Kuidas ehhinakosiid hoiab ära Parkinsoni tõve

Kontakt: emily.li@wecistanche.com

Ⅰ osa: autofagia reguleerimise mehhanism MPTP-indutseeritud PD hiirtel ehhinakosiidi MTOR-i signaaliraja kaudu

Abstraktne:

Eesmärk: Käesoleva uuringu eesmärk oli uurida selle mõjuehhinakosiid(ECH) autofagiaga seotud indikaatorite kohta mTOR signaaliraja kaudu, eriti mõju autofagia substraadi P62 ja -sünukleiini kliirensile, mis on patoloogilised põhiproduktid.Parkinsoni tõbi(PD), et pakkuda uusi strateegiaid PD raviks (Parkinsoni tõbi). Meetodid: alaägeda PD hiiremudel(Parkinsoni tõbi)määrati 1-metüül-4-fenüül-1,2,3,6-tetrahüdropüridiini (MPTP) intraperitoneaalse süstimisega. Esiteks hinnati iga rühma hiirte neurokäitumuslikke sümptomeid ja igas rühmas mõõdeti suure jõudlusega vedelfaasiga monoamiini neurotransmittereid juttkehas. Türosiinhüdroksülaasi (TH), sünukleiini ja LC3 ekspressiooni jälgimiseks kasutati immunofluorestsents-topeltvärvimist. Transmissioonelektronmikroskoopi kasutati substantia nigra ultrastruktuuri muutuste ja autofagosoomide moodustumise jälgimiseks. Seejärel tuvastati Western blot abil TH, -sünukleiini, Beclin 1, LC3, P62, mTOR ja ülesvoolu valgu AKT ekspressioonid. Tulemused: võrreldes mudelrühmaga paranes neuro-käitumuslik funktsioon oluliseltECH (ehhinakosiid)rühm (P < {0}},01)="" koos="" th,="" da="" ja="" dopac="" suurenenud="" ekspressiooniga="" ajus="" (p="">< 0,01).="">ECH (ehhinakosiid)rühmas, samal ajal kui Beclin 1 ja LC3-II ekspressioonid suurenesid (P < 0.01), siis P62 ja -sünukleiini ekspressioonitasemed langesid oluliselt (P < 0,01).ECH (ehhinakosiid)võib ülesreguleerida ellujäämissignaali p-AKT / AKT ekspressioonitaset ja vähendada mTOR ekspressiooni. Järeldus:ECH (ehhinakosiid)võib suurendada autofagiat, inhibeerides mTOR ekspressiooni, soodustades seeläbi -sünukleiini kliirensit ja autofagia substraadi P62 lagunemist ning avaldades neuroprotektiivset toimet.

