja IL-12 [109] poolt, mida meie mudelis suurendati koos CD8.IL-12 , IL-10 ja CD14 olid nakatunud hamstri põrnas ülesreguleeritud, viidates potentsiaalselt makrofaagide fagotsüütilisele aktiivsusele[110,111]. Samuti toetavad kaasasündinud lümfoidrakud (ILC) põrnas koe paranemist vastusena vigastusele ja toodavad IL-5 ja IL-13[112]. Kokkuvõttes viitab see põrna hilisem reaktsioon põrna taaskasutusfunktsioonile, samuti potentsiaalsele lümfotsüütide aktiveerimisele pikaajaliste mälureaktsioonide jaoks.

Jämesool näitas hinnatud tsütokiinide minimaalset regulatsiooni, välja arvatud I-5, IL-5R ja CCR3. Kõigi nende kolme geeni ekspressioon suurenes märkimisväärselt 2. kuni 15. päeval, IL-5 muutuse maksimum oli 74, võrreldes algtasemega 8. päeval. IL-5 sekreteerib valdavalt tüüp 2 T. -abistajarakud ja eosinofiilid[113]. Arvestades teiste Th2-ga seotud geenide, nagu IL-4 ja IL-13 madalamat geeniekspressiooni taset ning teadaolevate eosinofiilide markerite IL-5R ja CCR3 suurenemist, on tõenäoline, et IL{ {18}} toodetakse peamiselt eosinofiilide poolt, mida võib näha meie jämesoole histoloogilises analüüsis. Eosinofiilidel on otsene roll viirusevastases kaitses, mida tõendavad nende graanulites olevad RNaasid ja neid on seostatud teiste hingamisteede viiruste kliirensiga[114,115]. Suur hulk eosinofiile leidub ka seedetraktis[116]. Meie uuringus ei leitud nakatunud hamstrite jämesooles elusaid viiruseid. Jämesool oli aga positiivneSARS-CoV-2viiruse RNA 2. ja 5. päeval pärast inokuleerimist, mis on kooskõlas Sia jt järeldustega, kes täheldasid vRNA-d käärsooles ka põletikulise vastuse puudumisel [20]. Kuni 20 protsentiCOVID-19patsiendid teatavad seedetrakti sümptomitest, nagu kõhulahtisus[39 117], millega kaasnevad viiruste levik väljaheitega[118]. Seda võib seletada eosinofiilide vähenemisega, mida on kirjeldatud raskete haigusjuhtude korralCOVID-19[119-121]. IL-5 geeniekspressiooni suurenemine eosinofiilide poolt võib kaasa aidata jämesoole viirusevastasele seisundile, hoides seeläbi ära infektsiooni. Täpse rakutüübi kinnitamiseks, mis põhjustab selle kõrgendatud IL-5 vastuse, on vaja täiendavat uurimist.

Oma uuringus uurisime ka vere keemiatSARS-CoV-2nakatunud Süüria hamstrid. Määrasime võrdlusvahemiku, kasutades meie loomse päritoluga nakatumata hamstreid, ning võrdlesime näitu hamstrite, eriti Süüria hamstrite jaoks avaldatud võrdlusvahemikega[122]. Mõned eelanalüütilised tegurid, mis võivad mõjutada meie loomade verekeemiat enne nakatumist ja mida tuleb analüüsimisel arvesse võtta, hõlmavad loomade stressitaset, samuti vere võtmisel kasutatavat isofluraanesteetikumi, mis võib muuta vere keemilist koostist. On näidatud, et glükoosi, ALT, ALP ja anorgaanilise fosfori tase oli rottidel isofluraani ja teiste siin nimetamata anesteetikumide kasutamisel oluliselt kõrgem[123]. Meie uuringus SARS-CoV-2 nakatunud hamstrite kohta oli üks kõige märkimisväärsemad muutused pärast nakatumist hõlmasid kaaliumisisaldust, mis aja jooksul suurenes. Kaalium, mis on alus, toimib puhvrina vesiniku(H')(happe) vastu vahetamiseks, kui patsient on happelises olekus. Kuna vere atsidoosi võivad põhjustada hingamisfunktsiooni muutused, pole üllatav, et hamstrid, kellel esinesid kopsupõletiku/hingamishäirete tunnused (mis viitab süsinikdioksiidi (CO2) peetuse suurenemisele (või väljutamisele vähem) ja vähem hapnikku. O2), mida võetakse alveolaarsete funktsioonide languse tõttu, on happesus, mis põhjustab vere kaaliumisisalduse suurenemist. Seoses madalama albumiini tasemega võrreldes meie võrdlusvahemikuga oleks võinud eeldada, et albumiin suureneb vastusena põletikulisele tsütokiini ekspressioonile. Võimalik, et albumiini madalamad tasemed olid tingitud isofluraani kasutamisest, mida on varem näidatud[122-124]. Seoses glükoosisisaldusega aja jooksul suurenes enamikul nakatunud loomadest glükoosikontsentratsioon, mis viitab kortisooli poolt põhjustatud stressile, epinefriini poolt põhjustatud põnevusele või düsregulatsioonile insuliini tootmises või sekretsiooni/retseptori interaktsioonis. Kokkuvõtteks võib öelda, et selle analüüsi kõige huvitavam leid oli vihje hapnikusisalduse vähenemisele, mis on seotud suurenenud kaaliumisisaldusega. Need tulemused viitavad sellele, et kaaliumi jälgimist võib kasutada kopsupõletiku tuvastamiseks kogu eluea jooksulCOVID-19loomkatsed. Edaspidi saab seda tööd kasutada ka Süüria hamstri SARS-CoV-2 nakkuse mudeli võrdlusväärtuste loomiseks ja seda saab kasutada ravimeetodite sõeluuringuks.

