Osa 3: Cistanche tubulosast eraldatud ehhinakosiid stimuleerib oletatavasti kasvuhormooni sekretsiooni greliini retseptori aktiveerimise kaudu

Cistanche tubulosa'st eraldatud ehhinakosiid stimuleerib oletatavasti kasvuhormooni sekretsiooni greliini retseptori aktiveerimise kaudu

Chieh-Ju Wu 1, Mei-Yin Chien 2, Nan-Hei Lin 1, Yi-Chiao Lin 1, Wen-Ying Chen 3, Chao-Hsiang Chen 2,4* ja Jason TC Tzen 1,*

1 Riikliku Chung-Hsingi ülikooli biotehnoloogiainstituut, Taichung 402, Taiwan; baby159357520@gmail.com (C.-JW); CMNHEI@mohw.gov.tw (N.-HL); s9755702@gmail.com (Y.-CL)

2 Ko Da Pharmaceutical Co. Ltd., Taoyuan 324, Taiwan; rd1@koda.com.tw

3 Riikliku Chung-Hsingi ülikooli veterinaarmeditsiini osakond, Taichung 402, Taiwan; wychen@dragon.nchu.edu.tw

4 Graduate Institute of Farmacognosy, Taipei Medical University, Taipei 110, Taiwan

* Kirjavahetus: gm@koda.com.tw (C.-HC); TCTZEN@dragon.nchu.edu.tw (JTCT); Tel.: pluss 886-4-22840328 (välim. 776) (JTCT); Faks: pluss 886-4-22853527 (JTCT)

Akadeemiline toimetaja: Pinarosa Avato

Saabunud: 22. jaanuar 2019; Vastu võetud: 14. veebruar 2019; Avaldatud: 17. veebruaril 2019

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Abstraktne:Cistancheliigil, kõrbe ženšennil, on traditsioonilises Hiina farmakopöas registreeritud palju bioloogilisi toimeid ja seda on kasutatud vananemisvastase ravimina. Kolm fenüületanoidglükosiidi -ehhinakosiid, tubulosiid A ja akteosiid – tuvastati veeekstraktisCistanche tubulosa(Schenk) R. Wight ja põhikoostisosa,ehhinakosiid, puhastati edasi.ehhinakosiidkontsentratsiooniga kõrgem kui 10_6 M näitas märkimisväärset aktiivsust roti hüpofüüsi rakkude kasvuhormooni sekretsiooni stimuleerimisel. Sarnaselt kasvuhormooni vabastavale hormoonile -6, greliini sünteetilisele analoogile, pärssis kasvuhormooni sekretsiooni stimuleerimist ehhinakosiidi poolt [D-Arg1, D-Phe5, D-Trp7,9, Leu11]-aine P , greliini retseptori pöördagonist. Molekulaarne modelleerimine näitas, et kõik kolm fenüületanoidglükosiidi interakteerusid piisavalt greliini retseptori sidumistaskuga ja ehhinakosiidil oli retseptoriga veidi parem interaktsioon kui tubulosiid A ja akteosiid. Tulemused viitavad sellele, et fenüületanoidglükosiidid, eriti ehhinakosiid, on aktiivsed koostisosad, mis eeldatavasti vastutavad C. tubulosa vananemisvastase toime eest ja neid võib pidada greliini mittepeptidüülanaloogideks.

Märksõnad: cistanchetubulosa;ehhinakosiid; greliin; kasvuhormooni sekretsioon;fenüületanoidglükosiidid

ehhinakosiidsissecistancheon palju mõjusid

Palun klõpsake siin 2. osa juurde

4. Materjalid ja meetodid

4.1. Kemikaalid ja taimsed materjalid

Cistanchedeserticola YC Ma saadi kohalikult turult ja selle kinnitas dr Nan-Hei Lin.Cistanchetubulosa (Schenk) R. Wight osteti ettevõttelt Sinopharm Tian-Li Pharmaceutical Co., Ltd., (Hangzhou, Hiina). HPLC-puhtusastmega atsetonitriil, sipelghape ja metanool osteti ettevõttest ECHO Chemical Co., Ltd (Miaoli, Taiwan). Dulbecco modifitseeritud Eagle'i sööde (DMEM), dialüüsitud veiseloote seerum (DFBS) ja Trypsin-EDTA osteti ettevõttest Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). DNase I osteti ettevõttest Worthington Biochemical (Lakewood, NJ, USA). Kasvuhormooni vabastav hormoon -6 (GHRP-6) saadi ettevõttelt Gen Way Biotech, Inc. (San Diego, CA, USA). I tüüpi kollagenaas ja [D-Arg1, D-Phe5, D-Trp7,9, Leu11]-aine P osteti firmalt Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA). Roti kasvuhormooni ELISA komplekt osteti ettevõttelt Sunred Biological Technology Corporation (Shanghai, Hiina).

