2. osa ERCC1 mutatsioonid takistavad DNA kahjustuste parandamist ja põhjustavad maksa- ja neerufunktsiooni häireid patsientidel

Kontakt:ali.ma@wecistanche.com

1. osa vaatamiseks klõpsake siin

2. osa

Klõpsake neeruhaiguse jaoks Cistanche NZ

Arutelu

Uus bi-alleelse juhtumERCC1mutatsioonid Ainult kaks bi-alleelset isenditERCC1siiani on teatatud mutatsioonidest, millel mõlemal on CS-laadsed omadused. Kõige tõsisemalt kahjustatud isikul (165TOR) oli ERCC1 motiivi (HhH)2 (joonis S5 F) nonsense variant (Q158X) ja F231L missense variant, neil oli kasvupeetus, arenguhäire ja kontraktuurid ning ta suri pärast esimesel eluaastal kopsupõletiku tõttu (Jaspers et al., 2007). Teisel haigestunud isikul (CS20LO) olid kontraktuurid, mikrotsefaalia ja hüpertoonia ning ta oli homosügootne F231L missense variandi suhtes ja suri teisel eluaastal (Kashiyama et al., 2013).

Teatame kahest bi-alleelsest õest-vennastERCC1mutations—a paternally inherited missense variant (p.R156W; c.466C>T) ja null-alleel, mis on tingitud emalt päritud intrageensest deletsioonist. Kõik ülejäänud ERCC1 valk, mida ekspresseeritakse nende patsientide rakkudes, kannab R156W aminohappe asendust, mis katkestab soolasilla positiivselt laetud R156 jäägi ja vastandliku negatiivse laenguga D129 jäägi vahel, mis asub vahetult XPA-d siduva tasku all tsentraalses domeenis.ERCC1. Sellel asendusel on kahekordne mõju: (1) see vähendab tugevalt ERCC1 ja selle sidumispartneri XPF üldist stabiilsust ja (2) see mõjutab spetsiifiliselt koostoimet XPA-ga (joonis 9).

ERCC1 vähenenud tuumavalgu tase osalise vale voltimise tõttu

Western blot ja immunofluorestsentsanalüüsid näitasid, et üldiseltERCC1and XPF protein levels are dramatically reduced to below 20% of WT levels in the fibroblasts from both siblings. This effect is also recapitulated by the bi-allelic KI of the missense mutation (p.R156W; c.466C>T) endogeensesERCC1RPE{0}}hTERT rakkude lookus. Huvitav on see, et ERCC1 täielik kadumine hiirtel põhjustas surma 4 nädala jooksul, samal ajal kui valgusisalduse suurendamine WT hiirte tasemest umbes 15 protsendini pikendas eluiga viis korda (Weeda et al., 1997), mis viitab sellele, et isegi madal ERCC1 tase elujõulisuse potentsiaali oluliselt suurendada. Kooskõlas meie leidudega on varasemad uuringud näidanud, et missense mutatsioonid keskses domeenisERCC1põhjustavad üldiselt destabiliseerumist (Sijbers et al., 1996b), mis näitab, et see piirkond on valgu stabiilsuse jaoks oluline.

Hiljuti teatatud täispika krüogeense elektronmikroskoopia struktuurERCC1-XPF heterodimeer (Jones et al., 2020) näitab, etERCC1R156jääk asub heterodimeeri kõige serval. Spekuleerime, et arginiini trüptofaaniga asendamise suurenenud mahukus ja muutunud elektrooniline struktuur ei häiri mitte ainult XPA-d siduvat taskut, vaid ka dimerisatsiooniliidest ERCC1 keskdomeeni ja XPF nukleaasi domeeni vahel, põhjustades üldist destabiliseerumist (joonis 1). S5 F). Huvitav on see, et missense variant XPFR799W asub XPF-i küljel samal liidesel (joonis S5 F) ning põhjustab ka destabiliseerumist ja oluliselt vähenenud XPF-valgu taset (Mori et al., 2018). Ühel haigestunud isikul (CALIF1010), kellel esinesid CS-sarnased ja segmentaalsed progeroidsed tunnused, pärandus XPFR799W variant koos geenidevahelise deletsiooniga teises XPF alleelis, mille tulemuseks oli tugev NER-defekt koos kerge ICL-i parandusdefektiga (Mori et al., 2018), sarnaselt selles uuringus kirjeldatud õdede-vendadega.

