Kuidas Cistanche ekstrakt vähendab põletikulist hüperplaasiat
Mar 17, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com
Põletikulise hüperplaasia vähendamine soolestikus käärsoolevähki kalduvatel hiirtel Cistanche deserticola vesiekstrakti abil
Yamin Jia,1,2 et al
Cistanchedeserticola't on traditsioonilises hiina meditsiinis tavaliselt kasutatud paljude terviseprobleemide, sealhulgas ärritunud soole sündroomi või kõhukinnisuse raviks. Selle uuringu eesmärk oli testida C. deserticola vesiekstrakti efektiivsust kolorektaalse vähi ennetamisel hiiremudelil. C. deserticola polüsahhariididerikas vesiekstrakt valmistati selle tüvepulbri keetmisel destilleeritud vees. Eksperimentaalse mudelina kasutati Tgfb1Rag2 nullhiiri. Siin näitasime, et C. deserticola vesiekstraktiga toitmine vähendas oluliselt limaskestade arvuhüperplaasiaja soole Helicobacter infektsioon hiirtel. See kasulik toime korreleerus immuunsüsteemi olulise stimuleerimisega, mida tõendab põrna suurenemine koos põrna makrofaagide ja looduslike tapjarakkude arvu suurenemisega ning splenotsüütide tugevama tsütotoksilisusega. C. deserticola in vitro veeekstrakt suurendas naiivsete splenotsüütide tsütotoksilisust inimese käärsoolevähi rakuliini suhtes ning makrofaagide kultuurides reguleeris lämmastikoksiidi süntaasi II ekspressiooni ja stimuleeris fagotsütoosi. Kokkuvõttes näitavad meie andmed, et C. deserticola ekstrakti suukaudne manustamine vähendabpõletikulinehüperplastilinepolüübid ja helicobacter infektsioon hiirtel selle immuunstimuleeriva toime tõttu, mis viitab sellele, et C. deserticola ekstraktil võib olla potentsiaal ennetada soolepõletikke, sealhulgas kolorektaalset vähki. Autoriõigus © 2011 John Wiley & Sons, Ltd.
Märksõnad: taimne immunomodulatsioon;Cistancheväljavõte; polüsahhariidid; helikobakter;põletikulinehüperplaasia; pärasoolevähk.
Cistancheväljavõtesaab vähendadaPõletikulinehüperplaasia
SISSEJUHATUS
Kolorektaalne vähk on maailmas kolmandal kohal meestel ja teisel kohal naistel ning neljandal kohal (8 protsenti kõigist vähisurmadest; Ferlay et al., 2010). Epidemioloogilised uuringud näitavad, et paljud selle haigusega seotud riskitegurid, sealhulgas geneetilised (nt käärsoolevähi perekonna ajalugu) (Strate ja Syngal, 2005) ja toitumistegurid (nt punane liha ja kiudainevaesus; Chao et al., 2005; Park et al. al., 2005) japõletikulinesoolehaigused (IBD; Eaden et al., 2001; von Roon jt, 2007; Lukas, 2010). Vaatamata paljudele uutele tsütotoksilistele ravimitele ning täiustatud kirurgilistele ja kiiritusravi tehnikatele, mida selle haiguse raviks kasutatakse (Cunningham et al., 2010), on suur osa kolorektaalse vähiga patsientidest siiani ravimatu; 2008. aastal suri maailmas selle haiguse tõttu hinnanguliselt umbes 608 000 surma (Ferlay et al., 2010). Seetõttu on vaja uudseid ravimeetodeid ja üks kandidaat on immunoteraapia. Kolorektaalse vähi raviks on hinnatud erinevaid immunoterapeutilisi lähenemisviise ja senised tulemused on julgustavad (Burgdorf et al., 2009). On näidatud, et taimsetel polüsahhariididel on spetsiifiline immunoregulatoorne toime (Jiang et al., 2010), mis viitab sellele, et neid taimseid tooteid saab kasutada spetsiifilise immunostimuleeriva adjuvandina kolorektaalse vähi vastu.
Cistanchedeserticola Ma, mida Hiina ravimtaimedes tuntakse Rou Cong Rong nime all, on lisatud paljude terviseprobleemide, sealhulgas impotentsuse, haigusliku leukorröa ja ärritatud soole sündroomi/kõhukinnisuse ravimtaimede koostisesse (Jiang ja Tu, 2009). Eksperimentaalsed uuringud on näidanud C. deserticola erinevate ekstraktide erinevat bioloogilist aktiivsust; selle taime fenüületanoidglükosiidide ekstraktil on hiirtel väsimusvastane toime (Cai et al., 2010) ning valuvaigistav ja anti-põletikulinemõju närilistele (Lin et al., 2002), samas kui selle polüsahhariidid stimuleerivad T- ja B-lümfotsüütide proliferatsiooni lümfotsüütide kultuurides (Wu et al., 2005; Dong et al., 2007). Siiski ei ole C. deserticola polüsahhariidide ekstrakti efektiivsust immuunvastuse stimuleerimisel in vivo veel uuritud.
Rag2-/-hiirtel puuduvad küpsed T- ja B-lümfotsüüdid ning segatud taustal (~97 protsenti 129 S6 ja ~3 protsenti CF-1) tekivad spontaanselt põletikuga seotud haigused.hüperplaasiasoolestikus (Engle et al., 1999). Tgfb1 (transformeeriv kasvufaktori b1 (TGF-b1) geen) nullalleeli geneetiline sisestamine sellesse hiirte tüve põhjustab hiirte edasist progresseerumist.hüperplaasiaadenoomile ja kartsinoomile (Engle et al., 2002) ning käärsoolevähi tekkeks on vajalik patogeenne mikrofloorast sõltuv koliit (Engle et al., 2002), mis viitab sellele, et see hiiretüvi on ideaalne mudel võimaliku ravi uurimine põletiku/IBD-indutseeritud kolorektaalse vähi ravis. Selles uuringus demonstreerime esimest korda C. deserticola polüsahhariididerikka vesiekstrakti efektiivsustpõletikulinehüperplaasiaselles mudelis.