4.2. HPLC/UV ja LC_MSn analüüsid vee ekstraheerimiseks Cistanche spp.

Kuivatatud vars (25 g).Cistanchedeserticola YC Ma võiCistanchetubulosa (Schenk) R ekstraheeriti kolm korda 500 ml destilleeritud veega 60 minutit 50 kraadi juures veevannis. Lahus filtriti läbi 13 mm Süüria filtri 0,45 um PP membraanfiltriga (Pall Corporation, Glen Cove, NY, USA) ja allutati järgmistele analüüsidele. Ekstraktide keemilisi koostisosi analüüsiti

kasutades Syncronis C18 kolonni (4,6 × 250 mm siseläbimõõt, 5 um, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) HPLC-süsteemis, mis on ühendatud mudeli 600E fotodioodide massiividetektoriga (Waters Corporation,

Milford, MA, USA). Liikuv faas koosnes (A) veest, mis sisaldas {{0}},1 protsenti sipelghapet ja (B) atsetonitriili. Elueerimisgradient oli järgmine: 0–60 min, lineaarne gradient alates 14 protsendist B; 0–3 min, 14 protsenti kuni 17 protsenti B; 3–4 min, 17 protsenti B; 4–15 min, 17 protsenti kuni 20 protsenti B; 15–20 min, 20 protsenti B; 20–50 min, 20 protsenti kuni 14 protsenti B; 50–60

min, 14 protsenti B. Ultraviolettkiirguse (UV) neeldumise tuvastamise lainepikkuseks määrati 330 nm. Lineaarse lõksu kvadrupoolne (LTQ) tandem-massispektromeeter (Thermo Electron, San Jose, CA, USA), mis oli varustatud elektropihustusionisatsiooni (ESI) liidesega, ühendati Surveyor LC süsteemiga (Thermo Electron).

5 uL proovisilmusega. Elueerimisgradient oli järgmine: 0–90 min, lineaarne gradient alates 14 protsendist B; 0–24 min, 14 protsenti kuni 17 protsenti B; 24–25 min, 17 protsenti B; 25–36 min, 17 protsenti kuni 20 protsenti B; 36–37 min, 20 protsenti B; 37-80 min,

20% to 14% B; 80–90 min, 14% B. The heated capillary temperature was set at 300℃ with a spray voltage of 4.5 kV. Negative ESI mode was firstly scanned ranging from m/z 400–1000. Data-dependent MSN was obtained using the high purity helium (>99,99 protsenti) kui kokkupõrkegaas.

4.3. Ehhinakosiidi eraldamine

C. tubulosa kuivatatud varre vesiekstrakt (25 g) kontsentreeriti alandatud rõhul, saades sügavpruuni siirupi. Toorekstrakt suspendeeriti destilleeritud veega ja lüofiliseeriti külmkuivatis. 100 mg pulber lahustati 5 ml destilleeritud vees ja puhastati Sephadex LH-20 kolonnis (100 ml; GE Healthcare Bio-Sciences AB, Rootsi), elueeriti 10% metanooli vesilahusega ja jälgiti HPLC abil. . Ehhinakosiidi sisaldavad fraktsioonid tuvastati neeldumise lugemisega 245 nm juures ja koguti automaatse proovivõtturi abil.

4.4. Loomad

Katsed kiitis heaks riikliku Chung{0}}Hsingi ülikooli institutsionaalne loomade hooldamise ja kasutamise komitee IACUC 106-079 loanumbriga. Isased Sprague{2}}Dawley rotid kaaluga 250_300 g osteti ettevõttelt BioLASCO, Taiwan Co., Ltd. (Taipei, Taiwan). Kahte looma puuri kohta peeti kontrollitud keskkonnas 23 o2, 60 o 10% niiskuse ja 12-tunnise valguse/pimeduse tsükliga. Rotte toideti standardse chow dieediga (kalorid ette nähtud

28,7 protsenti valku, 13,4 protsenti rasvu ja 57,9 protsenti süsivesikuid, 5001 Rodent LabDiet, St. Louis, MO, USA) ja destilleeritud vett ad libitum.

