Ⅱ osa: PKD1 üleekspressioon põhjustab polütsüstilist neeruhaigust
Mar 16, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com
Caroline Thivierge, Almira Kurbegovic, Martin Couillard, Richard Guillaume, Olivier Coté ja Marie Trudel
Selle aluseks olevad patogeneetilised mehhanismidautosoomne dominantne polütsüstiline neeruhaigus(ADPKD) tuleb veel selgitada. Kuigi on tõendeid selle kohta, et PKD1 (polütsüstiline neeruhaigus 1) geeni haploinsufektiivsus ja heterosügootsuse kadumine võib põhjustada hiirtel tsüsti moodustumist, paradoksaalselt kõrget PKD1 taset (polütsüstiline neeruhaigus 1) ekspressiooni on tuvastatud ADPKD (autosoomne dominantne polütsüstiline neeruhaigus) patsientide neerudes. Et teha kindlaks, kas PKD1 (polütsüstiline neeruhaigus 1) funktsiooni suurenemine võib olla patogeneetiline protsess, PKD1 (polütsüstiline neeruhaigus 1) bakteriaalne kunstlik kromosoom PKD1 (polütsüstiline neeruhaigus 1)-BAC) modifitseeriti homoloogse rekombinatsiooniga, et sihtida ainult püsivat PKD1 (polütsüstiline neeruhaigus 1) väljendub eelistatavalt täiskasvanu neeru suhtes. Loodi mitu transgeenset liini, mis ekspresseerisid spetsiifiliselt PKD1 (polütsüstiline neeruhaigus 1) transgeen neerudes 2- kuni 15-korda üle PKD1 (polütsüstiline neeruhaigus1) endogeensed tasemed. Kõigil transgeensetel hiirtel tekkisid reprodutseeritavalt tubulaarsed ja glomerulaarsed tsüstid ja neerupuudulikkus ning nad surid neerupuudulikkuse tõttu. See mudel näitab, et metsiktüüpi PKD1 üleekspressioon (polütsüstiline neeruhaigus 1) üksi on piisav inimese ADPKD-d meenutava tsüstogeneesi käivitamiseks (autosoomne dominantnepolütsüstiline neeruhaigus). Meie tulemused avastasid ka silmatorkavalt suurenenud neeru c-Myc ekspressiooni kõigi transgeensete liinide hiirtel, mis näitab, et c-Myc on PKD1 kriitiline in vivo allavoolu efektor (polütsüstiline neeruhaigus 1) molekulaarne rada. See uuring ei andnud mitte ainult hindamatut ja esimest PKD-d（polütsüstiline neeruhaigus）mudel molekulaarse patogeneesi ja ravimeetodite hindamiseks, kuid annab ka tõendeid selle kohta, et funktsiooni suurenemine võib olla ADPKD patogeneetiline mehhanism.autosoomne dominantne polütsüstiline neeruhaigus).
OSAKS KLIKI SIIA Ⅰ
TULEMUSED
PKD1 tootmine (polütsüstiline neeruhaigus 1)-Ac-BAC homoloogse rekombinatsiooni teel. Et teha kindlaks, kas PKD1 (polütsüstiline neeruhaigus 1) funktsiooni suurendamisest üksi piisab ADPKD (autosoomne dominantne polütsüstiline neeruhaigus) fenotüübi tekitamiseks, eraldasime esmalt genoomse klooni, mis sisaldas kogu PKD1 (polütsüstiline neeruhaigus 1) geeni BAC vektori 129/Sv raamatukogus. Seda raamatukogu skriiniti PCR-iga kahe praimerite komplektiga PKD1 jaoks (polütsüstiline neeruhaigus 1). Positiivne BAC kloon PKD1 jaoks (polütsüstiline neeruhaigus 1) tuvastati geen, mis hõlmas kogu külgnevat Tsc2 geenikeha. PKD1 (polütsüstiline neeruhaigus 1) inserti iseloomustati üksikasjalikult tagamaks, et genoomne struktuur ühtib endogeense PKD1 omaga.polütsüstiline neeruhaigus1) 129/Sv hiiretüve geen, millest insert pärineb, ja C57BL/6J inbredtüvest. PKD1 genoomsed kaardid (polütsüstiline neeruhaigus 1) lookus BAC-s ja nendes sisearetatud tüvedes Southern blot analüüsiga, nelja restriktsiooniensüümi seedimisega ja seitsme sondiga, mis katavad kogu PKD1 (polütsüstiline neeruhaigus 1) geen, näis olevat identne ilma ümberkorraldusteta (joonis 1). See BAC sisaldas -121- kb inserti, sealhulgas ~37 kb ülesvoolu ja -39 kb allavoolu järjestust PKD1 (polütsüstiline neeruhaigus1) elektroforeesi ja sekveneerimisega määratud geen.
