3. osa uuringud on näidanud, et autofagia mängib olulist rolli rakulise LD ladestumise reguleerimisel

Palun võtke ühendustoscar.xiao@wecistanche.comrohkem informatsiooni

ABSTRAKTNE

Uued tõendid näitavad, et ootamatu lipiidipiiskade (LD) sadestumine ja peroksüdatsioon võivad kiirendada organellide stressi ja mängivad olulist rolli neurodegeneratiivsete haiguste (NDD) patogeneesis. Meie eelmises uuringus kinnitasime, et kaempferool (Ka), looduslik flavonoidi väike molekul, avaldas LPS-indutseeritud Parkinsoni tõvega (PD) hiirtele neuroprotektiivset toimet. Lisaks on varasemad uuringud näidanud, et autofagia mängib olulist rolli raku LD ladestumise reguleerimisel. Käesolevas uuringus näitasime, et Ka kaitses MPTP / p-indutseeritud PD hiirtel TH pluss neuronite kadumise ja käitumishäirete eest, millega kaasnes vähenenud lipiidide oksüdatiivne stress substantia nigra pars compacta (SNpc) puhul. Kultiveeritud neuronaalsetes rakkudes oli Ka suhteliselt ohutu kontsentratsioonivahemik ja see pärssis oluliselt MPP pluss poolt indutseeritud LD akumulatsiooni ja raku apoptoosi. Edasine uuring näitas, et Ka kaitsev toime sõltus autofagiast, täpsemalt lipofagiast. Kriitiliselt soodustas Ka autofagiat, et vahendada LD lagunemist lüsosoomides, mis seejärel leevendas lipiidide ladestumist ja peroksüdatsiooni ning sellest tulenevaid mitokondriaalseid kahjustusi, vähendades järelikult neuronite surma. Lisaks kaotas AAV-shAtg5-vahendatud Atg5 knockdown Ka neuroprotektiivse toime lipiidide oksüdatsiooni vastu PD hiirtel.Cistanche mälu parandamiseksSee töö näitab, et Ka hoiab ära dopamiinergilise neuronaalse degeneratsiooni PD-s lipiidide peroksüdatsiooni poolt vahendatud mitokondriaalse kahjustuse pärssimise kaudu, soodustades huulte autofagiat, ja pakub potentsiaalset uudset ravistrateegiat PD ja sellega seotud NDD-de jaoks.

Lisateabe saamiseks klõpsake siin

Sissejuhatus

Parkinsoni tõbi (PD) on levinud neurodegeneratiivne haigus (NDD), mida patoloogiliselt iseloomustab dopamiinergiliste (DA) neuronite järkjärguline kadumine substantia nigra pars compacta (SNpc)[1]. Kuigi selle haiguse täpset etioloogiat ja loomulikku kulgu ei ole veel täielikult välja selgitatud, on PD patogeneesis kaasatud arvukad süsteemitasandi protsessid ja düsfunktsioonid, sealhulgas mitokondriaalsed funktsioonid, dopamiini homöostaas, neuropõletik ja autofagia [1, 2]. Hiljutised aruanded näitasid, et lipiidipiiskade (LD) seotud lipotoksilisus võib osaleda PD patoloogias [3,4]. LD-d on väga dünaamilised organellid, mis väljuvad endoplasmaatilise retikulumi (ER) membraanist ja toimivad tavaliselt neutraalse lipiidide säilitamise rakusiseste kohtadena [5]. Hiljuti näidati, et LD-d mängivad palju laiemat rolli kui rasvhapete (FA) säilitamine ja osalevad paljudes haigustes. (Cistanche para que serve) Näiteks müeloidrakud, sealhulgas makrofaagid, leukotsüüdid ja eosinofiilid, moodustavad vastusena põletikule ja stressile LD-sid,cistanche hiina keelesja LD-d on põletikuliste tsütokiinide tootmise ja säilitamise kohad ning on lisaks seotud antigeeni esitlemise ja patogeeni kliirensiga [6]. Oluline on see, et ateroskleroosi korral on LD-rikkad vahtrakud haiguse kõigis etappides kahjulikud [7].