4.5. Hüpofüüsi esmane rakukultuur

Hüpofüüsi rakud eraldati Yamazaki et al. poolt välja töötatud modifitseeritud ensümaatilise dispersioonimeetodi abil. [29]. Lühidalt, isased Sprague Dawley rotid anesteseeriti Zoletil 50-ga (40 mg/kg, IP; Virbac Laboratories, Carros, Prantsusmaa) ning hüpofüüsi eesmised näärmed eemaldati ja dispergeeriti hüpofüüsi rakkude kultiveerimiseks suspensioonis, nagu eelnevalt kirjeldatud [30].

4.6. Kasvuhormooni sekretsiooni analüüs

Hüpofüüsi esiosa rakke 4 × 104 rakku süvendi kohta kultiveeriti 37 kraadi juures 5% CO2 atmosfääris 2 päeva enne kasvuhormooni sekretsiooni testi vastavalt eelnevalt kirjeldatud protokollile [30].

Pärast söötme eemaldamist näljutati rakke seerumivabas Dulbecco modifitseeritud Eagle'i söötmes (DMEM) 90 minutit, et stabiliseerida basaalhormooni sekretsiooni. Nälgimiskeskkond asendati värske DMEM-iga, mis sisaldas ehhinakosiidi (alates 10_8 kuni 10_5 M) või GHRP-d-6 (inimese greliini retseptori agonist, GHSR, 10_7 M) positiivse kontrollina ja rakke inkubeeriti 15 ja 30 minutit 37 kraadi juures 5% CO2 atmosfääris. Antagonistliku toime tuvastamiseks inkubeeriti rakke GHSR-iga

pöördagonist, [D-Arg1, D-Phe5, D-Trp7,9, Leu11]-aine P (0,5 uM) ja seejärel töödeldi ehhinakosiidi sisaldava DMEM-iga (10_5 M) või GHRP-6 (10_7 M) 30 minutit. Sööde koguti jaoks

kasvuhormooni sekretsiooni määramine roti kasvuhormooni ELISA komplektiga (Shanghai Sunred Biological Technology Corporation).

4.7. Statistiline analüüs

Andmed esitati keskmiste väärtustena o SD. Erinevusi analüüsiti T-testiga. Statistilised arvutused teostas GraphPad Prism 6 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA). Taset p < 0,05="" peeti="" statistiliselt="">

4.8. Homoloogia modelleerimine ja dokkimine

Homoloogia modelleerimine ja dokkimine inimese greliini retseptoriga, kasvuhormooni sekretsiooni soodustava retseptoriga (GHSR, registreerimisnumber AAI13548), loodi meie varasema konstruktsiooni järgi [21, 24]. Lühidalt, 1 ja 2 adrenergilise retseptori (PDB 2YCY ja 3PDS) kristallstruktuure koos seotud ligandide, tsüanopindolooli ja FAUC50-ga kasutati mallidena GHSR-i struktuuri konstrueerimiseks [31,32]. Edasiseks dokkimiseks GHRP-6, ehhinakosiidi, tubulosiidi A ja akteosiidiga valiti väikseima PDF-i koguenergiaga GHSR-struktuur. Kõik modelleerimisprotsessid viidi läbi Discovery Studio 2.1 platvormi (http://accelrys.com/) abil.

GHRP-6 3D-struktuur laaditi alla Pub-Chem ühendite andmebaasist NCBI veebisaidil (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Ehhinakosiidi, tubulosiidi A ja akteosiidi 3D-struktuurid ehitati Chem3D programmi (//www.cambridgesoft.com/) abil. GHSR-i ligandi sidumissait määratleti dokkimissimulatsioonis sfäärilise ruumina, mille raadius oli sidumistasku keskpunktist 14 Å. GHRP-6, ehhinakosiidi, tubulosiidi A või akteosiidi dokkimine GHSR-i sidumissaidiga viidi läbi in silico, kasutades Discover Studio 2.1 paketi LibDocki moodulit ja veelgi minimeeritud nutika minimeerimisalgoritmi abil CHARMm jõuväljaga. Avasta Studio 2.1 pakett [33]. Et võrrelda ehhinakosiidi, tubulosiidi A ja akteosiidi suhtelist seondumisafiinsust GHSR-is, kasutati dokkimiseks GHRP-ga GHRP-6 konstrueeritud aktiivset keskosa ja sidumisenergia arvutas välja GEMDOCK (The Institute of Bioinformatics). , Taiwani riiklik Chiao Tungi ülikool).