Märksõnad: Parkinsoni tõbi, MPTP,ehhinakosiid, -sünukleiin, P62, autofagia, mTOR

Cistanche võib ravida Parkinsoni tõbe

Sissejuhatus

Parkinsoni tõbi (PD)on krooniline ja progresseeruv neurodegeneratiivne haigus. PD tüüpiline patoloogiline tunnus(Parkinsoni tõbi)on Lewy kehade moodustumine ning -sünukleiin ja ubikvitiin on Lewy kehade põhikomponendid. Üha enam tõendeid näitab, et autofagia regulatsiooni häire viib lõpuks valesti volditud valkude ja vigastatud organellide kuhjumiseni.54 Autofagia-lüsosoomi rada ei saa lagundada mitte ainult valke, mida ubikvitiini-proteasoomi rada ei saa lagundada, vaid ka seda rada. võib lagundada -sünukleiini. Seetõttu võib autofagia reguleerimine pakkuda uut strateegiat PD raviks (Parkinsoni tõbi). Autofagia on rakusiseste agregaatide lagunemise peamine rada ja mTOR kinaas on autofagia peamine reguleerimiskoht. Seetõttu on PD vahelise seose selgitamine teoreetilise ja praktilise tähtsusega(Parkinsoni tõbi) ja autofagia, mida reguleerib mTOR signaalirada. Kuna -sünukleiini lagunemine sõltub peamiselt autofagia-lüsosomaalsest süsteemist, mille sihtmärgiks on ebanormaalsete valkude elimineerimine, võib autofagiat reguleerivate neuroprotektiivsete ravimite väljatöötamine anda juhiseid neurodegeneratiivsete haiguste raviks. ECH (ehhinakosiid) mille molekulvalem on C35H46O20. See on Hiina meditsiini Cistanche fenüületanoidglükosiidide põhikomponent. Selle eraldasid esmakordselt Stoll jt juurtestEchinaceaAngustifolia DC.ECH (ehhinakosiid)omab laia valikut farmakoloogilisi toimeid. Sellel on põletikuvastane, antioksüdant, närvide kaitse, õppimisvõime ja mälu parandamine, maksakaitse, immuunsüsteemi reguleerimine ja kasvajavastane toime. Käesolev uuring, alustades PD põhilistest patoloogilistest mehhanismidest(Parkinsoni tõbi), mille eesmärk oli uurida neuroprotektiivse toime reguleerimistECH (ehhinakosiid)hiire PD-s(Parkinsoni tõbi)autofagia-lüsosomaalse raja MPTP poolt indutseeritud mudel.

Materjalid ja seadmed

Katseloom

Katserühm koosnes 108 isasest SPF-klassi C57BL/6J hiirest, kaheksa nädala vanused, kaaluga 20–22 g, neli hiirt puuri kohta, keda hoiti 22–25 kraadi juures. Hiiri andis Hiina Teaduste Akadeemia Shanghai laboriloomade keskus, mis asub Nanjingi Hiina Meditsiini Ülikoolis ning loomad said humaanset hooldust vastavalt riiklike terviseinstituutide juhistele SPF-klassi ruumis, mille temperatuur oli 22–2 25 kraadi , suhteline õhuniiskus 55 protsenti ja 12-tunni tsirkadiaanrütmi all. Hiirtel oli tasuta toitu ja vett.

Peamised reaktiivid

MPTP (Sigma Company), hiirte anti-TH monoklonaalne antikeha (Sigma Company), Alexa Fluor 555 küülikuvastane antikeha (Biyuntian Institute of Biotechnology), Alexa Fluor 488 küülikuvastane antikeha (Biyuntian Biotechnology Institute), HRP -kitse küülikuvastane sekundaarne antikeha (Biyuntian Biotechnology Institute), küüliku polüklonaalne - sünukleiini antikeha (Cell Signaling Technology Company), HRP-kitse hiirevastane sekundaarne antikeha (Biyuntian Biotechnology Institute),ECH(ehhinakosiid) (Chengdu Linghangzhe Biotechnology Co., Ltd.), küüliku anti-p-AKT (Ser473) antikeha (Cell Signaling Technology Company), rapamütsiin (Cell Signaling Technology Company), klorokviin (Sigma Company), Wortmannin (Sigma Company), küüliku polüklonaalne LC3 antikeha (Abcam Company), küüliku polüklonaalne P62 antikeha (Enzo Life Science Company), hiirte monoklonaalne aktiini antikeha (Santa Cruz Company), Beclin 1 polüklonaalne antikeha (Abcam Company).

Materjalide teave:

MPTP (America, Sigma Company), hiirte anti-TH monoklonaalne antikeha (America, Sigma Company), küüliku polüklonaalne sünukleiini antikeha (Ameerika, Cell Signaling Technology Company), HRP-kitse hiirevastane sekundaarne antikeha (Hiina, Biyuntian Biotehnoloogia Instituut ),ECH(ehhinakosiid) (Hiina, Chengdu Linghangzhe Biotechnology Co., Ltd.), küüliku anti-p-AKT (Ser473) antikeha (Ameerika, Cell Signaling Technology Company), rapamütsiin (Ameerika, Cell Signaling Technology Company), klorokviin (Ameerika, Sigma Company), Wortmannin (Ameerika, Sigma Company), küüliku polüklonaalne LC3 antikeha (America, Abcam Company), küüliku polüklonaalne P62 antikeha (America, Enzo Life Science Company), hiirte monoklonaalne - aktiini antikeha (Ameerika, Santa Cruz Company), Beclin 1 polüklonaalne antikeha ( Ameerika, Abcam Company).