MATERJALID JA MEETODID
C. deserticola preparaadi polüsahhariididerikas vesiekstrakt.
Herbal C. deserticola korjas dr Y. Guo (Hiina Põllumajandusülikool) Hiinas Sise-Mongoolia autonoomses piirkonnas. Tervete kuivatatud varte pulbrit (300 g) keedeti topeltdestilleeritud vees kaks korda: esmalt 1 tund 500 ml vees, seejärel supernatandi kogumine, seejärel 45 minutit 400 ml vees. Supernatandid filtriti pärast iga keetmist läbi Whatmani filterpaberi (keskmiselt kiiresti) ja ühendati. Ekstrakti lahus kuivatati lüofiliseerimisega ja hoiti temperatuuril 80 °C. Lõppsaadus oli umbes 10 g (saagis: ~3%).
Hiired ja rakukultuurid. TGF-b1 puudulikkusega hiired (Tgfb1 pluss /- Rag2-/-) segatud taustal (~97 protsenti 129 S6 ja ~3 protsenti CF-1) saadi aretuskolooniast, mida peeti Jack Belli uurimiskeskuse (Vancouver, BC) loomakasvatusasutuses patogeenivabades tingimustes. Need hiired pärinesid Mouse Models of Human Cancers Consortium (MMHCC) hoidlast (National Cancer Institute at Frederick, MD, USA). C57BL/6 J (B6) hiired (isased, 8–10 nädala vanused) osteti Jacksoni laborist (Bar Harbor, ME, USA). Kõik katseloomad peeti pärast võõrutamist 4 nädala vanuselt tavapärases pidamises ja dieedis (5001 näriliste dieet, LabDiet) ning taimne ravi ja proovide võtmine viidi läbi vastavalt Kanada loomahooldusnõukogu juhistele.
protokollid, mille on heaks kiitnud Briti Columbia ülikooli loomade kasutamise allkomitee.
Nii inimese käärsoole adenokartsinoomi rakuliini SW480 kui ka hiire leukeemiliste makrofaagide rakuliini RAW 246.7 kasvatati Dulbecco modifitseeritud Eagle'i söötmes (DMEM, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), mis sisaldas 10 protsenti veise looteid. seerum (FBS) (täielik DMEM sööde) temperatuuril 37-C niisutatud 5% CO2/95% õhuga inkubaatoris. Splenotsüüdid eraldati põrna fragmentide õrnalt purustades fosfaatpuhverdatud soolalahuses (PBS), millele järgnes erütrotsüütide eemaldamine lüüsipuhvriga (0,15 M NH4Cl, 1,0 mM KHCO3, 0,1 mM EDTA, pH 6,8). Pärast uuesti pesemist PBS-iga suspendeeriti splenotsüüdid RPMI 1640 söötmes, millele oli lisatud 10 protsenti FBS-i (täielik RPMI sööde).
Cistancheväljavõtesaab vähendadaPõletikulinehüperplaasia
Ekstrakti ravi.
Taimeekstrakt, nnCistancheväljavõteselles uuringus valmistati lõpuks kuivatatud pulbri lahustamisel steriliseeritud topeltdestilleeritud veega ja see sisaldas 2–3 massiprotsenti fenüületanoide, 65–7{5}} massiprotsenti polüsahhariide ja 0,6–1 massiprotsenti (w/w) valgu baasil järgmistel analüüsidel: fenüületanoidide arv määrati neeldumise järgi 332 nm juures, kasutades eelnevalt kirjeldatud spektrofotomeetriat (Ouyang et al., 2005); polüsahhariidide sisaldust mõõdeti standardse fenoolväävelhappe meetodil (Dubois et al., 1956) pärast etanooliga sadestamist; ja valk määrati Bio-Rad valguanalüüsiga, järgides tootja protokolli (Bio-Rad Lab, Hercules, CA, USA). Meie pilootuuringu põhjal oli Cistanche ekstrakti annus 0,4 g/kg/päevas. Keskmine veetarbimine täiskasvanud hiire kohta päevas oli ligikaudu 4 ml ja kui 1 ml joogivett sisaldas 3 mgCistancheväljavõte, manustati igale hiirele suukaudselt 12 mg ekstrakti päevas. Lähtudes asjaolust, et täiskasvanud hiire keskmine kehakaal oli 30 g, sisaldab joogivesi 3 mg/mL.Cistancheväljavõteandis hiirtele annuse 0,4 g/kg/päevas. Hiirtele manustati joogivett ad labium, mis sisaldas 3 mg/mlCistancheväljavõtemida täiendati vähemalt kord kahe päeva jooksul, alates kahe kuu vanusest kolme kuu jooksul loomahoiuasutuse tavaruumis.
Kolorektaalse vähi histoloogiline klassifitseerimine.
Kolmekuulise ravi lõpus koguti nii peensoole kui ka jämesoole kuded ja avati pikisuunas, millele järgnes sisu õrna loputamisega PBS-iga. Igalt hiirelt koguti kokku kuus tükki (igaüks 2 cm pikk) soolekudet: kolm peensoolest proksimaalses, keskmises ja distaalses kohas; kaks jämesoolest proksimaalsetes ja distaalsetes kohtades ning üks pimesoolest. Kõik koed fikseeriti 10-protsendilises formaliinis ja sisestati parafiini. Iga sektsioon värviti kolorektaalse vähi histoloogiliseks määramiseks hematoksüliini ja eosiiniga (HE). Haiguse klassifitseerimine viidi läbi vastavalt patoloogilistele tunnustelehüperplaasia, adenoom või kartsinoom igas proovis, nagu eelnevalt kirjeldatud (Engle et al., 1999) pimetestis. Iga patoloogilise muutuse koguarv (hüperplaasia, adenoom ja kartsinoom) loendati iga hiire kahes soolekoe osas.
Cistancheväljavõtesaab vähendadaPõletikulinehüperplaasia
Helicobacter hepaticus'e (H. hepaticus) tuvastamine hiire väljaheites.
