4. osa uuringud on näidanud, et autofagia mängib olulist rolli rakulise LD ladestumise reguleerimisel

Palun võtke ühendustoscar.xiao@wecistanche.comrohkem informatsiooni

2.14. Laktaatdehüdrogenaasi (LDH) test

Tootja juhiste kohaselt plaaditi rakud 96-süvendiga plaadile kiirusega 5000 rakku süvendi kohta ja LDH taseme mõõtmiseks analüüsikomplektiga (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute) koguti sööde. Seejärel tuvastati proovide neeldumine Multiskan Spectrum (Thermo Fisher Scientific) abil 450 nm juures.

2.15. BODIPY493/503, BODIPY 581/591 C11 ja MitoTracker sügavpunane värvimine

Elusrakke pesti PBS-ga ja inkubeeriti 2 ug/ml BOD-IPY 493/503 (InvitrogenTM, Cat D3922) või BODIPY 581/591 C11 (BD-C11）(2)-ga.{15}} μM, InvitrogenTM, Cat D3861）PBS-s 15 minutit temperatuuril 37 kraadi. MitoTracker Deep Red värvimiseks inkubeeriti elusrakke 0,5 ug/ml MitoTracker Deep Red (InvitrogenTM, Cat M22426) PBS-is 30 minutit temperatuuril 3 kraadi. pesti kaks korda PBS-s ja fikseeriti 3,5-protsendilises PFA-s 10 minutit, millele järgnes pesemine ja vastuvärvimine Hoechst 3342-ga (Sigma, Cat B2261) 10 minutit, enne kui need kaeti pildistamiseks objektiklaasidele.kui palju tsistanši võttaPilte vaadeldi ja fotod jäädvustati fluorestsentsmikroskoopia abil (Olympus, Tokyo, Jaapan).

Lisateabe saamiseks klõpsake siin

2.16.Hoechsti ja PI värvimine

Rakud värviti Hoechstiga 33 342 (1 ul, lahjendatuna 500 ul PBS-s, Sigma, Cat B2261) ja (või) PI-ga (0,1 ul, lahjendatuna 500 ul PBS-is, Solarbio, (cistanche une ja 1102 min une)) seejärel fikseeriti ja vaadeldi fluorestsentsmikroskoopia abil (Olympus, Tokyo, Jaapan).

2.17.Vooltsütomeetria

Rakud seediti ja loputati D-hank'iga, seejärel värviti anneksiin V-FITC-ga (5 ul, mis oli lahjendatud 500 ul PBS-s/PI-s (0,1 ul lahjendatud 500 ul PBS-s) apoptoosikomplektiga (CA1020, Solarbio, Peking, Chian). ) vastavalt tootja protokollile. Pärast seda analüüsiti apoptootilisi rakke voolutsütomeetria abil (guajaav easyCyterM 8, Millipore, USA). Mitokondriaalse ROS-i ja mitokondriaalse membraani potentsiaali mõõtmised viidi läbi nagu avaldatud 【12】. SH-SY5Y rakud värviti MitoSOX-iga (2,5 μM, Invitrogen, USA) või JC1-ga (10 ug/ml, T-3168, Invitrogen, USA) 37 kraadi juures 30 minutit. Pärast kahekordset pesemist PBS-iga resuspendeeriti rakud voolutsütomeetriliseks analüüsiks külmas PBS-is, mis sisaldas 1 protsenti FBS-i. Andmeid analüüsiti FCS Expressi tarkvaraga (Guava Easy CyterM8, Millipore, Hayward, CA, USA).

2.18. Merihobu hingamise testid

Mitokondriaalset hingamisfunktsiooni elusates SH-SY5Y rakkudes mõõdeti Seahorse ekstratsellulaarse voolu (XFe96) analüsaatoriga (Agi-lent, Santa Clara, USA) hapnikutarbimise määra (OCR) muutuste kaudu. SH-SY5Y rakkudel, mis külvati 3 × 10³ rakku süvendi kohta, lasti kleepuda Seahorse'i rakukultuuriplaatidele ja saavutasid katse ajal ligikaudu 80-protsendilise konfluentsuse. (tsistantee) Järgmisel päeval töödeldi rakke eelnevalt Ka-ga ja seejärel eksponeeritud MPP-ga* veel 24 tundi. OCR tuvastati põhitingimustes, millele järgnes 1 μM oligomütsiini, 1 μM FCCP, samuti 1 μM rotenooni ja antimütsiini A järjestikune lisamine.

