2. OSA Aloysia Polystachya fenüületanoidglükosiidide eraldamine ja tuvastamine ning selle aktiivsus monoamiini oksüdaas-A inhibiitoritena

Mis on põhjus, miks Cistanche Actosides võivad pärssida ensüümide aktiivsust?

Cistanche'i antioksüdantse toime põhimõte

Lisateabe saamiseks võtke ühendust:joanna.jia@wecistanche.com

Cistanche deserticolal on palju mõjusid, lisateabe saamiseks klõpsake siin

Koostisosade eraldamine ja identifitseerimine üliefektiivse vedelikkromatograafia-massispektromeetria abil

Kromatograafilised analüüsid viidi läbi Waters Acquity UPLC H-klassi süsteemiga, mis oli varustatud dioodide massiividetektoriga (DAD) ja Waters Xevo TQ-S tandemkvadrupool-massispektromeetriga koos Z-pihustusallikaga, mis töötab negatiivse iooni režiimis. Põhilahused, mis sisaldavad 10mg/ml ekstrakti või standardeidakteosiid, isoakteosiid, 6'-atsetüüllakteosiid, ja 4',4''',5,5''-tetrahüdroksü-6,6'',3'''-trimetoksü-[C7-O-C7'']-biflavon LC-klassi metanoolis valmistati eraldi, töödeldes neid vajadusel ultraheliga 30min, ja filtreeriti läbi 0,45 μm Millipore filtrite (Merck Millipore). Lahused lahjendati metanooliga kontsentratsioonini 10µg/ml ja alikvoodid (5 µL) süstiti Sigma-Aldrich Ascentis Express C18 kolonni (1{{30}}0 × 4,6 mm id; 2,7 µm). Liikuv faas koosnes veest, mis sisaldas 0,1 protsenti sipelghapet (lahusti A) ja metanooli, mis sisaldas 0,1 protsenti sipelghapet (lahusti B), mida tarniti voolukiirusega 0,5 ml/min vastavalt elueerimisprofiilile: isokraatne 3 protsendi B sisaldusega vahemikus 0 kuni 4 minutit, millele järgnesid lineaarsed gradiendid vahemikus 3 kuni 60 protsenti B vahemikus 4 kuni 19 minutit ja 60 kuni 90 protsenti B vahemikus 19 kuni 23 minutit ning lõpuks naasnud 3 protsenti B 23 ja 28 minuti vahel. Heitvett jälgis DAD vahemikus 210 kuni 720 nm ja MS optimeeritud allika ja tööparameetritega järgmiselt: kapillaarpinge 2,50 kV, Z-pihustusallika temperatuur 150 kraadi, desolvatatsioonitemperatuur (N2) 350 kraadi, desolvatseerimisgaasi vool. 600 l/h ja massivahemik m/z 150 kuni 600 täisskaneerimise režiimis.

Tuvastatud koostisosade puhastamine

Hüdroetanooli toorekstrakt (10 g) lahustati vees: etanoolis (50:50; maht/maht) ja jaotati järjestikku heksaani, etüülatsetaadi ja n-butanooliga. Butanoolifraktsioon kontsentreeriti pöördaurustil ja 3 g fraktsioneeritud ekstrakti proov kanti klaaskolonnile (10 × 3 cm läbimõõt), mis oli täidetud C-18 RP silikageeliga (230-400 võrk; Sigma). -Aldrich) ja elueeriti veega, millele järgnesid järjestikused vee ja metanooli segud (90:10, 50:50 ja 10:90; maht/maht). Vee: metanooli (90:10; maht/maht) elueerimisel saadud alafraktsiooni puhastati täiendavalt RP-HPLC-ga, kasutades Shimadzu LC-20AP süsteemi, mis oli ühendatud SPD-20A UV/Vis detektoriga. ja varustatud Phenomenex Luna® C-18 kolonniga (sis 250 × 10 mm; osakeste suurus 5 μm). Liikuvaks faasiks oli vesi: metanool, mis alustas suhtega 90:10 (maht/maht) ja muutus 100 minuti jooksul suhtele 30:70 (maht/maht), et saada neli tuntud ühendit.akteosiid(750 mg), isoleeritud pool (430 mg), 6'-atsetüüllakteosiid(42 mg) ja 4',4''',5,5''-tetrahüdroksü-6,6'',3'''-trimetoksü-[C7-O-C7'']-biflavon ( 13 mg). Liikuva faasi voolukiirus oli 1 ml/min, süstimismaht 500 µl, kromatogramm registreeriti 340 nm juures ja UV-spektrid saadi vahemikus 240 kuni 400 nm. Puhastatud koostisosade identsus kinnitati nende 1H- (500 MHz) ja 13C-NMR (125 MHz) spektrite põhjal, mis registreeriti Brukeri mudeli DPX 500 spektromeetriga, ning andmete võrdlemisel kirjanduses leiduvate andmetega [18, 19, 41]. Eraldatud ühendite puhtust kinnitati UPLC-DAD-MS abil (▶Joonis fig. 1b–d) ja NMR (▶Joonis fig. S1–S12, tugiteave).