Cistanche võib parandada immuunsust

Siiski ei ole LD-sid kesknärvisüsteemis (KNS) põhjalikult uuritud, vähesed paberid kirjeldavad LD-de histoloogilist esinemist inimese ajukoes [8, 9]. Sellegipoolest võivad LD-d omada ajus olulisi funktsioone, kuna hiljutised uuringud kinnitasid, et glia agregeeritud LD-d kiirendasid Drosophila mudelis neurodegeneratsiooni [10]. Hiljuti on teatatud, et hiirtel on õlipunased O-positiivsed lipiididega koormatud rakud, sealhulgas neuronid, gliaalfibrillaarse happelise valgu (GFAP)t astrotsüüdid ja ioniseeritud kaltsiumi siduv adaptermolekul-1 (IBA{{7}). })t mikroglia, esinevad paljudes ajupiirkondades ja on näidanud, et nad osalevad vanusega seotud protsessides [11]. Meie eelmine töö näitas ka suurenenud LD akumuleerumist ajus PD hiiremudelis [12]. Kokkuvõttes näitavad need uuringud, et LD-d võivad olla seotud PD, aga ka teiste NDD-de patogeneesiga.

Tavaliselt lagunevad rakusisesed LD-d lüsosoomides ja toimetavad FA-d mitokondritesse, et neid tarbida alternatiivse energiaallikana toitainete ammendumise perioodidel [13]. Neuronidel on aga vähene mitokondriaalse FA tarbimise võime energia tootmiseks [14]. See omadus muudab neuronid eriti tundlikuks LD akumulatsiooni ja peroksüdatsiooni suhtes. Lisaks suurendab LD-de akumuleerumine FA oksüdatsioonikiirust ja avaldab mitokondriaalsele elektronide transpordiahelale püsivat survet, mis suurendab oksüdatiivse stressi võimendamiseks elektronide transpordiahela komplekside I ja III [15] reaktiivsete hapnikuliikide (ROS) tootmist. Lipiidide ülekoormus põhjustab ka ROS-i tootmist ekstramitokondriaalsetest allikatest, nagu nikotiinamiidadeniindinukleotiidfosfaat (NADPH) oksüdaasid ja muud oksüdatiivsed ensüümid. Koos antioksüdantsete ensüümide vähenenud ekspressiooni ja neuronite vähese FA tarbimise võimega vahendab LD akumuleerumine oksüdatiivset stressi ja võib veelgi põhjustada mitokondriaalseid kahjustusi, lüsosomaalset düsfunktsiooni, defektset autofagiat ja põletikuliste reaktsioonide aktiveerumist [16,17]. Kui kogunenud LD-sid ei saa inhibeerida või eemaldada, läbivad väga aktiivsed neuronid patofüsioloogia, mis põhjustab neurodegeneratsiooni [17]. (Cistanche peenis) Tõendid näitavad, et lüsosoomide vahendatud kataboolne protsess, mida nimetatakse autofagiaks, mängib keskset rolli rakulise LD homöostaasi säilitamisel mitmes koes [17,18]. Üksikasjalikult,cistanche peenise kasvLD-sid saab selektiivselt sekvestreerida autofagosoomides ja toimetada lüsosoomidesse lagunemiseks lüsosomaalsete happelipaaside poolt, mis on spetsiifiliselt lipofaagiana tuntud protsess [19]. Seetõttu võib LD-de sihtimine ja nende autofagiline eemaldamise rada kujutada endast uudset lähenemisviisi neurodegeneratsiooni juhtimisele.

Viimastel aastatel on tohutut huvi pälvinud looduslike toodete ja dieetainete uurimine võimalike NDD-ravi ja strateegiate allikatena [20]. Kaempferool (Ka) on looduslik polüfenoolne väike molekul, mida võib leida paljudest Hiina ravimtaimedest ja toiduallikatest [21]. On teatatud, et Ka avaldab antibakteriaalset, vananemisvastast ja immunomoduleerivat toimet, samuti antioksüdantset ja neuroprotektiivset toimet [20, 22, 23]. Varem teatati, et Ka inhibeerib põletikku BV2 mikrogliiarakkudes in vitro [24] ja suurendab DA neuronite resistentsust neuropõletiku suhtes in vivo [25]. Kaoni LD-de mõju PD-le ei ole siiski veel uuritud.

Arvestades LD-de tähtsust ja LD-de, mitokondrite ja autofagia vahelist intiimset seost [16], mis kõik on seotud PD-ga, oletame, et Ka pärsib LD peroksüdatsiooni ja takistab DA neurodegeneratsiooni PD-s. Käesolevas uuringus näitasime, et Ka kaitses märkimisväärselt neurodegeneratsiooni eest hiire PD mudelis, inhibeerides LD akumulatsiooni. (Cistanche pulber) Täiendav uuring näitas, et Ka vallandas autofagia ja vähendas oksüdeeritud LD-de akumuleerumist, et leevendada mitokondriaalset düsfunktsiooni ja mitokondriaalset ROS-i (mtROS) tootmist, vältides seeläbi neuronaalset apoptootilist surma.cistanche propiedaadidSelles uuringus saadud tulemused võivad aidata suunata kliinilisi otsuseid loodusliku molekuli Ka kasutamise kohta NDD-des, nagu PD.