joonisel fig. 2.SBPkdlrAc konstruktide ja transgeensete hiirte tootmine. (a) Hiire Pkdl-BAC-ga viidi läbi järjestikused homoloogsed rekombinatsiooni sündmused, et viia sisse kaks modifikatsiooni: SB regulatoorsed elemendid, mis sisestati vahetult Pkdl initsiatsioonikoodonist ülesvoolu, ja EcoRI (RI*) vaikne punktmutatsioon, mis viidi sisse eksonis (ex) 10. BAC rekombinatsioonivektor sisaldab R6Ky replikatsiooni alguspunkti, ampitsilliiniresistentset geeni, SacB geeni, RecA geeni ja ainulaadset Smal kloonimissaiti, milles "SB" regulatoorsed elemendid (või eksoni 10 vaikse punkti mutatsioon) klooniti. külgnevate Pkd1 geeniharudega. BAC rekombinatsioonivektor elektroporeeriti E, coli (DH10B) rakkudesse, mis sisaldasid Pkdl-BAC metsiktüüpi, ja pärast selektsiooni toimus esimene homoloogne rekombinatsiooni sündmus ühe kahest Pkd1 harust, et toota BAC kointegraate. BAC kointegraatide rekombinatsioonivektor ja dubleeritud Pkdl piirkonnad elimineeriti teises selektsioonietapis. Lahendatud Pkdl-BAC-id võivad naasta metsiktüüpi või sisaldada kavandatud modifikatsioone. Seejärel saab sisse viia järgneva homoloogse rekombinatsiooni äsja modifitseeritud BAC-sse.(b)(ienomc DNA ot SBPkd l-etransgeenne mxce anakZed bv Sou thern blot. Lineariseeritud fragmentide AVicToiD1ecLon põhjustas transgeeni sisestamise pea-peasse. -saba ja/või saba-saba orientatsioon. 5'-otsa analüüsiti genoomse DNA lagundamisel HindIII-ga ja hübridiseeriti spetsiifilise transgeeni SB sondiga (vasak paneel). Kõik kolm transgeenset hiireliini tekitasid oodatud 10 .9-kb riba pea-saba sisestamiseks; real 39 täheldatud lisariba esindab suure tõenäosusega SB ja hiire genoomi vahelist ühendusfragmenti. Transgeeni sisemist terviklikkust jälgiti mitme restriktsiooniensüümi seedimisega ja Näidatud on üks EcoRI-ga lõhustatud ja Pkdl-sondiga hübridiseeritud genoomse DNA (ekson 7-15) tüüpiline blot (keskmine paneel).
See SBPKD1 (polütsüstiline neeruhaigus 1)-BAC klooni modifitseeriti kahe järjestikuse homoloogse rekombinatsiooni sündmusega E. coli-s. PKD1 (polütsüstiline neeruhaigus 1) geen märgistati eksonis 10, asendades nukleotiidi (G kuni A), et luua cDNA kaardi positsioonis 2355 uudne EcoRI sait. See vaikse punkti mutatsioon loodi PKD1 (polütsüstiline neeruhaigus 1) geeni ja endogeense päritoluga BAC transkripti. Lisaks oleme asendanud PKD1 5'regulatiivsed elemendid (polütsüstiline neeruhaigus 1)-BAC geeni, kasutades ära varem tuvastatud "SB" neeruepiteelispetsiifilisi elemente SBM-i (seotud c-Myc-ga või SBF-ga, mis on seotud c-fos-iga) konstrukt-trans-geeni, et piirata ekspressiooni neerudes (36, 38) (joonis 2a).
See uus SBPkdlrAG-BAC seediti NotL-iga, mis on ainulaadne sait, mis asub vahetult SB elementidest ülesvoolu, ja ClaI Tsc2 geenikehas, kärpides Tsc2 regulatoorseid elemente ja 5' poolt geenikehast, et tagada T'sc2 puudumine. eksogeenset ekspressiooni kõigis kudedes ja prokarüootsete BAC vektori järjestuste eemaldamiseks (joonised 1 ja 2). See 70-kb NotI-ClaI lineariseeritud fragment eraldati ja puhastati. ja kvantifitseeriti munaraku mikroinjektsiooni jaoks (36).
CISTANHE EELISED: NEERUHAIGUSTE RAVI
SBPkdl-ac transgeensete hiirte tootmine ja analüüs. Neli transgeenset asutajat, kes kandsid mitut SBPkdlrAc transgeeni koopiat, arendasid järjekindlalt PKD-d. Neljast SBPKD1 (polütsüstiline neeruhaigus 1)Southerni analüüsiga määratud RAC asutajahiired, kolm SBPKD1 (polütsüstiline neeruhaigus 1) TAG-i transgeensed liinid loodi kahe kuni üheksa transgeeni koopiaga (joonis 2b). Transgeeni terviklikkuse iseloomustamist nendes liinides jälgiti 5'-, sise- ja 3'-sondidega, nagu on näidatud joonisel 2b kujutatud tüüpilistes näidetes. Transgeensed liinid näitasid 5'"SB" sondiga 10,9 kb riba, mis on kooskõlas SBPkdlrAc-ga. trans-geen on integreeritud pea-saba-suunas ja 3'-sondiga paljastati 7{12}}kb riba (joonis 2b). Lisaks tuvastas sisemine sond transgeeni 94-kb endogeense PKD1 (polütsüstiline neeruhaigus 1) riba ning 69-kb ja 25-kb ribad. tänu EcoRI sisestuskohale eksonis 10 (joonis 2b). Need hiired sisaldasid genoomse kattuva struktuuri analüüsi põhjal transgeeni täielikke koopiaid.