Indutseeritava versiooni ektoopiline ekspressioonERCC1R156W24 tunni jooksul võimaldas meil saavutada selle mutantse valgu WT tasemeid, mille tulemuseks oli tsütoplasmas vale lokaliseerimine, vähenes interaktsioon XPF-iga ja suurenenud interaktsioon valku voltivate chaperoonidega, nagu MS tuvastas. Kõik need leiud toetavad arusaama, etERCC1R156Won patsiendi rakkudes osaliselt valesti volditud ja lagunenud, mille tulemuseks on ERCC1 tuumavalgu taseme langus -80 protsenti. ERCC1R156W KI RPE1-hTERT rakkudes toetab seda järeldust.

Kui võrreldaERCC1ja XPF valgu tasemed PV46LD ja PV50LD rakkudes ning tugevamalt kahjustatud indiviidide (165TOR ja CS20LO) rakkude tasemed, märkisime, et need tasemed olid võrreldavad või võib-olla isegi madalamad selles uuringus kirjeldatud õdede-vendade rakkudes (joonis 3). C ja joonis S3, E ja F; Jaspers et al., 2007; Kashiyama jt, 2013). Pange tähele, et CS20LO on ERCC1F231L suhtes homosügootne, samas kui 165TOR on heterosügootne ja kannab teisest küljest täiendavat enneaegset peatumistERCC1alleel (Q158X). Need leiud viitavad sellele, et lisaks vähenenud valgutasemetele tuleb fenotüübilise raskuse ja ekspressiivsuse potentsiaalse modulaatorina arvesse võtta veel ekspresseeritud mutantse valgu funktsionaalsust ja kahe muteerunud alleeli kombinatsiooni.

ERCC1R156W: erinev mõju ERCC1-sõltuvatele DNA parandamise radadele

ERCC1R156W-GFP ekspressioon ERCC1-KO rakkudes ERCC1WT-ga sarnasel tasemel võimaldas meil eristada aminohapete asenduste mõju valgu stabiilsusele ja mõju valgu funktsionaalsusele. Kuigi mutantse ERCC1R156W valgu UV-indutseeritud interaktsioon XPA ja kaladega oli tõsiselt kahjustatud ning see ei suutnud tõhusalt lokaliseerida UV-indutseeritud DNA kahjustuste kohtadesse, tuvastasime UDS-testides siiski märkimisväärse (~ 40 protsenti) parandusaktiivsuse, klonogeensete ellujäämiste, ja in vitro NER analüüsid. Need leiud viitavad sellele, et mutantne ERCC1 valk, mis interakteerub NER-kompleksiga väga nõrgalt, võib siiski toetada märkimisväärset NER-i (~ 40 protsenti) aktiivsust rakkude sees. Need leiud koos viitavad sellele, et ERCC1 madal ekspressioonitase (∼ 20 protsenti) koos endiselt ekspresseeritavate mutantvalkude GGR jääkaktiivsusega tagab piisava kaitse, et vältida PV46LD ja PV50LD täielikku XP väljakujunemist. Tõepoolest, GGR-i jääkaktiivsus tuvastati UDS-testides siiski tundlikumates tingimustes, võrreldes tõsiselt kahjustatud ja vähile kalduva XP-A patsiendi fibroblastidega. Sellegipoolest võivad mõlemad patsiendid olla ohus nahavähi tekkeks ja seetõttu on soovitatav end kaitsta päikesevalguse eest. Jääkaktiivsus PV46LD ja PV50LD rakkudes oli kas sarnane või madalam kui parandusaktiivsus, mida tuvastasime 165TOR või CS20LO rakkudes (joonis 6 J; Jaspers et al., 2007; Kashiyama et al., 2013). Seetõttu ei ole kliiniline raskusaste korrelatsioonis NER-i aktiivsusega, vaid on tõenäoliselt tingitud ERCC1 rollist väljaspool NER-i, mis on arendamise ajal oluline.