Cistanche võib parandada immuunsust

2.19. Statistiline analüüs

Andmed esitati kui keskmine ± SEM. Erinevuse olulisus määrati Studenti t-testi, kahesuunalise dispersioonanalüüsi või ühesuunalise dispersioonanalüüsi (ANOVA) abil, millele järgnes Tukey post hoc test. Erinevust peeti oluliseks P<>

3. Tulemused

Tulemus1. Ka taastab motoorse düsfunktsiooni ja suurendab dopamiini taset MPTP/p PD mudelhiirte juttkehas

Kaoni PD patogeneesi neuroprotektiivse toime uurimiseks süstiti 4-kuustele isastele C57BL/6 hiirtele MPTP/p PD mudeli loomiseks neurotoksiini MPTP ja neid raviti Ka-ga (joonis la). Pärast mudeli esilekutsumist kasutati hiirte motoorse ja käitumusliku jõudluse hindamiseks erinevates rühmades rotarod-testi ja poolustesti. Nagu näidatud, vähenes MPTP-ga töödeldud hiirtel rotarodi jõudlusaeg märkimisväärselt ja Ka takistas seda mõju (joonis 1b). (cistanche tubulosa eelised) Ka taastas ka MPTP-st põhjustatud käitumuslikud puudujäägid, mida näitab pöördeaja ja koguaja lühenemine pooluse testis (joonised 1c ja d), ilma et see mõjutaks hiirte kehakaalu (joonis 1). le). Lisaks näitas HPLC analüüs, et MPTP/p-ga nakatunud hiirtel oli dopamiini tase juttkehas oluliselt langenud ja see tase taastati Ka-raviga (joonis 1f). (Cistanche tubulosa ekstrakt) Ka ravi leevendas ka MPTP/p p-indutseeritud dihüdroksüfenüüläädikhappe (DOPAC, dopamiini metaboliit) taseme langus juttkehas (joonis 1g).supermani ürdid cistancheNeed tulemused viitavad sellele, et Ka taastab motoorse düsfunktsiooni ja suurendab MPTP-indutseeritud PD hiirte juttkeha dopamiini taset.

Tulemus 2. Ka leevendab DA neuronite kadu MPTP/p PD mudelhiirte SNpc-s

Järgmisena uurisime Kaon MPTP / p-indutseeritud DA neuronite kahjustuse neuroprotektiivse toime edasiseks hindamiseks türosiinhüdroksülaasi (TH) neuroneid hiire SNpc-s immunovärvimise teel. Nagu on näidatud joonistel 2a ja b, indutseeris MPTP/p TH-neuronite arvu olulise vähenemise, mida Ka-ravi leevendas. Lisaks on Nissli määratletud neuronite koguarvu stereoloogiline arv SNpc-s

Joonis 1. Ka-ravi leevendab motoorset düsfunktsiooni ja suurendab dopamiini taset MPTP / p PD mudeli hiirte juttkehas.

(a) Katse ülesehituse skemaatiline diagramm. (cistanche tubulosa reddit) (b) Vardale kulunud aega mõõdeti kolmel järjestikusel päeval rotarod-testi jaoks. (cd) Teivastesti jaoks registreeriti ümberpööramiseks kulunud aeg (pööramise aeg) ja teivast laskumiseks (ronimise aeg). (e) Hiirte kehamass mõõdeti uuringu lõpus. (fg)Dopamiini (DA) ja dihüdroksüfenüüläädikhapet (DOPAC) juttkehas analüüsiti kõrgsurvevedelikkromatograafiaga. Andmed on väljendatud keskmisena ± SEM.n=9-10 iga rühma kohta (b,c,d);n=6-8 iga rühma kohta (f,g).ns, ei ole oluline,* P<><><0.001, by="" one-way="" anova="" followed="" by="" tukey's="" post="" hoc="" test.="" mptp,1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine;="" ka,kaempferol.="" staining,="" verified="" that="" the="" loss="" of="" th+="" cells="" reflected="" cellular="" death="" but="" not="" the="" downregulation="" of="" th="" expression="" and="" showed="" that="" ka="" treatment="" restored="" the="" decrease="" in="" the="" number="" of="" nissl-positive="" neurons="" in="" the="" snpc="" of="" mptp-treated="" mice="" from="" 43.3%="" to="" 25.4%="" (fig.="" 2c="" and="" d).in="" addition,="">bioflavonoidide eelisedKa leevendas oluliselt MPTP-indutseeritud TH- ja DAT-valgu ekspressiooni vähenemist, mõõdetuna Western blot analüüsiga (joonis 2e-g). Need tõendid kinnitavad Kaoni neuroprotektiivset toimet PD hiiremudelis.