PKD1 (polütsüstiline neeruhaigus 1) funktsiooni suurenemine täiskasvanud SBPkdl-Ac transgeensetel hiirtel. SBPkdl-AG ekspressioon. transgeen ja PKD1 (polütsüstiline neeruhaigus 1) geeni uuriti erinevates organites. Transgeeni ja/või endogeense geeni transkriptsioonitasemete kvantifitseerimine viidi läbi Northern blot analüüsiga (joonis 3a). Nagu oodatud, olid transgeeni ja endogeense geeni transkriptid sarnase pikkusega (14, 2 kb). Kontroll-GAPDH ekspressiooni põhjal oli kõigi SBPkd 1 A hiireliinide neerudel järjekindlalt suurenenud transkripti ekspressioon võrreldes normaalse PKD1-ga (polütsüstiline neeruhaigus 1) tasemed sarnases vanuses täiskasvanud neerudes (n=3). Erinevate transgeensete liinide renaalne transgeen ja endogeenne ekspressioon näitasid vahemikku 2- kuni 15- korda üle kontroll-neeru endogeense PKD1(polütsüstiline neeruhaigus 1)tasemed (joonis 3a). Eelkõige näitas transgeenne liin39(n=4) kõrgemat PKD1 (polütsüstiline neeruhaigus 1) tasemed kui read 3 (n=3) ja 41 (n=4). Lisaks PKD1 (polütsüstiline neeruhaigus 1) Northern blot analüüsiga mõõdetud ekspressioonitasemed korreleerusid reaalajas PCR-iga, kasutades praimereid eksonites 1 ja 2 (joonis 3b).
JOONIS 3.SBPkdlrA hiirte neeruekspressiooni analüüs. ( a ) Pkd1 endogeense (endo) ja SBPkdlrA transgeeni (Tg) transkriptide ekspressioonianalüüs neerudes kolmest transgeensest liinist Northern blottinguga. Igast transgeensest liinist kahte proovi, 3, 39 ja 41 võrreldi sama geneetilise taustaga normaalsete kontrollhiirte endogeense neeru Pkdl transkriptiga (C5BI 6I × CBA/DE, neeru RNA proovid saadi transgeensetelt hiirtelt enne lõppstaadiumis neeruhaigus. Endo ja Tg transkriptid on mõlemad -14,2 kb pikkused. Transkriptide süstemaatilist üleekspressiooni täheldati kõigi transgeensete hiirte neerudes võrreldes mittetransgeensete kontrollidega. Sisekontrollina kasutati GAPDH-d Nende transgeensete hiirte neeruekspressiooni kvantifitseerimine oli vahemikus 2- kuni 15- korda võrreldes kontrollhiirte Pkd1 endogeense tasemega, mis oli suvaliselt seatud väärtusele 1. (b) SBPkdl- transgeeni ja praimerite skemaatiline esitus Kasutati kogu Pkdl, sealhulgas endogeense ja transgeeni (ekson 1 ja ekson 2) ja ainult Pkd1 transgeeni (B. ekson 2) amplifitseerimiseks reaalajas PCR ja poolkvantitatiivse RT-PCR abil, SBPkdlAc transgeeni ekspressiooni RT-PCR analüüs kvantifitseeriti neerudes. ja ekstra neerukuded. Näidatakse SBPkdl.Ac transgeeni (Tg) esinduslikku poolkvantitatiivset hindamist, mis sisaldab neerukoe proovi (K) kõigist kolmest transgeensest liinist (3, 39 ja 41) ühest hiirest ja neeruvälistest kudedest. H, süda; Lu, kops; B. aju; Li, maks; ja S. põrn liini 39 hiirelt. Transgeeni ekspressioon on kergesti tuvastatav kõigi transgeensete hiirte neerudes, samas kui see on madal kuni tuvastamatu neeruvälistes kudedes. SBPkd1rAc transgeeni ekspressioon tekitas spetsiifilise 307-bp amplikoni, S16 sisekontroll aga 102-bp amplikoni. M,100-bp marker; H, O, negatiivne kontroll PCR amplifikatsiooni jaoks. (c) SBPkdlr reaalajas PCR ekspressioonianalüüs. Transgeen määrati mitmelt sõltumatult hiirelt. SBPkdl.Ac transgeen kolmest transgeensest hiireliinist 3 (n=5), 39 (n =7) ja 41 (n=5) näitas, et liinidel 39 ja 41 oli kõrgeim neerude ekspressioonitasemed. SBPkdlrAc transgeeni ekspressiooni hiirte (n=3) neeruvälistes kudedes kolmest transgeensest liinist hinnati reaalajas PCR abil. Võrreldes iga transgeense liini neerudega (100 protsenti), näitas ekstrarenaalsete kudede analüüs, et transgeeni ekspressioonitasemed olid ajus, südames, maksas ja kõhunäärmes pidevalt 10- kuni 1,000- korda madalamad. , põrn ja kops. (d) Endogeense c-mc geeni ekspressioon SBPkdl.Ac neerudes poolkvantitatiivse RT-PCR abil. Skemaatiline illustratsioon näitab c-Myc amplifitseerimiseks kasutatud praimereid. Ootuspäraselt on c-Myc ekspressioon täiskasvanud mittetransgeensetes neerudes (kontrollid) minimaalne. Seevastu c-Mye suurenenud ekspressioon tuvastatakse kõigis kolme liini täiskasvanud SBPkdlrAc neerudes, nagu täheldati täiskasvanud transgeensete SBM neerude puhul, mida kasutati kui positiivne kontroll. c-Myc amplikon oli 250 aluspaari; sisekontrolli S16 amplikon oli 102 bp.M, 100-bp marker.