Autori kaastööd: loomkatsed, C.-JW, Y.-CL ja W.-YC; Identifitseerimine ja puhastamine: MY.C., N.-HL ja C.-HC; Molekulaarne modelleerimine: C.-JW, Y.-CL ja JTCT; Projekti kavandamine ja kirjutamine: C.-HC ja JTCT

Rahastamine: tööd toetati osaliselt stipendiumiga, mille sai Jason TC Tzen riiklikust Chung-Hsingi ülikoolist (NCHU{1}}D604).

Tänuavaldused: Autorid tänavad Tian-Shun Wengi oma töökogemuse jagamise eest Cistanche liikide kasutamisel.

Huvide konflikt: kõik autorid ei deklareeri huvide konflikte.

Viited

1. Wang, T.; Zhang, X.; Xie, W. Cistanche deserticola YC Ma, "Kõrbe ženšenn": ülevaade. Olen. J. Chin. Med. 2012, 40, 1123–1141. [CrossRef] [PubMed]

2. Wang, T.; Chen, C.; Yang, M.; Deng, B.; Kirby, MG; Zhang, X. Cistanche tubulosa etanooliekstrakt vahendab roti suguhormoonide taset munandite steroidogeensete ensüümide indutseerimise teel. Pharm. Biol. 2016, 54, 481–487. [CrossRef] [PubMed]

3. Lin, WY; Chun, Y.; Jack, C.; Kao, ST; Tsai, FJ; Liu, HP Cistanche tubulosa pikaealisuse edendamise ja kognitiivse parandamisega seotud molekulaarsed rajad Drosophilas. Fütomeditsiin 2017, 26, 37–44. [CrossRef]

4. Wu, CR; Lin, HC; Su, MH Cistanche tubulosa vesiekstraktide kõrvaldamine Alzheimeri tõvega sarnase roti mudeli käitumishäiretest: olulisus amüloidi ladestumise ja tsentraalse neurotransmitteri funktsiooni jaoks. BMC komplement. Altern. Med. 2014, 14, 202. [CrossRef]

5. Xuan, GD; Liu, CQ Uurimused Cistanche deserticola fenüületanoidglükosiidide (PEG) mõju kohta D-galaktoosi poolt indutseeritud vananemisvastastele hiirtele. Zhong Yao Cai 2008, 31, 1385–1388. [PubMed]

6. Jiang, Y.; Tu, PF Cistanche liikide keemiliste koostisosade analüüs. J. Chromatogr. 2009, 1216, 1970–1979. [CrossRef] [PubMed]

7. Gao, C.; Wang, C.; Wu, G. Cistanche glükosiidide summaarne mõju vaskulaarse dementsusega rottide õppimisele ja mälule ning mehhanismide uurimisele. Lõug. Ürt. Med. 2005, 36, 1852–1855.

8. Li, F.; Yang, Y.; Zhu, P.; Chen, W.; Qi, D.; Shi, X.; Zhang, C.; Yang, Z.; Li, P. Ehhinakosiid soodustab luu taastumist, suurendades OPG/RANKL suhet MC3T3-E1 rakkudes. Fitoteraapia 2012, 83, 1443–1450. [CrossRef]

9. Shimoda, H.; Tanaka, J.; Takahara, Y.; Takemoto, K.; Shan, SJ; Su, MH Hiina traditsioonilise toormeditsiini Cistanche tubulosa ekstrakti hüpokolesteroleemiline toime hiirtel. Olen. J. Chin. Med. 2009, 37, 1125–1138. [CrossRef]

10. Tang, F.; Hao, Y.; Zhang, X.; Qin, J. Ehhinakosiidi mõju neerufibroosile TGF- 1/Smadsi signaaliraja inhibeerimise kaudu diabeetilise nefropaatia DB/DB hiirte mudelis. Drug Des. Devel. Seal. 2017, 11 2813–2826. [CrossRef]