Tulemus 3. Ka vähendab LD vakuoolide kuhjumist ja oksüdatiivset stressi MPTP/p-ga töödeldud hiirte SNpc-s

Üha rohkem tõendeid on näidanud LD-de osalust NDD-des [10], järjekindlalt tuvastas meie eelmine töö MPTP-indutseeritud PD-hiirte SNpc-de suurenenud LD-sid [12]. LD-sid saab hõlpsasti tuvastada ja neil on ümmargused madala tihedusega homogeensed struktuurid. amorfne sisu [28]. Tavaliselt saab LD-sid lagundada autofagia kaudu, et vältida akumuleerumist [29].osta cistancheEt uurida, kas Ka võib reguleerida LD-sid PD-s, analüüsiti LD-de kogunemist transmissioonelektronmikroskoopia (TEM) abil kontroll-, MPTP/p ja MPTP/p ＋ Ka hiirte SNpc-s. Nagu on näidatud meie eelmises töös [12], oli LD-de arv ja suurus

suurenes MPTP/p hiirtel võrreldes soolalahusega töödeldud kontrollidega (joonised 3a ja b) ning vähenes oluliselt Ka-ga töödeldud hiirtel (joonis 3c-e). Veelgi enam, Ka-ga töödeldud hiirtel täheldati LD-sid sagedamini ka läheduses, autolüsosoomidesse suletud või nende poolt lagunenud, mida määratleti elektrontihedate lipofustsiini graanulitena. TH-neuronite edasine histoloogiline värvimine BODIPY-ga, värvainega, mis märgistab spetsiifiliselt neutraalseid lipiide ja mida tavaliselt kasutatakse LD-de tuvastamiseks [30], näitas, et nii BODIPY kui ka LD-de arv ja suurus SNpc-s olid PD-hiirtel kõrgemad kui kontrollides. ja vähenesid oluliselt Ka-ravi tõttu (joonis 3f-h).

Kui LD-sid ei saa õigeaegselt lagundada, võivad kogunenud LD-d läbida peroksüdatsiooni ja soodustada mitokondriaalset ROS-i vahendatud stressi [4],vahemaamis võimendab neurotoksilisust ja haiguse progresseerumist. Seetõttu uurisime täiendavalt geenide ekspressiooniprofiile, mis on seotud kaitsega vaba FA toksilisuse (Gpx8), neutraliseerivate oksüdatiivsete liikide, superoksiidi radikaalide (Sod3) ja vesinikperoksiidi (Cat) ning FA metabolismi (Acsbg1 ja Dbi) eest, nagu on teatatud [31] , mis kõik olid MPTP-ga töödeldud hiirte SNpc-s võrreldes kontrollidega märkimisväärselt vähenenud, ja need mõjud paranesid Ka-ga töödeldud PD hiirtel (joonis 3i). Samamoodi suurendas MPTP / p ka mRNA ekspressioonitasemeid

Joonis 2. Ka leevendab DA neuronite kadu MPTP / p PD mudeli hiirte SNpc-s.