Transgeeni ekspressioonitasemete kvantifitseerimine viidi läbi reaalajas PCR ja poolkvantitatiivse RT-PCR abil kolmes täiskasvanueas transgeenses liinis, kasutades praimereid 5' transleerimata piirkonnas (B, -globiini promootor) ja PKD1 eksonis 2 (polütsüstiline neeruhaigus 1)(Joonis 3b). SBPKD1 (polütsüstiline neeruhaigus 1) RAC ekspressiooni transgeensetel hiirtel võrreldi sisestandardina S16 ribosomaalse valgu geeniproduktiga. Poolkvantitatiivseks RT-PCR amplifikatsiooniks kasutatud tingimused olid lineaarses vahemikus. Transgeeni ekspressioon reaalajas PCR ja poolkvantitatiivne RT-PCR näitas järjekindlalt ja spetsiifiliselt kõigi transgeensete liinide kõrgeimat ekspressiooni neerudes võrreldes teiste elunditega (joonised 3b ja c). Üksiku proovi neeruekspressioonitasemed olid reprodutseeritavad mis tahes kasutatud tuvastamismeetodiga. PKD1 kõrgeim tase (polütsüstiline neeruhaigus 1) mõõdeti liinide 39 ja 41 puhul transgeeni neeruekspressiooni. Et jälgida, kas suurenenud PKD1 (polütsüstiline neeruhaigus 1) ekspressioon tulenes transgeenist või endogeensest geenist, võrreldi kolmest transgeensest liinist pärit sama hiirerühma neeru PKD1 ( polütsüstiline neeruhaigus 1) transgeeni ekspressioon ja neerude PKD1 (polütsüstiline neeruhaigus 1) kogu (transgeenne ja endogeenne) ekspressioon reaalajas PCR abil. Huvitaval kombel. read 39 ja 41 võrreldes reaga 3 näitasid, et suurenenud PKD1 (polütsüstiline neeruhaigus 1) transgeeni neeruekspressioon oli sarnane või kõrgem kui PKD1 (polütsüstiline neeruhaigus 1) kogu neeruekspressioon, osutades sellele, et transgeen vastutab spetsiifiliselt selle indutseeritud ekspressiooni eest. Erinevates elundites (sh süda, kopsud, aju, maks, pankreas ja põrn) on SBPKD1 (polütsüstiline neeruhaigus 1) RAC; transgeen näitas väga nõrka ekspressiooni, mida aeg-ajalt tuvastati põrnas ja kopsus, teistes elundites oli ekspressioon vähesel määral kuni tuvastamatu (joonis 3b). Kvantifitseerimine reaalajas PCR-ga näitas, et transgeeni ekspressioonitase on neeruvälistes kudedes 10- kuni 1,{5}} korda madalam kui neeruekspressioonil (joonis 3c). SBPkdlrAc transgeeni "SB" regulatoorsed elemendid andsid eelistatud neeruekspressiooni; see konkreetne organite jaotus määrati ka siis, kui seda kasutati c-Myc-ga (SBM) ja c-fos-iga (SBF) seotud transgeenides (36, 38). c-Mye, PKD1 allavoolu efektor (polütsüstiline neeruhaigus 1) signaalirajad SBPkdlrAc-s: hiired. SBPkdlrAc transgeensete hiirte intratsellulaarsest patogeneetilisest mehhanismist ülevaate saamiseks püüdsime järgmisena jälgida c-Myc neeruekspressiooni taset, tuginedes meie varasemale tähelepanekule c-Myc dereguleerimise kohta inimese ADPKD (autosoomne dominantne polütsüstiline neeruhaigus) neerudes (22). Neerude analüüs viidi läbi kõigi kolme transgeense liini 3(n=4), 39(n=7) ja 41 (n =4) ning kontrollide (n {{9) põhjal. }}). Nagu on näidatud joonisel 3d, esineb SBPkdlrAa hiirtel indutseeritud endogeense c-Mye oluline ekspressioon võrreldes sarnase vanusega kontrollhiirtega. Huvitav on see, et c-Myc ekspressiooni tase mõnedes SBPkdlrAG neerudes, eriti reas 39, saavutas taseme, mis on võrreldav PKD SBM transgeense hiiremudeliga, mis on toodetud neeru c-Myc ekspressiooniga.