Et uurida mõjuCistancheväljavõtepatoloogilise mikrofloora kasvu soolestikus, H. hepaticus roojas määrati polümeraasi ahelreaktsiooni (PCR) abil liigispetsiifiliste 16S rDNA praimeritega, nagu eelnevalt kirjeldatud (Shames et al., 1995). Ligikaudu 200 mg värsket väljaheidet lahustati 1 μL PBS-s ja inkubeeriti 50 kraadi juures 30 minutit, millele järgnes tsentrifuugimine kiirusel 8000 p/min 10 minutit. Supernatant (200 ml) koguti ja segati võrdse koguse proteinaas K lahusega, mis sisaldas 5% (maht/maht) 18,7 mg/ml proteinaas K lahust (Fermentas Canada, Burlington, ON, Kanada) seedepuhvris (50 μM Tris-HCl, pH 8,0, 0,1 M EDTA, 0,5 protsenti naatriumdodetsüülsulfaati) ja inkubeeriti 70 °C juures 30 minutit. Saadud lahuses olev DNA ekstraheeriti QIAprep Miniprep komplektiga, järgides tootja protokolli (QIAGEN, Mississauga, ON, Kanada).
Bakteriaalse DNA polümeraasi ahelreaktsiooni amplifikatsioon viidi läbi segus, mis sisaldas {{0}},75 μL 10 PCR puhvrit, 0,5 μL 50 mM. MgCl2, 0,5 μL iga praimerit (senss: 5'-GCA TTT GAA ACT GTT ACT CTG; antisenss: 5'-GGG GAGCUUGAAAACAG, igaüks 100 mM), 0,5 μL Taq polümeraasi, 18,75 μL H2Ocle- ja nukleaasivaba 1 μL kvantifitseerimata väljaheidete DNA lahust. PCR-i segu kuumutati 94 kraadi juures 5 minutit, millele järgnes 40 denatureerimistsüklit 94 kraadi juures 1 min, lõõmutamist 55 kraadi juures 1,25 minutit ja pikendamist 72 kraadi juures 1,5 minutit. PCR lõpetati pikenemisetapiga 10 minutit 72 kraadi juures. Saadud PCR-produkt (25 µl) allutati elektroforeesile 1-protsendilisel agaroosgeelil Tris-atsetaat-EDTA (TAE) puhvris, mis sisaldas 0,5 mg/ml etiidiumbromiidi, ja visualiseeriti UV-valguses.
Makrofaagide ja looduslike tapjarakkude (NK) määramine.
Makrofaagide ja NK-rakkude protsendid splenotsüütide suspensioonis määrati fluorestsents-aktiveeritud rakkude sorteerimise (FACS) analüüsiga. Miljonit FACS-puhvris olevat splenotsüüti inkubeeriti sobivate antikehade kombinatsiooniga jääs erinevate rakkude fenotüüpide jaoks: anti-CD3-fluorestseiini isotiotsüanaat (FITC) ja anti-CD49b-fükoerütriin (PE) (BD Biosciences, Mississauga, ON, Kanada) CD3 CD49b pluss NK-rakkude jaoks ja roti hiirevastane F4/80 plus primaarse antikehana ja anti-roti IgG-FITC sekundaarse antikehana (eBioscience, San Diego, CA, USA) F4/80 pluss makrofaagide jaoks. Iga rakutüübi fluorestsentsi intensiivsust mõõdeti voolutsütomeetria abil ja analüüsiti taustakontrollidega, kasutades tarkvara CELLQUEST (BD Biosciences).
Kaltseiin-atsetoksümetüül (kaltseiin-AM) tsütotoksilisuse test.
Efektor-slenotsüütide lüütilist aktiivsust sihtmärk-SW480 rakkude suhtes hinnati kaltseiin-AM tsütotoksilisuse testiga, kasutades kaaskultuurisüsteemi, nagu eelnevalt kirjeldatud (Neri et al., 2001). Lühidalt, SW480 rakud märgistati fluorestseeruva värvainega calcein-AM järgmiselt: 1 x 106rakke/ml SW480 rakke täielikus DMEM söötmes inkubeeriti 15 µM kaltseiin-AM-ga 37 kraadi juures, aeg-ajalt loksutades. Pärast 30-minutilist inkubeerimist pesti rakke põhjalikult täieliku DMEM söötmega, et eemaldada rakuväline värv. Fluorestsentsvärviga märgistatud SW480 rakud täielikus DMEM söötmes (0,2 x 106rakud/{{0}},25 ml/süvend) külvati 24-süvendiga plaatidele. Põhineb erinevatel suhetel (12:1, 6:1, 3:1 ja 1,5:1) E (efektor): T (sihtmärk), splenotsüüdid 0,25 ml täielikus RPMI söötmes süvendi kohta lisati sihtrakkudega süvenditesse kolmes eksemplaris. Kaaskultuure inkubeeriti 37 kraadi juures 5% CO2-s 24 tundi. Supernatandid koguti pärast plaadi tsentrifuugimist kiirusel 2000 p/min 5 minutit. Kaltseiin-AM vabanemine supernatanti määrati mikroplaadi spektrofluorimeetri (Fluoroskan Ascent FL, Thermo Labsystems) abil emissioonil 527 nm ergastuse ajal 485 nm juures. Sihtrakke, mida inkubeeriti 0,25 ml täieliku DMEM söötme ja 0,25 ml täieliku RPMI söötme seguga, kasutati tausta- või spontaanse vabanemise kontrollina ning 2 protsendi juuresolekul kasutati Triton X{29}}. maksimaalse vabastamise juhtnupud. Splenotsüütide tsütotoksilisus arvutati järgmiselt:
Lämmastikoksiidi (NO) mõõtmine. Rakkudest sekreteeritud lämmastikoksiid oksüdeeruti söötmes kiiresti nitritiks. Seetõttu määrati nitraatide kontsentratsioon söötmes NO tootmise mõõtmiseks Griessi meetodil. RAW264.7 lahtrid (0,25 x 106
rakke süvendi kohta 0,5 ml täielikus DMEM söötmes) 24-süvendi plaatidel stimuleeritiCistancheväljavõte(50–200 mg/ml) ja lipopolüsahhariidi (LPS) (10 ng/mL) positiivse kontrollina. Pärast 24-tunnist töötlemist segati esmalt 50 ml kultuuri supernatanti 50 ml 1% lahusega.
sulfaniilamiid 5% fosforhappes 96-süvendiplaatidel kolmes eksemplaris ja inkubeeriti 1 0 min, seejärel lisati igasse süvendisse 50 ml 0,1% naftüületüleendiamiindivesinikkloriidi destilleeritud vees. Pärast 10-minutilist inkubeerimist loeti neeldumine lainepikkusel 550 nm ja NO/nitriti tase arvutati standardkõvera abil teadaolevate naatriumnitriti kontsentratsioonidega.