Vaatamata meie leidudele, et ERCC1R156W näitas vähenenud interaktsiooni SLX4-ga ja seda värvati vähem tõhusalt lokaalse ICL-i induktsiooni kohtadesse, näitas edasine analüüs, et ERCC1R156W mutantse valgu toetamine ICL-i paranemisel oli ERCC-s ektoopiliselt ekspresseeritud ainult nõrgalt.{5}} KO rakud. Mõju ICL-i paranemisele oli aga palju leebem kui R156W asendus mõju NER-ile, mis koos varasemate järeldustega, et ICL-i parandamine nõuab palju vähem ERCC1 valku kui NER-spetsiifiliste DNA kahjustuste parandamine (Jaspers et al. , 2007; Sijbers et al., 1996b), võib väga hästi selgitada kerget mõju ICL-i parandamisele. Patsientide fibroblastides, millel on tugevalt vähenenud ERCC1 tase, tuvastasime ICL-i indutseeriva ühendi MMC-ga kokkupuutel mõõduka tundlikkuse ja suurenenud kromosoomi purunemise, kuigi palju leebemad kui paralleelselt kaasatud FA patsiendi rakud. Oluline on see, et ei PV46LD ega PV50LD ei ole näidanud FA-sarnaste kliiniliste tunnuste ilmseid märke, mis viitab sellele, et ERCC1R156W mutantvalk pakub nendel patsientidel piisavat kaitset madala endogeense ICL koormuse eest.

ERCC1 puudulikkus põhjustab maksa- ja neerukahjustusi

Hiirtel, kellel on ERCC1 või XPF puhul KO, ilmneb tõsine jooksmine (st väiksemad ja nõrgemad kui WT hiired) ja kes surevad enne esimest 4 elunädalat raske maksapuudulikkuse tõttu (McWhir et al., 1993; Sijbers et al., 1996b; Tian et al., 2004; Weeda jt, 1997). ERCC1 maksaspetsiifiline ekspressioon nendel hiirtel korrigeeris osaliselt väiksemat suurust ja pikendas eluiga kuni 12 nädalani, kuid paljastas ka raskekujulise.neerufunktsiooni häiredja neerupuudulikkus kui sekundaarne surmapõhjus (Selfridge et al., 2001). XP või FA jaoks spetsiifilistel KO hiirtel ei esine maksahaigust, mis viitab sellele, et seda fenotüüpi ei põhjusta NER või ICL parandusdefekt. Võimalik, et seda fenotüüpi võib seletada osaline koondamine nende kahe raja vahel, mis mõlemas rajas puudulike ERCC1-KO hiirte puhul kaob. Selle ideega kooskõlas on hepatotsüütide janeeru-proksimaalsed tuubulirakudmuutus ERCC1-KO hiirtel polüploidseks ja akumuleeris kõrge p53 taseme (McWhir et al., 1993; Selfridge et al., 2001; Weeda et al., 1997), mis viitab endogeense DNA kahjustuse kuhjumisele nendes elundites võib juhtuda. Selle endogeense DNA kahjustuse täpne olemus jääb siiski ebaselgeks.

Huvitav on see, et hiirtel, kellel on nii NER kui ka ICL parandus liigeses inaktiveeritud, ei esine maksafunktsiooni häireid, mis viitab sellele, et nende DNA parandamise radade vaheline liiasus ei ole ainus seletus ja et ERCC1-XPF lisafunktsioon väljaspool neid DNA parandamise teid aitab kaasa. maksakahjustuse korral (Mulderrig ja Garaycoechea, 2020). Võimalik, et ERCC1-XPF osaleb täiendavates DNA parandamise radades, mis tegelevad endogeense DNA kahjustusega. Näiteks näidati hiljuti, et ERCC1-XPF toimib alternatiivsetele DNA struktuuridele, nagu Z-DNA, mille käigus see teeb koostööd mittevastavust parandavate valkudega, mitte NER või ICL parandusfaktoritega (McKinney et al., 2020). Lisaks näidati, et ERCC1-XPF osales koos RECQ1 helikaasiga aluse ekstsisiooni parandamise alamrajas (Woodrick et al., 2017).

Selles uuringus osalenud kahel õel-vennal (PV46LD ja PV50LD) ilmnes ebaõnnestumine, lühike kasv ja nahaaluse rasva puudumine, mis meenutas ERCC1-KO hiirtel täheldatud väikest kasvu (McWhir et al., 1993; Selfridge et al., 2001; Weeda jt, 1997). Veelgi enam, õdedel-vendadel tekkisid peamiselt kolestaatilise pildiga maksakahjustused, mis viisid ortotoopilise maksa siirdamiseni enne 9. eluaastat. See sekkumine hoidis selgelt ära varajase surma, kuid ei parandanud õitsengu ebaõnnestumist, nagu ilmneb siirdamisjärgsest kaalu, pikkuse ja peaümbermõõdu kasvust, mis on tunduvalt alla kolmanda tsentiili.