SBPKD1 neeruanomaaliad (polütsüstiline neeruhaigus 1) ARC mice similar to PKD. To characterize the phenotype caused by the transgene expression, gross and histologic examinations were undertaken on transgenic kidneys. Adult kidneys from all transgenic lines were affected bilaterally. Kidneys contained numerous cortical cysts that varied from microscopic to macroscopic in size (Fig.4a and b). SBPkdlrAc. kidneys were pale, a typical finding in PKD. On histologic examination, all transgenic founder mice and progenies (n = 25;n>6 iga liini kohta) arenenud mitu torukujulist (T) ja glomerulaarset tsüsti (G) (joonised 4d, f ja g). Tsüstid täheldati tuubulites kortikaalsetest ja medullaarsetest piirkondadest, samuti tuubulite kogumist papillast (joonised 4d ja e). Transgeensetel hiirtel ilmnes tubulaarne epiteeli hüperplaasia (nooleots), mis hõlmas nii tsüstilised kui ka mittetsüstilised tuubulid ja sagedane hüpertroofia (joonised 4g ja h). kuid raskusaste oli üksikutel hiirtel erinev. Sageli täheldati interstitsiaalset fibroosi (F). perivaskulaarseid lümfoidseid infiltraate ja valgulisi kipsi (P) (joonised 4d ja e)
Joonis 4
Suurenenud PKD1 lokaliseerimiskoha täpsemaks määratlemiseks (polütsüstiline neeruhaigus 1)ekspressioon neerudes, teostasime in situ hübridisatsiooni, kasutades eelnevalt kasutatud eksoni 36-45 sondi (16). Hübridisatsioonisignaal paiknes spetsiifiliselt epiteelirakkudes, mis vooderdavad tsüsti ja hüperplastilisi tuubuleid, samuti glomerulaarseid tsüste. Lisaks nähti teatud signaali mittetsüstiliste või kergelt laienenud tuubulite epiteeli kohal, mis tõenäoliselt tuvastas tuubulid, mis on ette nähtud tulevasteks tsüstilisteks muutusteks (joonised 4i ja j). Neerude histoloogiline analüüs viidi läbi ka transgeensetel hiirtel sündimisel (n=8), 10. sünnijärgsel päeval (P10) (n=3), P20 (n=5), P35 (n{ {10}}) ja P45(n{12}}) võrreldes sama vanuserühma negatiivsete pesakonnakaaslastega (n =2 kuni 4). Huvitaval kombel ilmnes kõigil vastsündinud transgeensetel hiirtel tubulaarne ja glomerulaardilatatsioon võrreldes kontroll negatiivseid pesakonnakaaslasi (joonised 4k ja 1), mis näitab, et neeruanomaaliad algasid emakas, nagu täheldati SBM hiirtel ja ADPKD korral (autosoomne dominantne polütsüstiline neeruhaigus) patsiendid. Tubulaarne ja glomerulaarne dilatatsioon suurenes vanuse kasvades nii suuruse kui ka arvu poolest. P35 järgi ilmnes transgeensetel hiirtel raskem hüperplaasia ja glomeruloskleroosi tunnused. Muutunud neerufüsioloogilised funktsioonid SBPkdlrsc hiirtel. Kõigi transgeensete hiirte neerufüsioloogilised funktsioonid näitasid PKD-ga sarnaseid tunnuseid, samas kui mittetransgeensetel pesakonnakaaslastel ei tekkinud haigust kunagi. Mõne kuu jooksul pärast sündi tekkis haigetel loomadel krooniline neerupuudulikkus. Neid loomi jälgiti neerude funktsionaalsete parameetrite suhtes, mõõtes seerumi ja uriini taset. vere uurea lämmastik (BUN) ja kreatiniin, uriini osmolaalsus, uriini valk ja ioonide eritumine (tabel 1). Kõigil hiirtel kolmest liinist, võrreldes kontrollidega, ilmnesid koondumisdefektid, mis on tavaline leid ADPKD puhul (autosoomne dominantne polütsüstiline neeruhaigus). ja sellest tulenevalt vähenes uriini BUN. kreatiniini, valkude ja raua kontsentratsioon. Transgeenne SBPKD1 (polütsüstiline neeruhaigus 1)rAc.asutajaid ja järglasi (n=6) igast liinist jälgiti kvalitatiivselt proteinuuria suhtes uriiniproovides SDS-PAGE abil (joonis 5). Üle 2 kuu vanustel hiirtel ilmnes mitteselektiivne proteinuuria, mis edenes vanusega. Lisaks tõusid seerumi BUN ja kreatiniini tasemed, mis näitas neerupuudulikkust (tabel 2). Kuna krooniline neerupuudulikkus põhjustab tavaliselt muutusi hematoloogilistes parameetrites, uuriti neid 3–14 kuu vanustel SBPkdlAc transgeensetel hiirtel (tabel 2). Need transgeensed hiired olid aneemilised, mida tõendab oluliselt vähenenud punaste vereliblede arv, kusjuures hemoglobiin ja hematokrit jõudsid poole normaalsest tasemest. Muud punaste vereliblede parameetrid, nagu retikulotsüütide protsent, ei muutunud, nagu eeldati neerupuudulikkuse tõttu. Need loomad surid pidevalt neerupuudulikkuse tõttu -5,9±2,8 kuu vanuselt (n {{12}). }) transgeense liini 39 ja hilisemas vanuses -14,6±3,1 kuud (n= 20) ja -11,7 ±6,5 kuud (n=7) ,vastavalt ridade 3 ja 41 jaoks.