Cistancheväljavõtesaab vähendadaPõletikulinehüperplaasia
Western blot.
Lämmastikoksiidi süntaasi II (NOS 2 või iNOS) taset rakus uuriti Western blot meetodil, nagu eelnevalt kirjeldatud (Du et al., 2006). Lühidalt, valguproovid (ligikaudu 100 mg proovi kohta) fraktsioneeriti 7% SDS-PAGE-ga ja kanti üle nitrotselluloosmembraanile. NOS II valguribad identifitseeriti küüliku primaarse polüklonaalse anti-NOS II antikehaga (N-20) (1:500 lahjendus; Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, CA, USA) ja sekundaarse kitse küülikuvastase IgG antikehaga ( 1:10000 lahjendus; Vector Laboratory, Burlingame, CA, USA). NOS II valgu-antikeha kompleks visualiseeriti täiustatud kemoluminestsentsanalüüsiga (ECL, Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, Inglismaa). Blotid analüüsiti uuesti, kasutades anti-b-aktiini IgG-d (Sigma-Aldrich Kanada, Oakville, ON, Kanada), et kinnitada igas proovis laetud valku.
Fagotsütoosi analüüs. Fagotsütoosi mõõdeti RAW264.7 rakkude poolt neelatud fluorestsentsmärgistatud latekshelmeste (SigmaAldrich Kanada, L-3030, L-3030, karboksülaadiga modifitseeritud, keskmine suurus 2 mm) koguse järgi, nagu eelnevalt kirjeldatud (Wu et al., 2{{). 9}}07). Lühidalt, täielikus DMEM söötmes olevad RAW264.7 rakud (0,1 x 106 rakku/0,5 ml süvendi kohta) külvati 24-süvendiga plaatidele ja stimuleeriti 100 mg/mlCistancheväljavõtevõi täitke DMEM sööde ainult kontrollina. Pärast üleöö stimuleerimist lisati makrofaagide kultuuridele 2,5 ml fluorestseeruvaid latekshelmeid süvendi kohta ja inkubeeriti 2 tundi. Voolutsütomeetria analüüsiks eraldati rakud pärast PBS-s pesemist pipetiga ja fagotsütaarsete rakkude fluorestsentsi intensiivsust mõõdeti voolutsütomeetriga ja analüüsiti võrdluses taustkontrollidega (ilma helmeid), kasutades tarkvara CELLQUEST (BD Biosciences).
Statistiline analüüs.
Andmed esitati keskmise pluss-standardhälbena (SD). Andmete võrdlemiseks rühmade vahel viidi läbi dispersioonanalüüs (ANOVA) või Studenti t-test. Oluliseks peeti p-väärtust <>
TULEMUSED
Ravi koosCistancheväljavõtevähendab sagedusthüperplaasiaja H. hepaticus sooleinfektsioon Raviperioodi jooksul (3 kuud) jälgiti iga 2 päeva järel ekstraktiga töödeldud hiirte ja kandjaga ravitud rühma hiirte kehakaalu ja joogivee tarbimist, olulist erinevust ei täheldatud. märgitud (andmeid pole näidatud). Histoloogiline analüüs näitas aga, et suukaudsel manustamiselCistancheväljavõttedarvu oluliselt vähendanudpõletikulinehüperplaasiasoolestikus (joonis 1), mida tõendab asjaolu, et ekstraktiga vett saanud hiirtel oli neid vähemhüperplaasia(5.00 pluss -2.83/hiir, n=15) kui need, kes joovad puhast vett või sõidukit (7,53 pluss -3.09/hiir, n {{9) }}) (väljavõte vs. sõiduk: p=0.0133, t-test). Erinevus adenoomide ja kartsinoomide arvus ekstrakti ja vehiikuliga töödeldud hiirte vahel ei olnud statistiliselt oluline, kuna ainult mõnel hiirel olid need patoloogiliste muutuste etapid (andmeid pole näidatud).
Joonis 1. Hüperplaasia esinemissageduse vähendamine C. deserticola vesiekstraktiga töötlemisel (Cistancheväljavõte). Tgfb1 pluss /-Rag2-/- hiiri toidetiCistancheväljavõtejoogivees (Ekstrakti rühm) võrreldes nendega, kus kasutati ainult puhast joogivett (sõidukirühm). Vähikahjustusi soolestikus uuriti histoloogiliselt H&E plekiga. (A) Tüüpiline pilt tervest koest. (B) Tüüpiline hüperplaasia pilt jaotises, mis on näidatud noolega. (C) Hüperplaasia arv iga looma soolestikus loendati histoloogiliselt (p=0.0133, ekstrakt versus kandja, n=15). See joonis on värvilisena saadaval veebis aadressil wileyonlinelibrary.com/journal/ptr
On näidatud, et soolestiku mikroobide sisaldus, eriti H. hepaticus'e infektsioon, on vajalik käärsoolevähi kõikide staadiumite, sealhulgas Rag2 hüperplaasia tekkeks-/- hiired (Engle et al., 2002; Erdman et al., 2003). Et uurida, kas ravi koosCistancheväljavõttedsoolestiku patoloogilise mikrofloora vähenemine, H. hepaticus'e esinemine ravitud hiirte väljaheitesCistancheväljavõtemäärati PCR-ga võrreldes vehiikli kontrollidega. Igas katses töödeldi kolme hiirt puuri kohta Cistanche ekstrakti või kandjaga. Väljaheiteproovid koguti 14-tunnise üleööperioodi lõpus pärast puuri puhastamist. Nagu on näidatud joonisel fig 2, tuvastati väljaheites H. hepaticus 16S rDNA tõhusalt PCR tehnikaga. Kolmes eraldi katses (tabel 1) oli ainult 20–40 protsenti proovidest päritCistanche-väljavõte-ravitud hiired tuvastati PCR-positiivsetena, samas kui 60–80 protsenti vehiiklikontrollidest olid positiivsed (ekstrakt vs. vehiikul: p=0.0189, t-test, n=3), mis viitab sellele, et ravi Cistanche ekstrakt vähendas hiirtel soolestiku H. hepaticus'e infektsiooni.