Ravi ehhinakosiidigaParkinsoni tõbi

Eksperimentaalsed meetodid

Katseloomade rühmitamine

108 C57BL/6J hiirt jagati juhuslikult kuueks rühmaks, igas rühmas oli 18 hiirt. Üksikasjad olid järgmised: normaalne kontrollrühm (tavalise soolalahuse rühm, N rühm), mudelrühm (MPTP rühm, M rühm),ECH(ehhinakosiid) grupp (MPTP plusECH (ehhinakosiid), EH rühm), indutseeritud autofagia rühm (MPTP pluss Rapamütsiini rühm, RA rühm), autofagia inhibiitori A rühm (MPTP plussECH (ehhinakosiid)pluss klorokiini rühm, CQ rühm), autofagia inhibiitori B rühm (MPTP plussECH (ehhinakosiid)pluss Wortmanni rühm, WO rühm). MPTP annus oli 30 mg/kg/päevas, süstituna pidevalt 7 päeva.ECH (ehhinakosiid) manustati 30 mg/kg/päevas, intragastraalselt.9

Katseloomade ja ravimite modelleerimine

N-rühmale ja EH-rühmale anti tavalist soolalahust jaECH(ehhinakosiid) vastavalt kolm päeva enne modelleerimist kuni seitse päeva pärast modelleerimist. Rapamütsiini, 10 wortmanniini,11 ja klorokviini manustati seitsmel järjestikusel päeval pärast viimast MPTP süsti. Rapamütsiini sabaveeni süstimise annus arvutati 2 mg/kg/päevas. Klorokiini intraperitoneaalse süstimise annus hiirtele oli 50 mg/kg/päevas. Wortmanniini sabaveeni süstimise annus hiirtel oli 0,7 mg/kg/päevas (täiendav joonis 1).

Neurokäitumuslikud vaatlused

Kirjanduse12 andmetel,12 väiksemate muudatustega, oli isevalmistatud seade poolustesti jaoks järgmine: Seade oli 55 cm pikkune, 1 cm läbimõõduga PV toru, mille ülaosas oli 2 cm läbimõõduga sfääriline projektsioon. seadet hiirte kinnituspunktina. Seade kaeti musta teibiga, et vältida hiirte kukkumist. Iga hiir asetati katse ajal sfäärilisele väljaulatuvale punktile peaga ülespoole. Registreeriti aeg, mis kulub asetatud lati ülaosast kuni pea alla keeramiseni (T-pööre) ja kogu aeg, mis kulub asetatud lati ülaosast toru põhja ronimiseks kuni maandumiseni (T-summa).

Spontaanne tegevus

Spontaanne tegevus, tuntud ka kui avatud väli tegevus, on levinud näitaja haruldase aktiivsuse tuvastamiseks pärast MPTP vigastust.13 Käesolevas uuringus võeti kasutusele avatud välikatse videoanalüüsi süsteem. Konkreetsed toimingud olid järgmised: Enne katset pandi neli sama rühma hiirt vaatluskasti (pikkusega 25 cm, laiusega 25 cm ja kõrgusega 25 cm).

25 cm), et kohaneda 30 minutiks. Seejärel salvestati neid pidevalt 30 minutit. 30-minutilise vaatlusaja aknas loendati vertikaalsete liikumiste arv (kasvamisarv) eraldi kolme katkendliku viieminutilise intervalliga. Videoanalüüsi süsteem analüüsis automaatselt hiire tegevuste trajektoori ja sai horisontaalse liikumise indikaatoriks 30-minuti kogukauguse (Total Distance).