KvantifitseerimineakteosiidHPLC-dioodirea detektoriga

Kuivatatud hüdroetanooliekstrakti proov (1 mg) lahustati uuesti 1 ml metanooli (JT Baker HPLC puhtus) ja Milli-Q segus (80:20; v/v). Ülipuhas vesi (Merck Millipore), ultraheliga töödeldud 30 minutit ja filtreeritud läbi 0.45-μm Millipore filtri. Selle lahuse alikvoote (20 µL) analüüsiti Shimadzu LC-10APvp süsteemiga, mis oli ühendatud SPD-M10Avp DAD-ga ja varustatud Phenomenex Luna C18 kolonniga (250 × 4,6 mm id, 5 µm), mida kaitses Phenomen. C18 eelkolonn (4,0 × 3,0 mm sisemõõt, 5 µm). Eraldamised viidi läbi toatemperatuuril (22 ± 1 kraadi), kasutades liikuvat faasi, mis sisaldas 0,1% äädikhapet vees (lahusti A) ja metanooli (lahusti B;

JT Baker HPLC kvaliteediga) tarnitakse konstantse voolukiirusega 1.0 ml/min vastavalt programmile: lineaarne gradient 10 kuni 70 protsenti B vahemikus 0 kuni 32 min, 70 kuni 10 protsent B vahemikus 32 kuni 35 minutit ja lõplik isokraatne elueerimine 10 protsendi B-ga vahemikus 35 kuni 40 minutit. Detekteerimise lainepikkuseks määrati 330 nm.

Sisuakteosiidväljavõttes hinnati kasutadesakteosiid(Sigma-Aldrich; CAS nr 61276-17-3) välisstandardina. Valmistati lahused, mis sisaldasid 500, 250, 125, 62,5, 31,2 ja 15,6 ug/mL võrdlusstandardit, ja kalibreerimiskõverad koostati, allutades igale lahusele HPLC analüüsi kolmes korduses [42]. Standardi piigi pindala suheakteosiidvastav analüüdi kontsentratsioon määrati standardkõverate lineaarse regressiooni abil (▶Joonis fig. S13, tugiteave). Analüütilised andmed kinnitati lineaarsuse, täpsuse ja täpsuse osas vastavalt Agência Nacional de Vigilância Sanitária juhistele [42]. Avastamispiirid (LoD) ja kvantifitseerimispiirid (LoQ).akteosiidolid vastavalt {{0}},30 ja 0,92 µg/mL.

Monoamiini oksüdaas-A inhibeerimise testid

Inimese rekombinantne MAO-A, türamiin, klorgüliin, vanillhape, 4-aminoantipüriin ja mädarõika peroksidaas osteti ettevõttelt Sigma-Aldrich. MAO-A inhibeerimise testid viidi läbi, kasutades 96-süvendiga plaate, järgides Lópezi et al. kirjeldatud meetodi modifitseeritud versiooni. [43]. Igasse süvendisse laaditi 50 μL kromogeenset lahust (0,8 mM vanilliinhapet, 2,5 mM 4-aminoantipüriini ja 4 U/mL mädarõika peroksidaasi fosfaatpuhvris pH 7,6 juures), 100 μL 3 mM türamiin ja 50- μL alikvoot toorhüdroetanooli ekstraktist või üks metanoolis lahustatud puhastatud fenüületanoididest. Lõpuks lisati igasse süvendisse 50 μL alikvoodid 8 U/ml MAO-A ja plaati inkubeeriti 37 kraadi juures 30 minutit, mille jooksul registreeriti neeldumised iga 5 minuti järel, kasutades mikroplaadilugejat. Klorgyliin (suurem või võrdne 97% GC; Sigma-Aldrich) ja metanool lisati vastavalt positiivse ja negatiivse kontrollina igale analüüsiplaadile.

Statistiline analüüs

Viidi läbi kolm sõltumatut MAO-A inhibeeriva toime hindamist ja saadud andmeid analüüsiti Graph-Pad Prism tarkvara abil. IC₅₀hüdroetanooli ekstrakti, puhastatud fenüületanoidide ja positiivse kontrolli väärtused arvutati mittelineaarse regressiooniga, simuleerides logaritmi (inhibiitori kontsentratsiooni) graafikuid versus normaliseeritud inhibeerimise protsent.