(ab) Türosiinhüdroksülaas(TH)-positiivsete neuronite mikrofotod (a) ja TH-positiivsete neuronite stereoloogiline arv nigra pars compacta's (SNpc) (b). Skaalaribad on näidatud. (cd) Kresüülviolet-positiivsete rakkude mikrofotod (c) ja kresüülviolet-positiivsete rakkude stereoloogiline arv SNpc-s (d). Skaalariba, 120 um. (nt) TH- ja DAT-valgu ekspressiooni Western blot analüüs SNpc-s (e) ja kvantitatiivne analüüs (f,g). Kvantifitseeritud andmed normaliseeritakse soolalahuse kontrollrühmaga. Andmed on väljendatud keskmisena ± SEM.*P<><0.01, by="" one-way="" anova="" followed="" by="" tukey's="" post="" hoc="" test.n="4-5" for="" each="" group.="" ve,="" vehicle,="" ka,="" kaempferol;="" mptp,1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydroloyridine..="" (for="" interpretation="" of="" the="" references="" to="" color="" in="" this="" figure="" legend,="" the="" reader="" is="" referred="" to="" the="" web="" version="" of="" this="" article.="" of="" nadph="" oxidase="" subunits="" such="" as="" nox1,="" nox2,="" and="" nox4="" in="" the="" snpc="" of="" mptp/p="" mice,="" which="" were="" further="" blunted="" by="" ka="" treatment="" (fig.="" 3j).="" taken="" together,="" these="" data="" suggest="" that="" ka="" alleviates="" mptp/p-induced="" ld="" accumulation,="" peroxidation,="" and="" ros-mediated="">

Tulemus 4. Ka kaitseb SH-SY5Y rakke MPP pluss-indutseeritud apoptoosi eest

MPP, MPTP aktiivne metaboliit, inhibeerib mitokondriaalseid kompleksseid ensüüme ja põhjustab rakusurma, mis on otseselt seotud PD-ga [32]. Järgmisena uurisime, kas Ka võib in vitro vältida MPPt-indutseeritud neuronaalset apoptoosi. Nagu on näidatud joonistel fig 4a ja b, indutseeris MPPt (40 uM, 24 h) LDH vabanemist SH-SY5Y rakkudest ning Ka (30 ja 60 uM) nõrgendas oluliselt LDH vabanemist, mõjutamata rakkude ellujäämist (joonis 4a). Kuna Ka kutsus esile olulise kaitsva toime kontsentratsioonil 30 μM (joonis fig. Nagu on näidatud joonisel 4b), kasutasime seda kontsentratsiooni järgmistes katsetes. Hoechsti/PI värvimistulemused näitasid ka, et Ka vähendas oluliselt MPPt-indutseeritud kromatiini kondensatsiooni (joonis 4c ja d) ja raku apoptoosiga rakkude protsenti, mida tõendab Hoechsti suurenenud fluorestsentsi intensiivsus (joonis 4c) ja rakkude protsent. Hoechst/PI-ga värvitud rakud (Hoechst pluss /PI') (joonis 4e). Samuti, nagu tuvastati voolutsütomeetria abil, oli MPP pluss indutseeritud raku apoptoos, mida tõendab anneksiin V-ga värvitud rakkude (AV/PI ja AV pluss /PI plus) suurenenud protsent, kaitstud Ka-ga (joonised 4f ja g). Lisaks muutis Ka märkimisväärselt ümber MPP-indutseeritud muutused apoptoosiga seotud valgu ekspressioonis, mida tõendavad Bcl-2 ülesreguleerimine, Baxi allareguleerimine (joonis 4hi-j) ja kaspaasi-3 vähenenud lõhustumine. (Joon. 4h, k). Need andmed viitavad sellele, et Ka võib kaotada MPPt kahjuliku mõju rakkude ellujäämisele.

Tulemus 5. Ka pärsib MPPt-indutseeritud LD akumulatsiooni ja lipiidide peroksüdatsiooni, mis vahendavad mitokondriaalseid kahjustusi SH-SY5Y rakkudes

Hiljutised uuringud on näidanud, et ootamatu LD akumuleerumine võib põhjustada suurenenud lipiidide peroksüdatsiooni vahendatud stressi ja kiirendada mitokondriaalset düsfunktsiooni, mis soodustab neurodegeneratsiooni [10]. Meie eelmine töö näitas ka, et suurenenud LD-d SNpc-s olid seotud PD patoloogiaga hiirtel [12]. Et uurida, kas Ka kaitsev toime oli seotud LD akumulatsiooniga in vitro, teostasime esmalt LD-spetsiifilise värvimise SH-SY5Y rakkudes, kasutades BODIPY 493/503 ja täheldasime suurenenud LD ladestumist (neutraalsete lipiidide kõrgendatud tasemed)

Tulemus 6. Ka soodustab autofagiat ja vähendab mtROS-i tootmist MPP plussiga töödeldud SH-SY5Y rakkudes