2. Materjalid ja meetodid

2.1. Katseloomad

C57BL/6J hiired (isased, 4-kuused) saadi ettevõttest Nanjing Medical University Animal Core (Nanjing).cistanche tubulosa beneficiosHiiri hoiti ja kasvatati Nanjingi Meditsiiniülikooli arstiteaduskonna loomaressursside keskuses ja Nanjing Drum Toweri haigla loomakasvatusasutuses. Hiirtel on vaba juurdepääs toidule ja veele ruumis, mille ümbritseva õhu temperatuur on 22 kraadi ± 2 kraadi ja valguse/pimeduse tsükkel 12:12 tundi. Kõik loomkatsed viidi läbi rangelt kooskõlas riiklike tervishoiuinstituutide laboriloomade hooldamise ja kasutamise juhendi juhistega.

2.2.Reaktiivid

MPTP(M0896),3-MA(M9281),penicillin-streptomycin (V900929), sodium pentobarbital, and probenecid were purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Kaempferol (HPLC>95%) for in vivo treatment was purchased from Nanjing Jingzhu Biotechnology Co., Ltd (Nanjing, China), kaempferol (HPLC>99.0 protsenti,96 353) in vitro katsete jaoks saadi firmalt Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). BODIPY 493/503 (D3922), BODIPY 581/591 C11 (D3861) ja DHE (D11347) osteti firmalt Thermo Fisher Scientific. Loomkatsetes lahustati Ka 10% DMSO lahuses 16% SBE- -CD-s steriilses soolalahuses. Rakukatsete jaoks valmistati Ka DMSO-s (Sigma-Aldrich) ja PBS-is (DMSO lõppkontsentratsioon on 0,01 protsenti), pH 7,4.

2.3. Metüül-4-fenüül-1,2,3,6-tetrahüdropüridiini (MPTP) indutseeritud PD hiiremudeli esilekutsumine ja ravi

Ka mõju hindamiseks MPTP/p-toksilisuse PD mudelis jagati hiired (isased, 4-5 kuu vanused) juhuslikult soolalahusega töödeldud rühma, MPTP-ga ravitud rühma, MPTP pluss Ka-ga ravitud rühma. , ja Ka üksi ravitud rühm. MPTP-ga ravitud rühmas manustati hiirtele kroonilist MPTP-d vastavalt eelnevalt kirjeldatule [26]: MPTP lahustati soolalahuses ja süstiti subkutaanselt annuses 25 mg/kg, millele järgnes 250 mg/kg probenetsiidi (lahustatuna dimetüülsulfoksiidis). intraperitoneaalne (ip) süstimine 1-tunniste intervallidega iga 3,5 päeva järel 5 nädala jooksul. (tsistanšijuur) Kontrollhiired said soolalahuse ja probenetsiidi süsti. MPTP pluss Ka-ga ravitud rühmas said hiired Ka (50 mg/kg, üks süst/päevas katsete ajal, Jingzhu Biotechnology, Nanjing, Hiina) intraperitoneaalselt (ip) iga päev 3 päeva enne ravi MPTP-ga ja üle 5 MPTP. süstimisnädalad. Nädal pärast viimast MPTP süsti tehti hiirte käitumistestid, mis olid rühmade suhtes pimedad. Pärast seda anesteseeriti kõik hiired 40 mg/kg naatriumpentobarbitaaliga ja ohverdati ajuvalkude tuvastamiseks ja immunohistokeemia või qPCR analüüsi jaoks.

2.4. In vivo stereotaksiline kirurgia ja eksperimentaalsed ravimeetodid

Stereotaksiline operatsioon naatriumpentobarbitaali anesteesia all (40 mg/kg, ip) viidi läbi nagu kirjeldatud [25]. Hiire Atg5 ja kontroll-shRNA transfekteeriti AAV genereerimiseks pakkevektoritega (AAV-U6-CMV-she-NA-EGFP). Mikrosüstimiseks asetatakse tuimestatud hiired stereotaksilisse aparaati. Neile süstiti 1 μL AV-d klaaselektroodiga, mis oli suunatud DG-le (AP: -0,3 mm; ML: ±0,13 mm; DV: -0,45 mm) kiirusega 0,25 μL/min. Seejärel hoiti nõela alles veel 2-min. 2 nädalat pärast viiruse mikrosüstimist allutati hiirtele MPTP-indutseeritud PD mudeli juhtivus ja (või) Ka ravi.