Ravi Cistanche ekstraktiga suurendab põrna makrofaagide ja NK-rakkude arvu
Immuunvastus mängib võtmerolli helikobakteri infektsiooni kõrvaldamisel. Et uurida, kasCistanche väljavõteravi mõjutas nende käärsoolevähile kalduvate hiirte immuunsüsteemi, põrna suurus (igas rühmas 12 hiirt) ja splenotsüütide arv (igast rühmast juhuslikult valitud kuus hiirt) määrati ravi lõpus. Igas rühmas kaaluti 12 hiire põrnad, ülejäänud kolme esialgses katses osalenud hiirt ei kaasatud. Nagu on näidatud tabelis 2,Cistanche-väljavõte-ravitud hiired (0.055 pluss -0,022 g põrna kohta) olid raskemad kui kandjarühmas (0,038 pluss -0,01 g põrna kohta; ekstrakt vs. sõiduk: p=0.04, t-test). Neid andmeid toetas veelgi splenotsüütide arvu suurenemine hiirtel, keda ravitiCistancheväljavõte, mida tähistab 7.095 pluss -1.353 (x106 rakud/põrn) võrreldes 2,941 pluss -1,492 (x10)6rakud/põrn) kandjasisesed kontrollhiired (ekstrakt vs. vehiikul: p=0.002, t-test).
Edasiseks hindamiseks, kasCistancheväljavõteravi mõjutas hiirtel teatud splenotsüütide alatüüpi, põrna NK-rakkude arvu (CD3-CD49bplussrakud) ja makrofaagid (FT/80plussrakud) loendati FACS analüüsiga. CD3 protsent-CD49bplussrakud splenotsüütidesCistanche-väljavõte-ravitud hiired (32,06 pluss -2,13 protsenti) ei erinenud oluliselt kandjaga töödeldud hiirte omadest (28,47 pluss -2,74 protsenti; ekstrakt vs. vehiikul: p=0). 3741, t-test, n=6), kuid NK-rakkude koguarv põrnasCistanche-väljavõte-ravitud hiired (2,22 pluss - 0.44x106/põrn) oli kõrgem kui sellel sõidukisisesel kontrollrühmal (0.83 pluss -0.17x106/põrn; väljavõte vs. sõiduk: p=0.01, t-test, n=6; joonis 3B). Sarnaseid tulemusi saadi ka põrna FT/80 pluss rakkude uurimisel; nagu põrna NK-rakkude populatsioonis, põrna FT/80 pluss rakkude protsendi erinevus ekstraktiga töödeldud hiirte (35,25 pluss -7,28 protsenti) ja vehiikli kontrollhiirte (31,74 pluss -5) vahel. 07 protsenti ) ei olnud oluline (ekstrakt vs. vehiikul: p=0.407, n=6), kuid põrna makrofaagide koguarv ekstraktiga töödeldud rühmas (2,439 pluss -0 .452x106rakud/põrn) oli suurem kui kontrollrühmades (1,114 pluss -0,685 x 106rakud/põrn; väljavõte vs. sõiduk: p=0.001, t-test, n=6; joonis 3D). Kokkuvõttes näitavad need andmed, et ravi koosCistancheväljavõtevõib suurendada põrna efektor-slenotsüütide, NK-rakkude ja makrofaagide alatüüpide koguarvu, kuid mitte protsenti ega osakaalu.
Joonis 3. Põrna NK-rakkude ja makrofaagide arvu suurenemine töötlemiselCistancheväljavõte. NK-rakud või makrofaagid splenotsüütide suspensioonis määrati FACS-analüüsiga FITC-anti-CD3e-antikeha ja APC-anti-CD49b/Pan-NK-rakumarkeri (NK-rakkude jaoks) kombineeritud värviga või ühe FITC-vastase värviga. FT/80 (makrofaagide jaoks). (A) Tüüpiline graafik põrna NK-rakkude protsendi kohta (CD3-CD49bpluss) ravitud hiirte splenotsüütidesCistancheväljavõtesõiduki vastu. (B) NK-rakkude koguarv põrna kohta. Andmed on esitatud kui keskmine pluss -SD igas rühmas (p= 0.01, n= 6). (C) Tüüpiline graafik põrna makrofaagide (FT/80 pluss) protsendi kohta nende hiirte splenotsüütides, keda ravitiCistancheväljavõtesõiduki vastu. (D) Makrofaagide koguarv põrna kohta. Andmed on esitatud kui keskmine pluss -SD igas rühmas (p= 0.001, n=6).