11. Xiong, WT; Gu, L.; Wang, C.; päike, HX; Liu, X. Cistanche tubulosa anti-hüperglükeemilised ja hüpolipideemilised toimed 2. tüüpi diabeediga DB/DB hiirtel. J. Ethnopharmacol. 2013, 150, 935–945. [CrossRef] [PubMed]

12. Bao, XX; Ma, HH; Ding, H.; Li, WW; Zhu, M. Hiina taimsete ravimite valemi esialgne optimeerimine, mis põhineb neuroprotektiivsel toimel rotenoonist põhjustatud Parkinsoni tõve rotimudelis. J. Integr. Med. 2018, 16, 290–296. [CrossRef] [PubMed]

13. Kojima, M.; Hosoda, H.; Kuupäev, Y.; Nakazato, M.; Matsuo, H.; Kanagawa, K. Ghrelin on kasvuhormooni vabastav atsüülitud peptiid maost. Loodus 1999, 402, 656–660. [CrossRef] [PubMed]

14. Zigman, JM; Jones, JE; Lee, CE; Saper, CB; Elmquist, JK Greliini retseptori mRNA ekspressioon roti ja hiire ajus. J. Comp. Neurol. 2006, 494, 528–548. [CrossRef] [PubMed]

15. Castaneda, TR; Tong, J.; Datta, R.; Culler, M.; Tschop, MH Ghrelin kehakaalu ja ainevahetuse reguleerimisel. Esiosa. Neuroendokrinool. 2010, 31, 44–60. [CrossRef] [PubMed]

16. Rudman, D.; Feller, AG; Nagra, HS; sakslased, GA; Lalitha, PY; Goldberg, AF; Schlenker, RA; Cohn, L.; Rudman, IW; Mattson, DE Inimese kasvuhormooni mõju üle 60-aastastele meestele. N. Ingl. J. Med. 1990, 323, 1–6. [CrossRef] [PubMed]

17. Liu, H.; Bravata, DM; Olkin, I.; Nayak, S.; Roberts, B.; Garber, AM; Hoffman, AR Süstemaatiline ülevaade: kasvuhormooni ohutus ja efektiivsus tervetel eakatel. Ann. Intern. Med. 2007, 146, 104–115. [CrossRef] [PubMed]

18. Giordano, R.; Bonelli, L.; Marinazzo, E.; Ghigo, E.; Arviat, E. Kasvuhormoonravi inimese vananemisel: eelised ja riskid. Hormones 2008, 7, 133–139. [CrossRef] [PubMed]

19. Sattler, FR Kasvuhormoon vananeval mehel. Parim tava. Res. Clin. Endokrinool. 2013, 27, 541–555. [CrossRef]

20. Lo, YH; Chen, YJ; Chang, CI; Lin, YW; Chen, CY; Lee, MR; Lee, VS; Tzen, JTC Teaghrelins, ainulaadsed atsüülitud flavonoidtetraglükosiidid Chin-shin oolong tees, on greliini retseptori oletatavad suukaudsed agonistid.

J. Agric. Food Chem. 2014, 62, 5085–5091. [CrossRef]

21. Hsieh, SK; Vaata, YH; Wu, CC; Chung, TY; Tzen, JTC Teaghreliinide ja teaghreliinitaoliste ühendite biosünteetiliste vaheühendite tuvastamine oolongi teedes ja nende molekulaarne dokkimine greliini retseptoriga.

J. Food Drug Anal. 2015, 23, 660–670. [CrossRef]

22. Hsieh, SK; Chung, TY; Li, YC; Vaata, YH; Lin, NH; Kuo, PC; Chen, WY; Tzen, JTC Ginkgoghrelins, folium Ginkgo unikaalsed atsüülitud flavonoidglükosiidid, stimuleerivad kasvuhormooni sekretsiooni greliini retseptori aktiveerimise kaudu. J. Ethnopharmacol. 2016, 193, 237–247. [CrossRef]