Kõnnaku analüüs

Kõnnianalüüs: Kirjanduse andmetel14 kasutati isevalmistatud kõnnianalüüsi seadet. See seade oli järgmine: Puidust kõnnitee (pikkusega 42 cm, laiusega

4,5 cm ja kõrgus 12 cm), üks ots oli lahti, teine ​​ots viis oravapuuri. Oravapuur oli kaetud musta riidega. Hiire jalgade põhja kasteti sinist tinti. Seejärel asetati hiir kõnnitee avatud otsa. Hiir liikus loomulikult oravapuuri otsa, mis oli kaetud musta riidega. Mõõdeti vastavalt kolm pikimat esi- ja tagajäseme sammu ning võeti keskmised väärtused.

Rotarodi test

Hiir asetati muutuva kiirusega pöördvardale, kusjuures selle kiirust reguleeriti nii, et see tõusis viie minuti jooksul neljalt ringilt minutis 40 ringini minutis. Aeg rotarodi pöörlemise algusest kuni hiire langemiseni rotarodilt iga kord registreeriti kukkumise latentsusena. Monoamiini neurotransmitterite sisalduse määramine juttkehas kõrgjõudlusega vedelikkromatograafia elektrokeemilise tuvastamise (HPLC-ECD) abil

Proovide võtmine ja ravi

Hiired surmati, juttkeha eraldati kiiresti jääl ja kaaluti. Vastavalt 1 ml 5% perkloorhappe ja 0,1 g aju (märgkaal) suhtele pandi iga rühma proovid vastavas koguses perkloorhapet sisaldavasse klaasi ja homogeniseeriti lobritorus. . Homogenaati tsentrifuugiti madalal temperatuuril 13,000 p/min 20 minutit. Võeti supernatant ja tsentrifuugimist korrati. Supernatant pandi edasiseks tuvastamiseks madala temperatuuriga külmikusse. HPLC-ECD tingimused olid järgmised. Võeti kasutusele Couloehemlll 5300 elektrokeemiline kromatograafia. Tuvastamisvahenditeks olid 5020 ja 504 naela rakud, kromatograafilise kolonniga MD-150 (3,0 x 150 mm; 3 um), MDTM-2 mobiilne faas ja tundlikkus 2uA. Voolukiiruseks määrati 0,6 ml/min, elektroodi potentsiaaliks 220 mV ja kolonni temperatuur määrati 30 kraadini. Süstimismaht oli 20 ul (esmalt lahjendati kümme korda).

Järgmiste neurotransmitterite sisaldus tuvastati dopamiini (DA), dihüdroksüfenüüläädikhappe (DOPAC), kõrge vanilliinhappe (HVA), norepinefriini (NE), {{0}}hüdroksütrüptamiini (5-HT) 5-Hüdroksüindooläädikhape (5-HIAA). TH, -sünukleiini, LC3 ja p62 immunofluorestsentsvärvimine Hiired (n=6 rühma kohta) surmati sügava anesteesia all (5% kloraalhüdraati) ja perfuseeriti 0,9% naatriumkloriidiga, seejärel 4 protsenti paraformaldehüüdi läbi südame vasaku vatsakese. Ajud eemaldati kiiresti ja fikseeriti 24 tunni jooksul, seejärel viidi 4 °C juures fosfaatpuhverdatud soolalahusesse (PBS), mis sisaldas 30 protsenti sahharoosi, kuni need vajusid. Kude sisestati parafiini ja koronaalsed lõigud (30 µm) lõigati kelgu mikrotoomi abil läbi substantia nigra pars compacta (SNc; -2,8 kuni -3,8 mm kaudaalselt bregma suhtes). Sektsioonid deparastati ja hüdrateeriti ning endogeenne peroksidaas peatati 0,3 protsendilise H2O2-ga 30 minutiks. Pärast kuumusega indutseeritud antigeeni otsimist inkubeeriti slaide 0,5% Triton-X100 ja seejärel 5% veise seerumi albumiiniga 30 minutit. Seejärel inkubeeriti sektsioone anti- -sünukleiini antikehaga, anti-TH antikehaga, anti-LC3 antikehaga, anti-p62 antikehaga ja vastavate fluorestseeruvate sekundaarsete antikehadega öö läbi temperatuuril 4 °C. Pärast kolme viieminutilist pesemist PBS-is , inkubeeriti sektsioone biotinüülitud sekundaarses antikehas üks tund, millele järgnes avidiin-biotiini kompleks 30 minutit. Peroksidaasi aktiivsus visualiseeriti 33-diaminobensidiiniga.