Huvitav on see, et kolestaatilist maksahaigust teatati Egiptuse CS-i patsientide ühise tunnusena, mis viitab sellele, et seda tuleks teistest etnilistest taustadest pärit CS-patsientidel hoolikamalt jälgida, et näha, kas see on tavalisem tunnus kui varem tunnustatud (Abdel Ghaffar et al. , 2011). Kuigi XP-ga patsientidel ei ole kirjeldatud maksahäireid, on FA patsientidel mõned maksatsütolüüsi (rakkude lagunemise või lõhkemise) juhtumid (Masserot-Lureau et al., 2012), mis võivad erineda ERCC-s täheldatud maksahäiretest. 1- puudulikud õed-vennad. Vanema õe-venna (PV50LD) maksa biopsia histoloogiline uurimine näitas muutusi hepatotsüütide morfoloogias koos tuuma suurenemise ja varieeruvusega, nagu märgiti ERCC{5}defitsiidiga hiirtel (joonis S1 D; N´uñez et al., 2000). ).

Teine surmapõhjus ERCC{0}}KO hiirtel, kellel oli ERCC1 maksaspetsiifiline ekspressioon, oli raskeneerupuudulikkus(Selfridge et al., 2001). Mõlemal õdedel-vendadel on ka neerufunktsiooni häire, mille tunnused viitavad proksimaalsele tubulaarsele düsfunktsioonile, mis põhjustab progresseeruvatneerudkahjustus. Tubulaarne funktsioon aga stabiliseerus pärast maksa siirdamist, kuidneerudfunktsiooninõuab pidevat jälgimist. ERCC1- KO hiirte neerufenotüüp – laienenud tuubulitega, mis sisaldavad lekkinud valgulist materjali, mis on kooskõlas tubulopaatiaga (McWhir et al., 1993; Selfridge et al., 2001; Weeda et al., 1997) on sarnane. meie uuringus kirjeldatud patsientide omadele. Lisaks on teatatud neerukahjustusest ja mõnel juhul ka neerupuudulikkusest kombineeritud XP/CS (Ben Chehida jt, 2017; Kondo jt, 2016; Kralund et al., 2013) ja CS (Funaki jt) puhul. ., 2006; Reiss et al., 1996; Sato jt, 1988), samas kui seos FA ja struktuurianomaaliate vahelneerudhas also been reported (Sathyanarayana et al., 2018). The phenotype in these siblings is distinct from prior reports of individuals with biallelic ERCC1 mutations and also distinct from the known phenotypic entities, CS and XP. Neither individual had features suggestive of FA. There may be parallels between the phenotype of these siblings and a previously reported individual with biallelic ERCC1 mutations (XP2020DC; p.K266X; IVS6-26G>A), kes suri 37-aastaselt (Gregg et al., 2011; Imoto, K., jt 2007. Patsientidel, kellel on defekte interakteeruvates nukleotiidide ekstsisiooni parandavates valkudes ERCC1 või XPF, ilmneb kseroderma pigmentosum koos hilise algusega raske neuroloogilise degeneratsiooniga [Abstract] J. Invest. Dermatol., 127:S92). Kuigi maksakahjustusest ei teatatud, tekkis sellel patsiendil 15-aastaselt tõsine aju atroofia, mis arenes dementsusega progresseeruvaks neurodegeneratsiooniks. Kerget aju atroofiat on täheldatud ka mõlemal õdedel-vendadel vanuses 13 ja 11 aastat, mis näitab, et mõlema õe-venna neuroloogilist arengut tuleb hoolikalt jälgida.

A previously reported 15-yr-old boy with bi-allelic XPF mutations (XP51RO; p.R153P; c.458G>C; Jaspers et al., 2007; Niedernhofer et al., 2006), mille fenotüüp kattub siin kirjeldatud õdede-vendadega, sealhulgas valgustundlikkus ilma nahavähita, lühike kasv, nahaaluse rasva puudumine, arengupeetus ja neerupuudulikkus (Niedernhofer et al., 2006). Erinevalt siin kirjeldatud õdedest-vendadest oli sellel poisil selgelt väljendunud segmentaalsed progeroidsed tunnused, kuid palju leebem maksapilt ilma kolestaasita. Siin kirjeldatud õed-vennad näitavad, et bi-alleelsed ERCC1 mutatsioonid võivad põhjustada fenotüüpide spektrit, alates sellest, mida tavaliselt täheldatakse CS-s, kuni fenotüübini, mis hõlmab kergemat lühikest kasvu, valgustundlikkust ja rasket maksa- janeerudkahjustus, mis võib olla tingitud tugevast mõjust NER-ile ja samaaegselt ICL-i paranemisele, mis võib eriti mõjutada neid elundeid.