Atg5 shRNA saadi ettevõttelt Hanbio Biotechnology (Shanghai, China) Co., Ltd. Atg5 vaikuse jaoks on praimerid näidatud täiendavas tabelis 1.

2.5. Käitumisanalüüs

Nädal pärast MPTP või soolalahuse viimast süstimist viidi läbi rotarod-test ja pooluste test, nagu eelnevalt kirjeldatud [27]. Rotarod-testi jaoks aklimatiseeriti hiired rotarodiga kahes katses (6 minutit kiirendatud kiirusega 12-20 pööret minutis) päevas 2 päeva järjest enne katse algust. Seejärel testiti hiiri kiirusel 20 pööret minutis 300 sekundit ülejäänud 3 järjestikuse päeva jooksul. Languse latentsusaeg registreeriti Rotarodi analüüsisüsteemi abil (Jiliang, Shanghai, Hiina). Varrastesti jaoks asetati hiired pea püsti vertikaalse puidust varda otsa (kareda pinnaga, kõrgus 50 cm, läbimõõt 1 cm). Kõik hiired olid aparaadiga harjunud 2 päeva enne testimist ja seejärel testiti neid kolm korda kolmandal päeval. Registreeriti koguaeg (T-summa, kuni hiir jõudis oma nelja käpaga põrandale) ja pöördeaeg (T-pööre, et hiir pööras täielikult pea alla). Katse pimestati hiirerühmade suhtes iga käitumistesti jaoks ja test viidi läbi kolm korda.

2.6. Ajuproovide kogumine

Pärast viimaseid käitumisteste anesteseeriti hiired naatriumpentobarbitaaliga (40 mg/kg, ip). QPCR, Western blot analüüsi ja kõrgsurvevedelikkromatograafia (HPLC) analüüsi jaoks ekstraheeriti loomadelt kiiresti terved ajud, seejärel lõigati kiiresti lahti keskaju ja juttkeha kuded, mis külmutati eelnevalt vedela lämmastikuga. Kõiki proove säilitati kuni analüüsini -80 kraadi juures.

Immunohistokeemiliseks analüüsiks perfuseeriti hiiri transkardiaalselt 4% paraformaldehüüdiga (PFA). Ajud ekstraheeriti, järelfikseeriti, dehüdreeriti, sisestati OCT-sse (Tissue-Tek) ja ajude seerialõigud krüosekteeriti (30 μm viilu kohta) läbi iga kihi ja keskaju, kasutades külmutusmikrotoomi (Leica CM1950, Saksamaa Nussloch). ). Kõik sektsioonid koguti kuue eraldi seeriana ja ajulõike säilitati 50-protsendilises glütseroolis ja külmutati -20 kraadises kuni analüüsimiseni.

TEM-i jaoks perfuseeriti hiiri 2,5 protsendi glutaaraldehüüdiga ja 2 protsendi paraformaldehüüdiga, nagu on kirjeldatud 【12】. Väike portsjon (<1 mm³）="" of="" the="" mesencephalon="" was="" carefully="" sectioned="" and="" incubated="" in="" the="" same="" fixative="" for="" 2="" h="" at="" 4="" ℃.="" specimens="" were="" postfixed="" in="" 1%="" osmium="" tetroxide,="" stained="" in="" aqueous="" uranyl="" acetate,="" and="" then="" dehydrated="" and="" embedded="" in="" epoxy="" resin.="" ultrathin="" sections="" were="" stained="" using="" lead="" citrate="" and="" examined="" with="" a="" transmission="" electron="" microscope(jem-1010,="" tokyo,="">