Töötlemine Cistanche ekstraktiga stimuleerib splenotsüütide tsütotoksilisust in vivo ja in vitro
Immuunvastus ei sõltunud mitte ainult splenotsüütide arvust, vaid ka nende funktsioonist, näiteks tsütotoksilisusest. MõjuCistancheväljavõtesplenotsüütide funktsiooni ravi (st tsütotoksilisust) uuriti kaaskultuurides SW480 rakkudega. Nagu on näidatud joonisel 4A, on splenotsüütide tsütotoksilisus hiirtelt, keda ravitiCistancheväljavõteoli kõrgem kui vehiikuliga töödeldud hiirte rakkudel, mida näitab 39,38 pluss -2,64 protsenti kaltseiin-AM vabanemisest ekstraktiga töödeldud splenotsüütide ja SW480 rakkudega kooskultuurides 6. :1 suhe, 51,11 pluss -2,6 protsenti suhtega 3:1 ja 57,33 pluss -2,53 protsenti suhtega 1,5:1, võrreldes 27-ga.75- 0.18 protsenti vehiikuliga töödeldud splenotsüütide ja SW480 rakkude kaaskultuurides suhtega 6:1, 40.97 =-2.85 protsenti suhtega 3:1 ja 45,16 pluss -0,18 protsenti 1,5:1 suhe (ekstrakt vs. vehiik: p < 0,0001,="" kahesuunaline="" anova).="" stimuleeriva="" toime="" täiendavaks="">Cistancheväljavõtesplenotsüütide tsütotoksilisuse kohta, tsütotoksilisusCistanche-väljavõteB6 hiirte ravitud naiivseid splenotsüüte, mis sisaldasid funktsionaalseid T- ja B-rakke, uuriti kooskultuurides SW480 rakkudega. Nagu on näidatud joonisel 4B, lisatakseCistancheväljavõte(100 mg/mL) suurendas oluliselt kaltseiin-AM vabanemist kaaskultuurides splenotsüütidest sõltuval viisil: 57,64 pluss -3,41 protsenti suhtega 12:1, 52,25 pluss { {11}},77 protsenti suhtega 6:1 ja 45,72 pluss -2,43 protsenti suhtega 3:1, võrreldes 14,36 pluss -0,05 protsendiga suhtega 12:1 , 20,67 pluss -2,03 protsenti suhtega 6:1 ja 23,1 pluss -3,73 protsenti suhtega 3:1 stimuleerimata kaaskultuurides (ekstrakt vs. kandja: p < 0,0001,="" kaks="" -viisi="" anova).="" need="" tulemused="" näitavad,="">Cistancheväljavõtestimuleerib splenotsüütide lüütilist aktiivsust. Põhjus, miks tsütotoksilisus vähenes, kui lisati rohkem efektor-slenotsüüte, pole teada. Üks võimalus oli see, et kaltseiin-AM vabanemise tase selles kaaskultuurisüsteemis ei pruugi täpselt kajastada sihtrakkude surma, kuna kaltseiin-AM võivad pärast pikka inkubatsiooniperioodi efektor-slenotsüütide poolt uuesti imenduda.
Cistanche ekstrakt aktiveerib makrofaage
Makrofaagide aktiveerimine on üks kriitilisi immuunvastuseid nakkuse ja kasvaja arengu vastu (Mantovani et al., 2002, 2008). Et veelgi paljastada ülevaadet mehhanismidest, mille abilCistancheväljavõteravi vähendas soole hüperplaasia ja mikroobide sisaldust, mõjuCistancheväljavõteNO produktsiooni ja makrofaagide fagotsütoosi kohta uuriti RAW264.7 rakke. Nagu on näidatud joonisel 5A, oli NOS II valgu ekspressioon pärast inkubeerimist kultuurides ülesreguleeritud.Cistancheväljavõte. Neid tulemusi toetas veelgi NO tootmise suurenemine aastalTistanche ekstraktiga stimuleeritudkultuurid (joonis 5B), mida tõendab 3,88 pluss -0,13 mM nitritit 50 mg/mlCistancheväljavõtestimuleeritud RAW264.7 rakukultuurid võrreldes 0,11 pluss -0,12 mM nitritiga stimuleerimata kontrollkultuurides (ühesuunaline ANOVA, p<>
Fagotsütoos on rakuline protsess tahkete osakeste, näiteks bakterite neelamiseks. Nagu on näidatud joonistel 5C ja D, lisatakseCistancheväljavõttedstimuleeritud makrofaagide fagotsütoos, mida näitab rohkem fagotsüütrakke (9,8 pluss -0,1 protsenti)Cistanche-väljavõte-stimuleeritud makrofaagide kultuurid võrreldes kandjaga stimuleeritud kultuuride kultuuridega (5,2 pluss -0,4 protsenti ) (ekstrakt vs. vehiikul: p=0.0007, t-test, n=3) pärast 2-tunnist inkubeerimist. Need andmed viitavad selleleCistancheväljavõtevõib otseselt aktiveerida makrofaage, reguleerides kohalikku NO tootmist ja stimuleerides makrofaagide fagotsütoosi hiirte soolestikus.
ARUTELU
Käesolev uuring näitab esimest korda, et suukaudne manustamineCistancheväljavõtevähendab oluliselt hüperplaasia ja H. hepaticus'e infektsiooni esinemissagedust käärsoolevähile kalduvate hiirte soolestikus. Kasulik mõjuCistancheväljavõteravi on seotud põrna NK-rakkude ja makrofaagide arvu ja tsütotoksilisuse suurenemisega. In vitro lisamineCistancheväljavõtestimuleerib NO tootmist ja fagotsütoosi makrofaagides. TGF-b1 puudulikkusega Rag2-/-on näidatud, et hiirtel areneb käärsoolevähk (hüperplaasia, adenoom või adenokartsinoom) vanuses 3 kuni 6 kuud ja on näidatud, etpõletikulinekoldeid seostatakse alati nende tuumorigeensete kahjustustega (Engle et al., 1999). Täiendavad uuringud on näidanud, et nendel hiirtel on patogeense mikroobse floora nakkuse esinemiseks vajalik käärsoolevähi teke, kuna käärsoolevähk elimineeritakse täielikult hiirte hoidmisel mikroobivabades tingimustes (Engle et al., 2002) ja H. hepaticus. infektsioon kutsub esile ka koliidi ja jämesoole kartsinoomi Rag2-s-/-hiired (Erdman et al., 2003). Samamoodi on inimestel mikroobide staatus ja peremeesorganismi immuunsus IBD progresseerumise võtmetegurid (Fiocchi, 1998) ning on teatatud, et maokartsinoom on seotud H. pylori põhjustatud kroonilise infektsiooni või põletikuga (Parsonnet et al., 1991; El-Omar ja Malfertheiner, 2001). Nende uuringute tulemused näitavad, et seedetrakti infektsioon võib mängida käärsoolevähi tekkes keskset rolli. Seega võib seedetrakti infektsioonide sihtimine saada terapeutiliseks strateegiaks käärsoolevähi ja IBD ennetamiseks või raviks. Meie uuring näitab esimest korda, et suukaudne manustamineCistancheväljavõtevähendab sagedustpõletikulinehüperplaasiasoolestikus ja H. hepaticus'e arv väljaheites TGF-b1 puudulikkusega hiirtel. Kasulik mõjuCistanche väljavõtevõib olla tingitud selle makrofaagide aktiveerimisest, mida näitab nii NO tootmise kui ka fagotsütoosi suurenemine pärast raviCistancheväljavõte(joonis 5), mis võib piirata soole patogeenset mikrofloorat, sealhulgas helikobakterit (Mantovani et al., 2002, 2008). Selle tulemusena kahjustuspõletikulinehüperplaasiavähendati.