Meie uuring pakub olulisi teadmisiSARS-CoV-2infektsioon jaCOVID-19haiguse reguleerimine. Prekliinilised mudelid on biomeditsiiniliste uuringute nurgakivi, mis pakub võimalust eksperimentaalselt isoleerida haigusmehhanisme ja hinnata ka võimalikke meditsiinilisi vastumeetmeid, sealhulgas immunomoduleerivaid ravimeid, viirusevastaseid ravimeid ja vaktsiine. NaguSARS-CoV-2Esmalt ilmnes, et meil oli piiratud arusaam patogeneesi mehhanismidest, puudusid kindlaksmääratud ravi- või profülaktilised vahendid ega prekliiniline mudel meditsiiniliste vastumeetmete avastamiseks. Alates viiruse ilmumise ajast on tehtud suuri hüppeid eelkõige prekliinilise mudeli väljatöötamisel, kuid meie arusaamCOVID-19ja selle paljud ilmingud on endiselt piiratud. Meie uuring kinnitas varem tuvastatud viiruslikku tropismi ja hingamisteede patoloogiatSARS-COV-2hamstriuuringuid, kuid suutis ka laiendada meie arusaama immuunregulatsioonist ja patogeneesist hingamisteedes ja väljaspool.

Viited

1. Zhuang Pinghui JW. Wuhani kopsupõletik: kuidas müstilise haiguse allika otsimine arenes välja South China Morning Post 2020. Saadaval aadressil: https://www.scmp.com/news/china/society/article/ 3046233/Wuhan-pneumonia-how-search -allikas-müsteerium-haigus-lahti.

2. Cucinotta D, Vanelli M. WHO deklareeribCOVID-19pandeemia. Acta Biomed. 2020; 91(1):157–60. Epub 2020/03/20. https://doi.org/10.23750/abm.v91i1.9397 PMID: 32191675.

3. Petrosillo N, Viceconte G, Ergonul O, Ippolito G, Petersen E.COVID-19, SARS ja MERS: kas need on omavahel tihedalt seotud? Clin Microbiol Infect. 2020; 26(6):729–34. Epub 2020/04/03. https://doi.org/10.1016/j. cmi.2020.03.026 PMID: 32234451; PubMed Central PMCID: PMC7176926.

4. Meditsiin JHU. Coronavirus Resource Center 2021. Saadaval aadressil: https://coronavirus.jhu.edu/.

5. Marshall M. Koronaviiruse kaugvedajate kestev viletsus. Loodus. 2020; 585 (7825): 339–41. Epub 2020/09/16. https://doi.org/10.1038/d41586-020-02598-6 PMID: 32929257.

6. Gupta A, Madhavan MV, Sehgal K, Nair N, Mahajan S, Sehrawat TS jt. Kopsuvälised ilmingudCOVID-19. Nat Med. 2020; 26(7):1017–32. Epub 2020/07/12. https://doi.org/10.1038/s{10}} PMID: 32651579.

7. Nikolich-Zugich J, Knox KS, Rios CT, Natt B, Bhattacharya D, Fain MJ.SARS-CoV-2jaCOVID-19vanematel täiskasvanutel: mida võime oodata patogeneesi, immuunvastuste ja tulemuste osas. Geroscience. 2020; 42(2):505–14. Epub 2020/04/11. https://doi.org/10.1007/s{10}} PMID: 32274617; PubMed Central PMCID: PMC7145538.

8. WHO. Teave pediaatriliste tervishoiuteenuste osutajatele 2021. Saadaval aadressilt: https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/hcp/pediatric-hcp.html.

9. Fu Y, Cheng Y, Wu Y. MõistmineSARS-CoV-2- Vahendatud põletikulised reaktsioonid: mehhanismidest potentsiaalsete ravivahenditeni. Virol Sin. 2020; 35(3):266–71. Epub 2020/03/04. https://doi.org/ 10.1007/s{11}} PMID: 32125642; PubMed Central PMCID: PMC7090474.

Märge:ülaltoodud ei ole täielik viidete loend