Tavaliselt toimetatakse LD-d lüsosoomidesse autofagia kaudu ja neid saab peroksüdatsiooni vältimiseks FA-deks jagada. Kuid tõendid näitavad, et autofagia on kahjustatud, mis mängib PD puhul otsustavat rolli [2]. Kui autofagia hõlmab LD-de jaotamist lüsosoomides (joonis 6a), nimetatakse seda protsessi konkreetselt lipofaagiaks [2]. Et uurida, kas autofagia on seotud Ka neuroprotektiivse toimega, uurisime autofagiaga seotud valkude taset. Nagu on näidatud joonistel 6b-d, vähenes kultiveeritud SH-SY5Y rakkudes mikrotuubulitega seotud valgu kerge ahela 3 (LC3)-II tase märgatavalt, samas kui p62 ekspressioon suurenes märgatavalt MPP plussiga töödeldud rakkudes. mõõdetuna immunoblotanalüüsiga ja Ka muutis selle efekti oluliselt vastupidiseks. Lisaks uurisime autofagia muutusi LC3 immunovärvimise teel. Autofagosoomide akumuleerumiseks rakkudes lisati bafilomütsiini, et vältida autofagosoomide sulandumist lüsosoomidega. Nagu näidatud, tuvastati MPP*-ga töödeldud rakkudes suurenenud LC3b puncta arv, mis viitab halvenenud autofagilisele lagunemisele, ja selle efekti muutis ka Ka (joonised 6e ja f). Need tulemused näitavad, et SH-SY5Y rakkude LD-d mobiliseeritakse autofagia abil lõplikuks eemaldamiseks ja et Ka võib soodustada autofagiat, et vähendada oksüdeeritud lipiidide akumulatsiooni. Suurenenud lipiidide peroksüdatsioon võib süvendada mitokondriaalset kahjustust, suurendades mitokondriaalset oksüdatiivset stressi [4]. Lisaks vähendas Ka-ravi märkimisväärselt tugevat mtROS-i teket, mis määrati MitoSOX-i värvimisega (joonised 6g ja h), ning vähendas düsfunktsionaalsete mitokondrite arvu, mis on määratud mitokondrispetsiifiliste siltidega, et eristada hingamist (MitoTracker sügavpunane) ja kogu (joonis 6g ja h). MitoTracker roheline) mitokondrid (joonis 6i ja j). Lisaks tuvastasime mitokondriaalsete muutuste otseseks nägemiseks Seahorse XF analüsaatori abil hapniku tarbimise määra (OCR). Nagu on näidatud joonisel fig 6k, vähenes mitokondrite hingamine MPPt-ga töödeldud rakkudes, samas kui Ka-ravi muudab selle MPP plussi põhjustatud kahjustuse ilmselgelt tagasi (joonis 6k).

Tulemus7. Autofagia inhibeerimine pöörab ümber Kaon LD akumulatsiooni, mitokondriaalse düsfunktsiooni ja DA neuronaalse kahjustuse pärssiva toime in vitro

Et uurida, kas autofagia on üks peamisi mehhanisme, mille kaudu Ka vahendab DA neuroprotektsiooni, kasutati autofagia inhibiitorit 3-MA. Leidsime, et Ka inhibeeriv toime MPP#-indutseeritud vigastustele, sealhulgas vähenenud LD akumulatsioon (joonis 7a ja b), vähenenud mtROS produktsioon (joonis 7c ja d) ning leevendatud mitokondriaalne düsfunktsioon (joonis 7e ja f) SH-SY5Y rakud blokeeris oluliselt 3-MA. Kuna LD oksüdatsioon ja mitokondriaalne düsfunktsioon on tihedalt seotud DA neuronite surmaga, uurisime järgmisena esmaselt kultiveeritud DA neuroneid. Töötlesime kultiveeritud mesencephalon TH pluss neuroneid Ka ja / või MPPf-ga ning kvantifitseerisime TH pluss neuronaalsete protsesside arvu ja pikkuse immunovärvimisega. Morfoloogiline analüüs näitas, et MPP pluss vähendas märkimisväärselt neuronaalsete protsesside arvu ja pikkust ja kaitses Ka ning seda kaitset muutis veelgi 3-MA (joonis 7g-i). Need andmed näitavad, et Ka leevendab DA neuronaalset kahjustust, soodustades autofagiat.