23. Han, L.; Mavis, BY; Liu, E.; Zhang, Y.; Li, W.; Laul, X.; Fu, F.; Gao, X. Cistanches deserticola YC Ma fenüületanoidglükosiidide struktuurne iseloomustus ja identifitseerimine UHPLC/ESI-QTOF-MS/MS abil. Phytochem. Anal. 2012, 23, 668–676. [CrossRef]

24. Lu, D.; Zhang, J.; Yang, Z.; Liu, H.; Li, S.; Wu, B.; Ma, Z. Cistanches Herba kvantitatiivne analüüs, kasutades kõrgjõudlusega vedelikkromatograafiat koos dioodide massiivi tuvastamise ja kõrglahutusega massispektromeetria kombineerituna kemomeetriliste meetoditega. J. Sep. Sci. 2013, 36, 1945–1952. [CrossRef]

25. Moon, M.; Kim, HG; Hwang, L.; Seo, JH; Kim, S.; Hwang, S.; Kim, S.; Lee, D.; Chung, H.; Oh, MS; et al. Greliini neuroprotektiivne toime 1-metüül-4-fenüül-1, 2, 3, 6-tetrahüdropüridiini Parkinsoni tõve hiiremudelis, blokeerides mikrogliia aktivatsiooni. Neurotox. Res. 2009, 15, 332–347. [CrossRef]

26. Lupien, SJ; Isabelle, OM; Hupbach, A.; Tu, MT; Buss, C.; Walker, D.; Pruessner, J.; Mcewen, BS Lisaks stressikontseptsioonile: allostaatiline koormus – bioloogiline ja kognitiivne arenguvaade. In Developmental Psychopathology: Volume Two: Developmental Neuroscience; John Wiley & Sons, Inc.: New York, NY, USA, 2015; lk 578–628.

27. Rizzo, M.; Rizvi, AA; Sudar, E.; Soskic, S.; Obradovic, M.; Montalto, G.; Boutjdir, M.; Mihhailidis, DP; Isenovic, ER Ülevaade greliini kardiovaskulaarsest ja antiaterogeensest toimest. Curr. Pharm. Des. 2013, 19, 4953–4963. [CrossRef]

28. Holst, B.; Lang, M.; Brandt, E.; Bach, A.; Howard, A.; Frimurer, TM; Beck-Sickinger, A.; Schwartz, TW Ghreliini retseptori pöördagonistid: aktiivse peptiidi tuuma ja selle interaktsiooniepitoopide tuvastamine retseptoril. Mol. Pharmacol. 2006, 70, 936–946. [CrossRef]

29. Yamazaki, M.; Nakamura, K.; Kobayashi, H.; Matsubara, M.; Hayashi, Y.; Kanagawa, K.; Sakai, T. Greliini reguleeriv toime kasvuhormooni sekretsioonile perfuseeritud roti hüpofüüsi eesmise osa rakkudest. J. Neuroendocrinol. 2002, 14, 156–162. [CrossRef]

30. Lo, YH; Chen, YJ; Chung, TY; Lin, NH; Chen, WY; Chen, CY; Lee, MR; Chou, CC; Tzen, JTC Emoghrelin, ainulaadne emodiini derivaat Heshouwus, stimuleerib kasvuhormooni sekretsiooni ghreliini retseptori aktiveerimise kaudu. J. Ethnopharmacol. 2015, 159, 1–8. [CrossRef]

31. Moukhametzianov, R.; Warne, T.; Edwards, PC; Serrano-Vega, MJ; Leslie, AG; Tate, CG; Schertler, GF Kaks erinevat heeliksi 6 konformatsiooni on täheldatud beeta1-adrenergilise retseptori antagonistidega seotud struktuurides. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2011, 108, 8228–8232. [CrossRef]

32. Rosenbaum, DM; Zhang, C.; Lyons, JA; Holl, R.; Aragao, D.; Arlow, DH; Rasmussen, SG; Choi, HJ; Devree, BT; Sunahara, RK; et al. Pöördumatu agonist-beeta (2) adrenoretseptori kompleksi struktuur ja funktsioon. Loodus 2011, 469, 236–240. [CrossRef]

33. Brooks, BR; Bruccoleri, RE; Olafson, BD; osariigid, DJ; Swaminathan, S.; Karplus, M. CHARMM – programm makromolekulaarse energia, minimeerimise ja dünaamika arvutamiseks. J. Comput. Chem. 1983, 4, 187–217. [CrossRef]