Toetav teave

H- ja13C-NMR spektridakteosiid, isoakteosiidi, 6'-atsetüüllakteosiidi ja 4,4,5, 5-tetrahüdroksü-6,6,3 trimetoksü-[C7–O–C7'']-biflavooni ja HSQC/HMBC korrelatsioonianalüüsid need kolm fenüületanoidi on saadaval lisateavetena.

Viited

[1] Maailma Terviseorganisatsioon. Depressioon ja muud tavalised vaimsed häired

Häired: globaalsed tervisehinnangud. Genf: WHO; 2017. aasta

[2] Ferguson JM. SSRI antidepressandid: kõrvaltoimed ja talutavus. Prim Care Companion J Clin Psychiatry 2001; 3: 22–27

[3] van der Watt G, Laugharne J, Janca A. Täiendav ja alternatiivne meditsiin ärevuse ja depressiooni ravis. Curr Opin Psychiatry 2008; 21: 37–42

[4] Sarris J, McIntyre E, Camfield DA. Taimsed ravimid ärevushäirete raviks, 1. osa: Prekliiniliste uuringute ülevaade. Kesknärvisüsteemi ravimid 2013; 27: 207–219

[5] Sarris J, McIntyre E, Camfield DA. Taimsed ravimid ärevushäirete raviks, 2. osa: Kliiniliste uuringute ülevaade koos prekliiniliste tõenditega. Kesknärvisüsteemi ravimid 2013; 27: 301–319

[6] Del Vitto LA, Petenatti EM, Petenatti ME. Recursos herbolarios de San Luis (Argentiina Vabariik). Peamine osa: Plantas Nativas. Multequina 1997; 6: 49–66

[7] González Y, Arrúa RD, Rojas GD, García MG. Etnofarmacobotánica foliar de "burrito",Aloysia polüstahhia (Griseb.) Moldenke (Verben- aceae), cultivado en Paraguay. Rojasiana 2014; 13: 31–41

[8] Mora S, Díaz-Véliz G, Millán R, Lungenstrass H, Quirós S, Coto-Morales T, Hellión-Ibarrola MC. Vesialkoholi ekstrakti anksiolüütiline ja antidepressantne toimeAloysia polystachyarottidel. Pharmacol Biochem Behav 2005; 82: 373–378

[9] Hellión-Ibarrola MC, Ibarrola DA, Montalbetti Y, Kennedy ML, Heinichen O, Campuzano M, Tortoriello J, Fernández S, Wasowski C, Marder M, De Lima TCM, Mora S. Anksiolüütiline toimeAloysiapolüstahhia(Griseb.) Moldenke (Verbenaceae) hiirtel. J Etnopharmacol- 2006; 105: 400–408

[10] Hellión-Ibarrola MC, Ibarrola DA, Montalbetti Y, Kennedy ML, Heinichen O, Campuzano M, Ferro EA, Alvarenga N, Tortoriello J,

De Lima TCM, Mora S. The antidepressant-like effects ofAloysiapolüstahhia(Griseb.) Moldenke (Verbenaceae) hiirtel. Fütomeditsiin 2008; 15: 478–483

[11] Herraiz T, González D, Ancín-Azpilicueta C, Arán VJ, Guillén H.

- Karboliinalkaloidid Peganum harmalas ja inimese monoamiini oksüdaasi (MAO) pärssimine. Food Chem Toxicol 2010; 48: 839–845

[12] Herraiz T, Guillén H, Arán VJ, Salgado A. Kinasoliini alkaloidide identifitseerimine, esinemine ja aktiivsus Peganum harmalas. Food Chem Toxicol 2017; 103: 261–269

[13] Herraiz T, Guillén H. Monoamiini oksüdaas-A inhibeerimine ja sellega seotud antioksüdantne toime taimeekstraktides, millel on võimalik antidepressantne toime. Bio-Med Res Int 2018; 1018: 4810394

[14] Carrador S, D'Ascenzio M, Chimenti P, Secci D, Bolasco A. Selektiivsed MAO-B inhibiitorid: õppetund looduslikest toodetest. Mol Divers 2014; 18: 219–243

[15] Fajemiroye JO, Silva DM, Oliveira DR, Costa EA. Ärevuse ja depressiooni ravi: ravimtaimed tagantjärele. Fundam Clin Pharmacol 2016; 30: 198–215

[16] Fišar Z. Ravimid on seotud monoamiini oksüdaasi aktiivsusega. Prog Neuropsy- chopharmacol Biol Psychiatry 2016; 69: 112–124

[17] Naoi M, Maruyama W, Shamoto-Nagai M. A-tüüpi monoamiini oksüdaas ja serotoniin on kooskõlastatult seotud depressiivsete häiretega: alates neurotransmitterite tasakaalustamatusest kuni neurogeneesi häireteni. J Neural Transm 2017; 125: 53–66