Tulemus 8. Atg5 vaigistamine kaotas Ka-vahendatud neuronite kadumise vältimise in vivo

Et veelgi kinnitada, et Ka kaitseb autofagiast sõltuval viisil MPTP / p-indutseeritud TH ja neuronite kadumise eest, vaigistasime Atg5, mikrosüstides adeno-assotsieerunud viirust (AAV), mis ekspresseerib eelnevalt iseloomustatud shRNA-d Atg5 vastu kahepoolsesse mesencefaloni (joonis 1). .8a), nagu eelnevalt kirjeldatud [25]. Esialgsetes katsetes täheldasime, et Atg5 shRNA transfektsioon 2 nädala jooksul saavutas piisava GFP ekspressiooni TH pluss neuronites (joonis 8b) ja inhibeeris ATG5 ekspressiooni süstitud hiirte SNpc-s (joonis fig. 8c). Leidsime, et Atg{13}}knockdown muutis Ka neuroprotektiivse toime, mida tõendab TH ülesreguleeritud valguekspressioon (joonised 8d ja e) ning TH pluss neuronite arvu suurenemine (joonis 8f ja g). Need andmed toetavad veelgi autofagia panust Ka kaitsvasse toimesse PD hiirtel. Kokkuvõtteks kinnitasime, et Ka kaitseb MPTP / p-indutseeritud vigastuste eest, vähendades LD oksüdatsiooni ja mitokondriaalset düsfunktsiooni, soodustades autofagiat.

4. Arutelu

Käesolev uuring näitas, et looduslik väike molekul Ka oli võtmetegur, mille abil autofagiline signaalimine võib pärssida lipiidide oksüdatiivset toksilisust. Meie tulemused näitasid, et autofagia rada on peamine regulatiivne silmus, mille kaudu Ka leevendab LD peroksüdatsiooni ja sellele järgnevat mitokondriaalset kahjustust ning keskendus autofagiaga reguleeritud LD toksilisuse rollile mitokondriaalsete kahjustuste leevendamisel, vältides samal ajal liigsest oksüdatiivsest stressist tingitud neurodegeneratsiooni (joonis 1). 9).

LD-d on neutraalsete lipiidide säilitamise intratsellulaarsed kohad [5] ja on kriitilised lipiidide metabolismi ja energia homöostaasi jaoks, samas kui LD düsfunktsiooni on seostatud paljude haigustega [16]. Kogunev tõendusmaterjal on näidanud, et LD-de roll bioloogias ja patoloogias on oluliselt laiem, kui varem arvati. Kesknärvisüsteemis on tõendid näidanud, et suurenenud LD-d neuronites ja glia on seotud neurodegeneratiivse patoloogiaga [10,36]. Üksikasjalikult on LD-sid tuvastatud nii in vitro kultiveeritud Aplysia neuronite aksonites [37] kui ka ajuosades Huntingtoni tõve mudelid [38]. Lisaks näidati, et neuronid on eriti tundlikud lipiidide toksilisuse suhtes ning LD-de kuhjumine, mida ei saa õigeaegselt eemaldada, põhjustab LD peroksüdatsiooni kiirenemist ja võib põhjustada neurodegeneratsiooni [17].

Lipiidide kogunemine hüperaktiivsetesse neuronitesse on toksiline mitte ainult nende lipiidide tundlikkuse tõttu peroksüdatsioonile. Lisaks võib liigsete LD-de sisu sattuda mitteoksüdatiivsetesse metaboolsetesse radadesse, käivitades liigse keramiidi tootmise, mis on rakkudele toksiline [39]. Hiljutised uuringud on samuti näidanud, et LD-defektsetes rakkudes saab FA-sid muundada atsüülkarnitiinideks, mis seejärel põhjustavad mitokondriaalset düsfunktsiooni ja ROS-i tootmist [40]. Neil protsessidel on hüperaktiivsetes neuronites tõenäoliselt spetsiifilised ja sügavad tagajärjed, kuna düsfunktsionaalsed mitokondrid kahjustavad FA tarbimise võimet ja mtROS-i tootmine põhjustab veelgi membraani lipiidide peroksüdatsiooni.