C. deserticola ekstraktides on tuvastatud mitmesuguseid bioaktiivseid ühendeid, sealhulgas fenüületanoidglükosiide ja polüsahhariide (Jiang ja Tu, 2009). Fenüületanoidglükosiidid on tsütoprotektiivsed, mida näitab asjaolu, et need ühendid takistavad rakusurma kultiveeritud hepatotsüütides ja väikeaju graanulite neuronites (Xiong et al., 1998; Pu et al., 2003). Kuigi polüsahhariidid stimuleerivad mitogeeni poolt indutseeritud T- ja B-lümfotsüütide proliferatsiooni (Wu ja Tu, 2005; Wu et al., 2005; Dong et al., 2007). On hästi dokumenteeritud, et taimsed polüsahhariidid moduleerivad immuunvastust (Jiang et al., 2010).Cistancheväljavõtesisaldab 2–3 protsenti fenüületanoide ja 65–70 protsenti polüsahhariide, mis viitab sellele, etCistancheväljavõteravi võib olla tingitud polüsahhariidide, enamiku Cistanche ekstraktis sisalduvate bioaktiivsete ainete immunoregulatoorsest aktiivsusest. Selle sihtmärk-immuunrakud (nt makrofaagid või NK-rakud või mõlemad) ja molekulaarsed rajad vajavad aga täiendavat uurimist. Lisaks näitab hiljutine uuring, et taimse fenüületanoidatsetoniidi, mis on üks C. deserticola ekstraktis sisalduvatest bioaktiivsetest fenüületanoididest (Xiong et al., 1996; Jiang ja Tu, 2009), manustamine avaldab soodsat mõju dekstraani vähendamisele. sulfaadist naatriumist põhjustatud koliit hiirtel (Hausmann et al., 2007), mis näitab, et fenüületanoidid (2–3 protsenti)Cistancheväljavõtevõib vähemalt osaliselt kaasa aidata selle efektiivsuselepõletikulinehüperplaasia, mis nõuab ka edaspidi hindamist.
Kokkuvõtteks võib öelda, et kolorektaalne vähk on üks levinumaid vähktõbesid kogu maailmas ja on enamikul juhtudel ennetatav. Mittetoksiliste taimeekstraktide kasutamine võib pakkuda tõhusat strateegiat kolorektaalse vähi arengu ennetamiseks ning seda võib kasutada ka kemoadjuvandina, mis võib aidata suurendada kemoterapeutilist vähivastast toimet ja/või vähendada kemoterapeutikumi kõrvalmõjud. Selles uuringus esitatud andmed näitavad selgelt, et töötlemine C. deserticola vesiekstraktiga vähendab hüperplaasiat ja H. hepaticus'e infektsiooni käärsoolevähile kalduvate hiirte soolestikus. Helicobacter infektsioon või soolepõletikhüperplaasiaon kolorektaalse vähi arengu riskitegur. Meie praegune uuring näitab, et selle ürdi kasutamine võib omada potentsiaali kolorektaalse vähi ennetamiseks ja raviks, eriti inimestel, kellel on IBD.
Tunnustus
YM-i toetas Hiina stipendiuminõukogu kraadiõppurite stipendium.
Huvide konflikt
Autoritel ei ole huvide konflikti.
Cistancheväljavõtesaab vähendadaPõletikulinehüperplaasia
Alates: 'VähendusPõletikulineHüperplaasiakäärsoolevähile kalduvate hiirte soolestikus vee ekstraktigaCistanchedeserticola ', autor Yamin Jia,1,2 et al
---Autoriõigus © 2011 John Wiley & Sons, Ltd. Phytother. Res. 26: 812–819 (2012) DOI: 10.1002/ptr.3637
VIITED
Burgdorf SK, Nielsen HJ, Rosenberg J. 2009. Immunotherapy in colorectal cancer. Scand J Gastroenterol 44: 261–268.
Cai RL, Yang MH, Shi Y, Chen J, Li YC, Qi Y. 2010. Fenüületanoidirikka ekstrakti väsimusvastane toimeCistanchedeserticola. Phytother Res. 24: 313–315.
Chao A, Thun MJ, Connell CJ jt. 2005. Liha tarbimine ja kolorektaalse vähi risk. JAMA 293: 172–182.
Cunningham D, Atkin W, Lenz HJ jt. 2010. Jämesoolevähk. Lancet 375: 1030–1047.
Dong Q, Yao J, Fang JN, Ding K. 2007. Kahe külma veega ekstraheeritava polüsahhariidi struktuuriline iseloomustus ja immunoloogiline aktiivsusCistanchedeserticola YC. Ma. Carbohydr Res. 342: 1343–1349.
Du C, Guan Q, Diao H, Yin Z, Jevnikar AM. 2006. Lämmastikoksiid kutsub kaspaasi -8 aktiveerimise kaudu esile apoptoosi neerutuubulite epiteelirakkudes. Am J Physiol Renal Physiol 290: F1044–1054.
Dubois M, Gilles KAJK, Hamilton JK, Rebers PA, Smith F. 1956. Kolorimeetrilised meetodid lähedaste ainete suhkrute määramiseks. Anal Chem. 28: 350-356.
Eaden JA, Abrams KR, Mayberry JF. 2001. Kolorektaalse vähi risk haavandilise koliidi korral: metaanalüüs. Gut 48: 526–535.