CISTANHE MÕJUD: NEERUHAIGUSTE RAVI
ARUTELU
Siin kirjeldame hiire PKD1 isoleerimist ja iseloomustamist (polütsüstiline neeruhaigus 1)-BAC. See PKD1 (polütsüstiline neeruhaigus 1) geen märgistati ja regulatoorsed elemendid asendati kahe järjestikuse homoloogse rekombinatsiooni sündmusega, et suunata ekspressiooni spetsiifiliselt neerudesse. Selle uudse SBPkdlrAG geeniga toodetud transgeensetel hiirtel ilmnes PKD1 (polütsüstiline neeruhaigus 1) ekspressioon 2- kuni 15- korda suurenenud ja reprodutseeritavalt tekkisid PKD-le tüüpilised varased neerumorfoloogilised muutused. Neerupuudulikkus ilmneb keskeas ja hiired surevad enneaegselt neerupuudulikkuse tõttu. Meie tulemused näitavad ka, et selle fenotüübi eest vastutav PKD1 (polütsüstiline neeruhaigus 1) üleekspressioonimehhanism on vahendatud c-Myc in vivo aktiveerimise kaudu. See uuring näitab, et hiire PKD1 (polütsüstiline neeruhaigus 1) funktsiooni suurenemine neerudes on piisav PKD neerufenotüübi tekitamiseks.
Kuna hiire PKD1 (polütsüstiline neeruhaigus 1) geen ei dubleerita nagu inimestel (27), oleme otseselt tuvastanud ja eraldanud BAC klooni, mis sisaldas kogu PKD1 (polütsüstiline neeruhaigus 1) geen. 129/Sv hiire PKD1 täielik iseloomustus (polütsüstiline neeruhaigus 1)-BAC. kaudne võrdlus kahe teise inbred hiire tüvega kinnitas PKD1 (polütsüstilise neeruhaiguse 1) lookuse terviklikkust. PKD1 (polütsüstiline neeruhaigus 1)-BACinsert sisaldas -37 kuni 39 kb üles- ja allavoolu järjestusi PKD1 (polütsüstiline neeruhaigus 1) geenist. Meie analüüs näitas, et PKD1 (polütsüstiline neeruhaigus 1) geen selles BAC-s oli heauskne hiire metsiktüüpi lookus, mida võiks kasutada edasistes uuringutes.
Kuigi on kindlaid tõendeid selle kohta, et ADPKD-s tekivad tsüstid (autosoomne dominantne polütsüstiline neeruhaigus) võib tuleneda heterosügootsuse kadumisest pärast normaalse PKD1 somaatilist inaktiveerimist (polütsüstiline neeruhaigus 1) alleel (3.21.32), on ka vihjavaid tõendeid püsiva või isegi suurenenud polütsüstiini-1 ekspressiooni kohta tsüstilises tubulaarses epiteelis (22.29). Viimane tähelepanek tõstatab küsimuse, kas PKD1 (polütsüstiline neeruhaigus 1) üleekspressioon iseenesest on piisav tsüstogeneesi lähipõhjus. Transgeensetel hiirtel, kellel on inimese PKD1 (polütsüstiline neeruhaigus 1), TSC2. RAB26. NTHL1 ja SLC9A3R2 geenide puhul tekkisid tsüstid vaid vähesel osal hiirtest ja ühelgi neist ei olnud transgeeni ekspressiooni täiskasvanueas tuvastatav, hoolimata transgeeni 30 koopiast (31). Nendel transgeensetel hiirtel. PKD1 (polütsüstiline neeruhaigus 1) üleekspressiooni selget rolli tsüstogeneesis oli raske kindlaks teha. Meie mudel erineb, kuna transgeensetesse hiirtesse integreeriti kaks kuni üheksa PKD1 (polütsüstiline neeruhaigus 1) metsiktüüpi koopiat, ilma külgnevate geenideta. Kuna PKD1 (polütsüstiline neeruhaigus 1) geen täidab olulisi funktsioone erinevates organites või kudedes, nagu on kirjeldatud paljude PKD1 (polütsüstilise neeruhaiguse 1) geeni ablatsiooniga hiirte puhul, on PKD1 süsteemne üleekspressioon.polütsüstiline neeruhaigus 1) võib põhjustada täiendavaid segavaid mõjusid. Sellest tulenevalt oleme käsitlenud PKD1 rolli (polütsüstiline neeruhaigus 1) funktsiooni suurendamine, kasutades lähenemist, mis on suunatud PKD1 (polütsüstiline neeruhaigus 1) spetsiifiliselt neerudele. Homoloogse rekombinatsiooniga oleme esmalt asendanud PKD1 (polütsüstiline neeruhaigus 1) ülesvoolu reguleeriva piirkonna "SB" neerudega piiratud regulatoorsete elementidega, hoides sellega ära geeniekspressiooni vähenemise, mida tavaliselt täheldatakse PKD1 puhul.polütsüstiline neeruhaigus 1) täiskasvanueas kui ka potentsiaalne sekundaarne tagasisideahela reguleerimine (36, 38). Teiseks oleme tähistanud hiire PKD1 (polütsüstiline neeruhaigus 1) transgeen (Pkdlr), mille eksonis 10 on vaikne punktmutatsioon, kuid ei sisestanud epitoobimärgist, et tagada täielikult funktsioneeriva konserveeritud struktuuri ja terviklikkusega "metsiktüüpi" valk. Sellest modifitseeritud BAC-st puhastati SBPkdlrAG fragment Tsc2 geenist ja BAC vektorist, et vältida Tsc2 geeni sekkumist, mis võib samuti esile kutsuda tsüstilise fenotüübi (8.20.28). samuti vältida prokarüootsete järjestuste pärssivat toimet (5).