Seega peaks LD homöostaas olema neuronites hästi kontrollitud, mis on kriitilise tähtsusega toksilisuse vältimiseks ja lõpuks aju tervise säilitamiseks. Käesolevas uuringus leidsime, et väike looduslik molekul Ka pärsib neuronaalset LD toksilisust, mis väljendus suurenenud LD akumulatsioonis, kõrgenenud lipiidide peroksüdatsioonis ja lipiidide toksilisusega seotud geeniekspressioonis MPP#-ga kahjustatud SH-SY5Y rakkudes. Veelgi olulisem on see, et oleme näidanud, et Ka-ravi vähendab 45]. Käesolevas uuringus täheldasime defektset autofagiat/lipofagiat MPPt-ga kahjustatud neuronaalsetes rakkudes, sealhulgas vähenenud LC3-II taset ja suurenenud p62 ekspressiooni ning suurenenud rakkudesse ladestunud LC3B puncta arv. Vigastatud SH-SY5Y rakkude defektne lipofagia tühistati töötlemisega Ka-ga. Selle tulemusena vähendas Ka oksüdeeritud LD-de, kahjustatud mitokondrite ja mtROS-i teket MPP#-ga töödeldud SH-SY5Y rakkudes. Oluline on see, et autofagia inhibeerimine 3-MA poolt kaotas oksüdeerunud LD-de ja kahjustatud mitokondrite Ka-vahendatud eliminatsiooni ning DA neuronite kahjustuse leevendamise in vitro. Veelgi enam, autofagia inhibeerimine Atg5 knockdowniga in vivo muutis Kaon DA neuronaalse degeneratsiooni kaitsva toime MPTP-indutseeritud PD hiiremudelis. Need leiud näitavad ühiselt, et Ka pärsib LD toksilisusega seotud mitokondriaalseid kahjustusi, soodustades eksperimentaalses PD mudelis autofagiat.

Kogunev tõendusmaterjal näitab, et suurenenud mtROS-i teke on kõrge aktiivsusega neuronite peamine omadus ja seda on täheldatud paljudes NDD-des, sealhulgas PD-s [46]. Aruanded selle kohta, kas ROS on LD moodustumise põhjus või tagajärg, on vastuolulised [47, 48]. Huvitaval kombel näitasid meie in vitro tulemused, et LD peroksüdatsiooni farmakoloogiline inhibeerimine o-tokoferooliga takistas mtROS-i teket ja mitokondriaalse membraani potentsiaali kõrvalekaldeid ning leevendas mitokondriaalset vähenemist, mida tõendab Tomm20 värvimine SH-SY5Y rakkudes, mis toetab ideed, et LD peroksüdatsioonil on põhjuslik roll MPP-indutseeritud mitokondriaalses düsfunktsioonis ja mtROS-i tekkes. Siiski on võimalik, et kõrgenenud ROS kiirendab algselt LD moodustumist ja seejärel indutseerivad LD-d edasist ROS-i teket ja süvendavad rakusisest ja mitokondriaalset ROS-i taset.

Käesolevas uuringus näitasime, et MPTP-indutseeritud PD-ga hiirtel oli kõrge LD-i akumulatsiooni tase, millega kaasnes DA-neuronite suurenenud kadu, kiirenenud ROS-vahendatud stress ja käitumishäired. Ka-ravi hoidis ära LD toksilisuse in vitro ja leevendas DA neuronite kadu ja käitumishäireid PD hiiremudelis ning need mõjud sõltusid autofagiast. Seetõttu on mõistlik järeldada, et Ka soodustab autofagiat ja see suurenenud autofagia vähendab oksüdeeritud LD akumulatsiooni, vähendab mtROS-i tootmist ja leevendab mitokondriaalseid kahjustusi DA-neuronites, mis aitab kaasa LD toksilisuse pärssimisele, nõrgendades seeläbi PD patoloogiat (joonis 1). . 9).

Rahastamine

Seda uurimistööd toetasid Hiina riikliku loodusteaduse fondi (nr 81903587), Hiina järeldoktorantuuri sihtasutuse (nr 2019M661807), Jiangsu provintsi loodusteaduste sihtasutuse (nr BK20190120) ja Hiina teadusfondi rahastatud projektid. Nanjingi Hiina Meditsiini Ülikooli Hiina Materia Medica esimese klassi distsipliini avatud projekt (nr 2020YLXK006) ja ravimiinnovatsiooni suurprojekt (nr 2018ZX09711001-003-007).

See artikkel on välja võetud ajakirjast Redox Biology 41 (2021) 101911