Tuvastaminevalgu kohta Western Blot'iga

SNc valk ekstraheeriti (n {{0}} hiirt rühma kohta), eraldati 12–15% SDS-PAGE abil ja kanti üle PVDF membraanidele. Membraanid blokeeriti 5% rasvavaba piimaga 1,5 tundi toatemperatuuril ja inkubeeriti TH, sünukleiini, p62, Beclin 1, LC3, p-AKT, AKT, p-mTOR, mTOR ja GAPDH vastaste antikehadega öö läbi temperatuuril 4 °C . Järgmisel päeval loputati membraane tris-puhverdatud soolalahusega, mis sisaldas 0,1 protsenti Tween 20, ja hübridiseeriti vastavate sekundaarsete antikehadega 1,5 tundi. Valgud visualiseeriti täiustatud kemoluminestsentsi abil ja immunoreaktiivseid ribasid analüüsiti pildianalüüsi tarkvaraga (Gel Doc 1000-UV; Bio-Rad, Richmond, CA), et arvutada GADPH-le normaliseeritud -sünukleiini ja TH-ribade optiline tihedus.

Teave antikehade kohta: küüliku polüklonaalne LC3 antikeha: 1:1000. Küüliku polüklonaalne P62 antikeha: 1:1000. Beclin 1 polüklonaalne antikeha: 1:1000. Hiired TH-vastased monoklonaalsed antikehad: 1:1000. Küüliku polüklonaalne sünukleiini antikeha: 1:1000.

Substantia Nigra ultrastruktuuri vaatlemine ülekandeelektronmikroskoobiga

Hiired (n=6 rühma kohta) surmati 5% kloraalhüdraadiga ja perfuseeriti läbi vasaku vatsakese jääkülma PBS-iga, millele järgnes 4% paraformaldehüüdi ja 1% glutaaraldehüüdi PBS-is. Ajud eemaldati ja fikseeriti 2,5% glutaaraldehüüdis temperatuuril 4 °C kuus tundi. SNc lõigati umbes 1 mm3 plokkideks ja fikseeriti PBS-is, mis sisaldas 2,5 protsenti glutaaraldehüüdi, ja säilitati edasiseks töötlemiseks temperatuuril 4 °C. Fragmendid järelfikseeriti 1-protsendilises osmiumtetroksiidis samas puhvris, dehüdreeriti läbi sorteeritud alkoholide ja sisestati Epon 812-sse (Shell Chemical Co., Houston, TX). Üliõhukesed (50 nm) lõigud lõigati ultramikrotoomiga, värviti uranüülatsetaadi ja pliitsitraadiga ning analüüsiti transmissioonielektronmikroskoobi all (Leica TCS SP2CLSM, Fudani ülikooli meditsiinikooli elektronmikroskoopia keskus).

Statistiline analüüs

Kõik käesoleva uuringu mõõtmisandmed väljendati keskmistena ± standardvead ja statistilist analüüsi töödeldi GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software Inc, San Diego, CA) tarkvaraga. P<0.05 was="" considered="" statistically="" significant.="" one-way="" analysis="" of="" variance="" (one-way="" anova)="" was="" used="" to="" test="" the="" statistical="" differences,="" and="" the="" comparison="" between="" multiple="" groups="" was="" analyzed="" by="" tukey's="" multiple="" group="">

OSA Ⅱ saamiseks klõpsa SIIA