El-Omar EM, Malfertheiner P. 2001. Helicobacter pylori ja maovähk. Curr Opin Gastroenterol 17 (lisa 1): S24-S27.
Engle SJ, Hoying JB, Boivin GP, Ormsby I, Gartside PS, Doetschman T. 1999. Transforming growth factor beeta1 supresses nonmetastaatiline käärsoolevähk kasvajageneesi varases staadiumis. Cancer Res. 59: 3379–3386.
Engle SJ, Ormsby I, Pawlowski S jt. 2002. Käärsoolevähi elimineerimine mikroobivabadel transformeerivatel kasvufaktori beeta 1-puudulikel hiirtel. Cancer Res. 62: 6362–6366.
Erdman SE, Poutahidis T, Tomczak M jt. 2003. CD4 pluss CD25 pluss regulatoorsed T-lümfotsüüdid inhibeerivad mikroobselt indutseeritud käärsoolevähki Rag2-puudulikel hiirtel. Am J Pathol 162: 691–702.
Ferlay J, Shin HR, Bray F, Forman D, Mathers C, Parkin DM. 2010. Hinnangud ülemaailmse vähikoormuse kohta 2008. aastal: GLOBOCAN 2008. Int J Cancer 127: 2893–2917.
Fiocchi C. 1998.Põletikulinesoolehaigus: etioloogia ja patogenees. Gastroenterology 115: 182–205.
Hausmann M, Obermeier F, Paper DH jt. 2007. In vivo ravi taimse fenüületanoid-akteosiidiga leevendab soolepõletikku naatriumdekstraansulfaadist põhjustatud koliidi korral. Clin Exp. Immunol. 148: 373-381.
Jiang MH, Zhu L, Jiang JG. 2010. Hiina taimsete ravimite polüsahhariidide immunoregulatoorsed toimed. Expert Opin Ther Targets 14: 1367–1402.
Jiang Y, Tu PF. 2009. Keemiliste koostisosade analüüs aastalCistancheliigid. J Chromatogr A 1216: 1970–1979.
Lin LW, Hsieh MT, Tsai FH, Wang WH, Wu CR. 2002. Antinotsitseptiivne ja anti-põletikulinepoolt põhjustatud tegevusCistanchedeserticola närilistel. J Ethnopharmacol 83: 177–182.
Lukas M. 2010.Põletikulinesoolehaigus kui kolorektaalse vähi riskifaktor. Dig Dis 28: 619–624.
Mantovani A, Allavena P, Sica A, Balkwill F. 2008. Vähiga seotud põletik. Nature 454: 436–444.
Mantovani A, Sozzani S, Locati M, Allavena P, Sica A. 2002. Makrofaagide polarisatsioon: kasvajaga seotud makrofaagid polariseeritud M2 mononukleaarsete fagotsüütide paradigmana. Trends Immunol 23: 549–555.
Neri S, Mariani E, Meneghetti A, Cattini L, Facchini A. 2001. Kaltseiini-atsetoksümetüültsütotoksilisuse test: meetodi standardiseerimine, mis võimaldab täiendavalt analüüsida taastatud efektorrakke ja supernatante. Clin Diagn Lab Immunol. 8: 1131–1135.
Ouyang J, Wang XD, Zhao B, Wang YC. 2005. Täiustatud fenüületanoidglükosiidide tootmineCistanchedeserticola rakud, mida kultiveeriti sisemise ahelaga õhutranspordiga bioreaktoris koos sõelumistoruga. Enzyme Microb Technol. 36: 982-988.
Park Y, Hunter DJ, Spiegelman D jt. 2005. Toidu kiudainete tarbimine ja kolorektaalse vähi risk: tulevaste kohortuuringute koondanalüüs. JAMA 294: 2849–2857.
Parsonnet J, Friedman GD, Vandersteen DP jt. 1991. Helicobacter pylori infektsioon ja maokartsinoomi oht. N Engl J Med 325: 1127–1131.
Pu X, Song Z, Li Y, Tu P, Li H. 2003. Acteoside fromCistanchesalsa pärsib apoptoosi 1-metüül-4-fenüülpüridiiniumi iooni poolt väikeaju graanulite neuronites. Planta Med 69: 65–66.
Shames B, Fox JG, Dewhirst F, Yan L, Shen Z, Taylor NS. 1995. Laialt levinud Helicobacter hepaticus infektsiooni tuvastamine väljaheites kaubanduslikes hiirekolooniates kultuuri ja PCR analüüsi abil. J Clin Microbiol. 33: 2968-2972.
Strate LL, Syngal S. 2005. Pärilikud kolorektaalse vähi sündroomid. Vähi põhjuste tõrje, 16: 201–213.
Von Roon AC, Reese G, Teare J, Constantinides V, Darzi AW, Tekkis PP. 2007. Crohni tõvega patsientide vähirisk. Dis Colon Rectum 50: 839–855.
Wu TF, Hsu CY, Huang HS, Chou SP, Wu H. 2007. Püknogenooli efektide proteoomiline analüüs RAW 264.7 makrofaagis paljastab katepsiin D ekspressiooni indutseerimise ja fagotsütoosi võimendamise. J Agric Food Chem. 55: 9784–9791.
Wu XM, Gao XM, Tsim KW, Tu PF. 2005. Arabinogalaktaan, mis on eraldatud vartestCistanchedeserticola indutseerib kultiveeritud lümfotsüütide proliferatsiooni. Int. J. Biol. Macromol. 37: 278-282.
Wu XM, Tu PF. 2005. Isolation and characterization of alpha-(1-->6)-glükaanid alatesCistanchedeserticola. J Asian Nat Prod Res. 7: 823–828.
Xiong Q, Hase K, Tezuka Y, Tani T, Namba T, Kadota S. 1998. Fenüületanoidide hepatoprotektiivne aktiivsus alatesCistanchedeserticola. Planta Med 64: 120–125.
Xiong Q, Kadota S, Tani T, Namba T. 1996. Fenüületanoidide antioksüdatiivne toime alatesCistanchedeserticola. Biol Pharm Bull 19: 1580–1585.