Spetsiifilise neeru PKD1-ga toodeti neli erinevat SBPkdlrActransgeenset asutajahiirt ja kolm sõltumatut liini (polütsüstiline neeruhaigus 1)-täiustatud väljendus. Eriti silmatorkav on fenotüübi täielik läbitungimine nendes transgeensetes hiirtes. SBPKD1 (polütsüstiline neeruhaigus 1) rAc asutaja- ja hiireliinidel oli ADPKD-ga (autosoomne dominantne polütsüstiline neeruhaigus) mitmeid ühiseid füsiopatoloogilisi tunnuseid. Nende hulka kuuluvad tsüstide teke ajukoores, medullas ja glomerulites koos epiteeli hüperplaasia, interstitsiaalse fibroosi ja fokaalse interstitsiaalse põletikuga.
Kuna PKD fenotüüpi täheldati järjekindlalt kõigil erinevatel transgeensetel asutajahiirtel ja transgeeni integreerumine hiire genoomi on juhuslik nähtus, ei saa fenotüüp tuleneda kromosomaalse positsiooni efektist, vaid ainult suurenenud PKD1-st.polütsüstiline neeruhaigus 1) väljendus. Tõepoolest, PKD1 (polütsüstiline neeruhaigus 1) transgeeni ekspressioon kõigis liinides oli neerudega piiratud. nagu varem täheldati teiste "SB" elementide poolt reguleeritud transgeenide puhul (36, 38). Veelgi enam, see suurenenud PKD1 (polütsüstiline neeruhaigus 1) ekspressioon oli põhjustatud transgeenist, mitte kaudsest endogeensest PKD1-st.polütsüstiline neeruhaigus 1) aktiveerimine. Seega annavad meie tulemused selgeid tõendeid selle kohta, et metsiktüüpi funktsionaalse PKD1 (polütsüstiline neeruhaigus 1) funktsiooni suurenemine võib tekitada mitmeid neerutsüste. Oluline on see, et need SBPKD1 (polütsüstiline neeruhaigus 1) tavad moodustavad esimese hiiremudeli, mis on loodud inimese PKD1 hiire ortoloogi ainsa üleekspressiooniga (polütsüstiline neeruhaigus 1) geen.
SBPkdl-Ac hiired näitavad, et PKD1 (polütsüstiline neeruhaigus 1)üleekspressioon on neerutsüstogeneesi esmane patogeneetiline mehhanism. Oluline on see, et kõrgeimad transgeeni ekspressioonitasemed neerudes näisid olevat korrelatsioonis fenotüübi progresseerumise ja tõsidusega. Samuti leidsime, et PKD1 (polütsüstiline neeruhaigus 1) üleekspressioon SBPKD1 arengus (polütsüstiline neeruhaigus 1)-Ac fenotüüp annab tõenäoliselt signaali c-Myc aktiveerimisest in vivo. Võimalik, et see aktiveerimine võib toimuda isegi otse polütsüstiini -1 C-terminaalse saba kaudu, kus toimub proteolüütiline lõhustamine ja tuuma translokatsioon (7), kuna täiskasvanud hiirtel on näidatud, et c-Myc suurenenud neeruekspressioon indutseerib PKD-d, oleks väga järjekindel, et toetada c-Myci PKD1 peamise allavoolu efektorina (polütsüstiline neeruhaigus 1) signaalirajad See tulemus korreleerus ka meie varasemate leidudega suurenenud c-Myc ekspressiooni kohta kõigi analüüsitud inimese ADPKD (autosoomne dominantne polütsüstiline neeruhaigus) neerudes (22). Kokkuvõttes näitavad need tulemused, et c-Mye on PKD1 peamine vahendaja. (polütsüstiline neeruhaigus 1)tsüstogenees.
Meie tulemused PKD1-st (polütsüstiline neeruhaigus 1)funktsiooni suurenemise mudel koos hiire PKD1 (polütsüstiline neeruhaigus 1) haploinsufektiivsuse ja funktsiooni kadumisega näitavad, et mis tahes PKD1 (polütsüstiline neeruhaigus 1) düsregulatsioon võib viia tsüstogeneesini (2.19.23-26.31.40). PKD1 põhjustatud tõsine PKD1 (polütsüstiline neeruhaigus 1) tasakaalustamatus hiirtel (polütsüstiline neeruhaigus 1) ablatsioon või transgeenne üleekspressioon põhjustas neerutsüstide varajase alguse ja kiire progresseerumise ning mõjutas suurt osa tuubulitest. Seevastu leebem PKD1 (polütsüstiline neeruhaigus 1) tasakaalustamatus, nagu haploinsufektiivsus, põhjustas PKD aeglasema progresseerumise koos rohkemate fokaalsete tsüstidega. Sarnase fenotüübi näilist paradoksaalset arengut vastupidise polütsüstiini-1 düsregulatsiooni tõttu võib seletada ühise tulemusega, nimelt suhtelise valgukontsentratsiooni tasakaalustamatusega, mis võib muuta aktiivse polütsüstiini multivalgukompleksi moodustumist või funktsiooni. Kokkuvõttes väidavad meie ja teiste uurijate tulemused, et ADPKD tsüstide moodustumise mehhanism (autosoomne dominantne polütsüstiline neeruhaigus) tuleneb tõenäoliselt kolmest patogeneetilisest mehhanismist: funktsiooni suurenemine, funktsiooni kadumine ja geeniannuse mõju.