2.6. Immunohistokeemiline analüüs

Ajulõike loputati PBS-s, millele järgnes 3% H2O2 10 min, seejärel inkubeeriti 1 tund 0,3% Triton X-100-ga PBS-is, millele oli lisatud 5% BSA-d. Pärast seda inkubeeriti slaide primaarsete antikehadega temperatuuril 4 kraadi üleöö PBS-is, mis sisaldas 5 protsenti BSA-d, temperatuuril 4 kraadi üleöö, seejärel pesti ja inkubeeriti sekundaarsetes antikehades 1 tund toatemperatuuril, millele järgnes inkubeerimine diaminobensidiiniga (DAB) või paigaldamine DAPI (Life Technologies, Cat P36931) immunofluorestsentsvärvina 5 minuti jooksul. Nissli värvimiseks liideti slaidid kresüülvioletses (CV) lahuses (0,1 g kresüülviolet, 99 ml H20 ja 1% äädikhapet 1 ml) 30 minutit toatemperatuuril, seejärel dehüdreeriti alkoholi ja ksüleeniga. Pilte vaadeldi ja fotod jäädvustati Olympus BX52 mikroskoobi all (Olympus America Inc., Melville, NY, Ameerika Ühendriigid). TH-positiivsete ja Nissl-positiivsete neuronite koguarv SNpc-s saadi seroloogiliselt, kasutades optilise fraktsioneerimismeetodit MicroBrightField Stereo-Investigator tarkvaraga (MicroBrightField, Williston, VT, USA).

2.7.Kõrgfektiivne vedelikkromatograafia (HPLC) analüüs

Hiirte juttkeha proovid homogeniseeriti {{0}},1 M perkloorhappega (1 mg kudesid 100μL perkloorhappes) ja 0,1 mM EDTA-s, töödeldi ultraheliga ja tsentrifuugiti kiirusel 20, 000 p/min 30 minutit, nagu on kirjeldatud [27]. Seejärel koguti mõõtmiseks supernatantvedelikud. Liikuv faas on segalahus, mis koosneb 90 mM ühealuselisest naatriumfosfaadist, 1,7 mM 1-oktaansulfoonhappest, 50 mM tsitraadist, 50 mM EDTA-st, 10 protsendilisest atsetonitriilist voolukiirusega 0,2 ml/min. Paralleelselt valmistati kvantitatiivse standardkõvera arvutamiseks dopamiini ja dihüdroksüfenüüläädikhappe (DOPAC) põhistandardlahus (Sigma-Aldrich, USA) 0,1 M HClO4-s. Süstiti 10 ul ettevalmistatud supernatanti või standardlahust. liikuvasse faasi ja testiti ESA Coulochem III elektrokeemilise detektoriga (Coulochem III, Thermo Fisher Scientific). Proove mõõdeti ja piigid kvantifitseeriti. Monoamiinide kontsentratsioonid kvantifitseeriti, võrreldes ClarityChrom tarkvara (Knauer, Saksamaa) standardiga ja seejärel kihi sisaldus teisendati vastavalt lahjendussuhtele DA ja DOPAC standardkõver on näidatud täiendavatel joonistel 1a ja b.

2.8. Rakukultuurid ja ravi

Mesentsefaalsete primaarsete neuronite kultuurid viidi läbi nagu eelnevalt kirjeldatud [12]. Lühidalt, C57BL/6 hiirte mesentsefaalsed kuded eemaldati 14./15. embrüopäeval (E14/15) ettevaatlikult, eraldati membraanide ja suurte veresoonte eemaldamiseks mehaaniliselt. ja seejärel tükeldati. Järgmisena seediti neid trüpsiin-EDTA-ga (Amresco, Solon, OH, USA) ja seejärel filtreeriti läbi 100-um filtri, et saada üherakuline suspensioon. Seejärel kanti rakud polü-L-lüsiiniga eelnevalt kaetud 12-/24-süvendiga plaatidele 2,5 × 10 kraadi raku/ml, mis sisaldas Neurobasali söödet (Cat 21103049, GibcoTM). , Thermo Fisher Scientific, Rockford, USA), millele on lisatud B27 (2 mahuprotsenti, Cat 1750404, GibcoTM) ja penitsilliini/streptomütsiini (0,5 mahuprotsenti). Kultuure hoiti niisutatud kambris (37 °C, 5% CO2 inkubaator). Kultuurikeskkonda vahetati iga 3 päeva järel ja rakke saab kasutada 7-10 päeva pärast.

Rakuliinid: SH-SY5Y rakuliine kultiveeriti 10% FBS-is ja 1% penitsilliini/streptomütsiini segus niisutatud inkubaatoris 37 kraadi ja 5% CO2 juures. Katsetes töödeldi SH-SY5Y rakke MPP pluss (200 μM) või erinevate Ka annustega (0,3,30,60,100,300,600 uM) 24 h.Ka(3,10, 30,60 μM, 3h) krunditud-SH-ga. SY5Y rakke stimuleeriti MPPt-ga (400 μM) 24 tundi. Ka (30 μM, 3 tundi) koos (või ilma) 3-MA-ga (3 mM, 1 h) või -tokoferooliga (50 μM, 1 h, 3, 7-8 Al d, Sigma ）Praimitud-SH-SH5Y rakke stimuleeriti MPPT-ga (200 µM) 24 tundi.

2.9. Rakkude elujõulisuse CCK8 test

Ka-ravi muutunud rakkude elujõulisus tuvastati rakkude loenduskomplektiga-8 (CCK-8 Kit, Selleck, Houston, TX, USA). Lühidalt öeldes külvati SHSY5Y rakud 96- plaadile ja seejärel töödeldi 24 tunni jooksul erinevate kontsentratsioonidega Ka (3,30,60,100,300,600,600 uM). Seejärel lisati igasse süvendisse 4 tunniks 10 ul CCK-8 reaktiivi. Lõpuks tuvastati neeldumine Multiskan Spectrum (Thermo Fisher Scientific) abil 450 nm juures.

2.10. ATP analüüs

Raku ATP tasemed tuvastati ATP bioluminestsentsanalüüsi komplektiga (Beyotime Biotechnology Co., Hiina) vastavalt tootja juhistele. Pärast töötlemist rakud lüüsiti ja tsentrifuugiti kiirusel 12, 000 pööret minutis 5 minutit 4 kraadi juures ning supernatandid koguti. Töölahus (100 μL) lisati 20 μL proovile 96-süvendi plaadil ja luminestsentsi mõõdeti kohe automaatse mikroplaadilugeja abil. Kõigi proovide mõõtmised normaliseeriti valgu kontsentratsioonile.

2.11.Na pluss -K pluss -ATPaasi analüüs

Nat-K pluss -ATPaasi mõõtmiseks (A070-2-2, Jiancheng, Nanjing, Hiina) töödeldi rakke ultraheliga ja tsentrifuugiti kiirusel 600 p/min 10 minutit, et saada supernatant. Lisati Nat-Kt-ATPaasi tuvastamise reaktsioonilahused ja inkubeeriti vastavalt tootja juhistele. Seejärel tuvastati neeldumine 660 nm juures. Kõikide proovide mõõtmised normaliseeriti valgu kontsentratsiooniga.

2.12. Western blot analüüs

Rakud või ajukoed lüüsiti RIPA puhvris (50 mM Tris (pH 7,4),cistanche คือ150 mM NaCl, 1% NP-40 (FNN0021, Thermo), 0,5% naatriumdesoksükolaati (D6750, Sigma), 0,1% SDS (74255, Sigma), täiendatud proteaasiga ja fosfataasi inhibiitorid (Roche, Shanghai, Hiina). Valgu kontsentratsioonid määrati Micro BCA komplektiga (Beyotime, Shanghai, Hiina). Igast proovist eraldati 30- ug valku SDS-PAGE abil, kasutades polüakrüülamiid-TGX geele (Bio-Rad, Hercules, California, USA) ja seejärel kanti polüvinülideendifluoriidi (PVDF) membraanidele (Millipore, Bedford, MA). Pärast blokeerimist inkubeeriti PVDF membraane erinevate spetsiifiliste primaarsete antikehadega TBST-s 4 kraadi juures üleöö, seejärel pesti ja inkubeeriti vastavates mädarõika peroksidaasiga (HRP) konjugeeritud sekundaarsetes antikehades 1 tund toatemperatuuril. Immunoreaktiivsed ribad visualiseeriti ja tuvastati täiustatud kemoluminestsentsi (ECL) ja tuvastusreagendiga (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL) ja analüüsiti ImageQuantTM LAS 4000 pildisüsteemi abil (GE Healthcare, Pittsburgh, PA, USA).

2.13. Reaalajas kvantitatiivne (Q) ja pöördtranskriptsioon (RT) - PCR

Kogu RNA ekstraheeriti ajukudedest ja kultiveeritud rakkudest, kasutades Trizoli reagenti (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Pöördtranskriptsioon viidi läbi, kasutades TAKARA PrimeScript RT reaktiivikomplekti (TaKaRa, Jaapan). Reaalajas qPCR viidi läbi, kasutades SYBR Green Master Mixi (Applied Biosystems) StepOnePlus instrumendis (Applied Bio-systems). Praimerid ostis ja kinnitas General (Shanghai, Hiina). qPCR-i jaoks kasutatud praimerid on näidatud täiendavas tabelis 2.

See artikkel on välja võetud ajakirjast Redox Biology 41 (2021) 101911