Romaan SBPkdlrAc; hiired moodustavad võimsa neeru tsüstogeneesi mudeli, mis võib anda olulise ülevaate PKD, PKD1 patofüsioloogiast (polütsüstiline neeruhaigus 1) signaali ülekandeteed ja interakteeruvad partnerid. Selle mudeli uurimine võib viia ka uute ravistrateegiate väljatöötamiseni normaalse valgu tasakaalu taastamiseks PKD1-s.polütsüstiline neeruhaigus 1) multimeerne kompleks.
Cistanche ravib neeruhaigusi ja parandab neerufunktsiooni
VIITED
1. Blouin, MJ, H. Beachemin, A Wright, M. E. De Paepe, M. Surrette, AM. Beau. B. Nakamoto, CN. Ou, G. Stamatoyannopoulos ja M. Trudel. 2000. Sirprakulise aneemia geneetiline korrigeerimine: ülevaated transgeensete hiiremudelite Nat. Med.{4}}.
2 Boulter, C, S. Mulroy, S. Webb, S. Fleming, K. Brindle ja R. Sandford. 2001.Südame-veresoonkonna, skeleti. ja neerudefektid hiirtel, kellel on sihipärane PKD1 häire (polütsüstiline neeruhaigus 1)geen. Proc. Natl.Acad. Sci. USA 9812174-12179.
3. Brasier, JL ja EPHenske.1997. Kaotuspolütsüstiline neeruhaigus(PKD1）kromosoomi 1φp13 piirkond neerutsüsti rakus toetab tsüsti patogeneesi funktsiooni kadumise mudelit. J. Clin. Investig.99:194-199.
4. Burn, TC, TD Connars, W. R Dackowski, LR. Petry, TJVan Raay, JMMilhalland, M. Venet, G. Milker, R. ML Hakim, G. ML Landes, KW Klinger, F. Qiam, LF. Onuchic, T. Watnick GGGermino ja N. A Doggett. 1995. Anay sis genoomse järjestuse kohtaautosoomne dominantne polütsüstiline neeruhaigusgeen ennustab leutsiinirikka korduse olemasolu. Hum Mol, Genet.{1}}.
5. Chada, K, J. Magram, K. Raphael, G. Radice, E. Lacy ja F. Costantini. 1985. Võõrglobiini geeni spetsiifiline ekspressioon transgeensete hiirte erütroidrakkudes Loodus 337-380.
6. Chauvet, V, F. Qian, N. Bought, Y. Cai B. Phakdeekitacharoen, LF. Onuchi, T. Attie-Bitach, L. Guicharnaud, O. Devuryst, GG Germino ja M.-C. Gubler.2002. PKDI ja PKD2 transkriptide ja valkude ekspressioon inimese embrüos ja neerude normaalse arengu käigus. Olen. J. Pathol. 160973-983.
7.Chaurvet,V,X Tian,H.Husson,DH Grimm,T.Wang T.Hiesberger,P.Igarashi,AMBennett,O.braghimov-Beskrovnaya,S.Somlo ja MJ Caplan.2004 Mehaanilised stiimulid põhjustavad lõhustumist ja tuuma pobeystin-1 C-otsa translokatsioon.J. Cin.Investig 114:1433-1443.
8. Cheadle, JP, MPReeve, JR Sampson ja DJ Kwiatkowski 2000. Molekulaargeneetiline areng tuberoosskleroosis. Humm. Genet10797-114.
9. Konsortsium, EPKD1993. Kromosoomi 16.Cell75 tuberoosskleroosi geeni identifitseerimine ja iseloomustus:1305-1315.
10. Konsortsium, EPKD1994.Thepolütsüstiline neeruhaigus 1geen kodeerib kõike transkribeeritavat 16. kromosoomi raku 7781-894 dubleeritud piirkonnas.
11. Konsortsium, L PK D 1995. a.Polütsüstiline neeruhaigus: PKD1 täielik struktuur (polütsüstiline neeruhaigus1) geen ja selle valk. Ce 81:289-298
12. Couillard, M., R Guilkume, N Tanj, V. DAgati ja M. Trudel.2002. c-Myc-indutseeritud apoptoospolütsüstiline neeruhaigusei sõltu FasL/Fas interaktsioonist. Cancer Res. 62:2210-2214.
13. De Paepe, M Land M Trudy 1904, Inimese sirprakulise glomerulopaatia mudel. Kidney Int. 46:1337-1345.
14. GengL, Y, Segal B. PekseL N. Den Y. Pei, F. Carone, H G. Rennke, AM Glücksman-Kuis, MCSchneider, M Ericsson, STReeders ja J. Zhou. 1996. Polüestri identifitseerimine ja lokaliseerimine, PKD1 (polütsüstiline neeruhaigus 1) geeniprodukt. J. Clin. Uurige. 98-2674-2682