materjalid ja meetodid

Kõik selles uuringus läbiviidud protseduurid on kooskõlas eetiliste standarditega ja on heaks kiidetud Austraalias Melbourne'i osariigis Victoria osariigis asuva kuningliku lastehaigla inimeetika komitee (HREC36291C) ja Ühendkuningriigi riikliku teadusuuringute eetikateenistuse komitee Kirde-Newcastle'i ja Põhja-Tyneside'i poolt. 2. Patsiendid värvati diagnoosimata haiguste programmidesse, mis on mõeldud pediaatriliste patsientide jaoks, kellel on oletatavasti "vaeslapselikud" Mendeli häired. Patsientide ja nende pereliikmete sülje- või vereproovid koguti genoomse DNA ekstraheerimiseks pärast kirjaliku teadliku nõusoleku andmist. Vanemad on andnud loa näidata redigeerimata fotosid mõjutatud õdedest-vendadest joonisel 1 A.

Next-generation sequencing (NGS) DNA extracted from the blood of both affected siblings and unaffected parents was subjected to exome capture and sequencing through Oxford Gene Technologies Ltd. Genomic data were analyzed using a custom-made in-house pipeline using an autosomal recessive disease model. A paternally inherited missense variant in NM_202001.2 (ERCC1), g.45922415G>A, c.466C>T was identified in both affected individuals in exon 4 of 8 of the ERCC1 gene. On initial interrogation of the exome data in both affected individuals, this variant appeared to be in a homozygous state but was present in a heterozygous state in the father and absent in the mother, suggesting a possible deletion on the maternal allele. The missense variant is present in the gnomAD database at a frequency of 0.01 percent (22 heterozygotes, no homozygotes) and has not been previously reported in affected individuals. The missense variant has been deposited in the LOVD database (http://www.LOVD.nl/ERCC1_000020 and http://www.LOVD.nl/ERCC1_000021) and the ClinVar database (variation ID: 978472).

Kustutuse tuvastamine qPCR abil

Kustutuse tuvastamiseks ekstraheeriti lümfotsüütidest / epiteelirakkudest genoomne DNA ja ERCC1 geeni asjakohane piirkond amplifitseeriti qPCR-is. qPCR viidi läbi, kasutades sonde ja spetsiifilisi praimereid (loetletud tabelis S1), mis olid kavandatud Universal ProbeLibrary Assay Design Centeri (Roche) abil ja mille sünteesis Sigma-Aldrich. Praimerid kavandati nii, et need hõlmaksid kustutatud piirkonda eksonis 4 ja piirkonda geenis, mida ei kustutata kontrollina (ekson 5). Mitmekordne qPCR, milles kasutati LightCycler R 480 Probes Master reaktsioonisegu (Roche), viidi läbi vastavalt tootja protokollile ERCC1 geenipiirkonna amplifitseerimiseks ja kvantifitseerimiseks, kasutades sisestandardina CFTR geeni (ekson 27) (tabel S1). QPCR viidi läbi seadmega LightCycler R 480 (Roche) ja andmete analüüsimiseks kasutati LightCycler R 480 tarkvara versiooni 1.5.0 (Roche). Järjestuste variatsiooni tõlgendamisel järgiti American College of Medical Genetics juhiseid.

Missense variandi tuvastamine Sangeri järjestuse abil

Genoomne DNA eraldati rakusademete resuspendeerimisega täisrakulüsaadi puhvris (50 mM KCL, 10 mM Tris, pH 8.0, 25 mM MgCl2, {{12} },1 mg/ml želatiin, 0,45 protsenti Tween-20 ja 0,45 protsenti NP-40), mis sisaldavad 0,1 mg/ml proteinaas K (EO0491; ThermoFisher Scientific) ja inkubeeritakse 1 h temperatuuril 56 kraadi, millele järgneb 10-min Proteinaas K inaktiveerimine kuumusega 96 kraadi juures. Missense mutatsioone hõlmavaid ~1 kb fragmente amplifitseeriti PCR (sekveneerimispraimerid on loetletud tabelis S1), millele järgnes Sangeri sekveneerimine, kasutades kas päri- või vastupidist praimerit.

Rakuliinid

Fibroblasti rakuliinid loodi nii mõjutatud isikute kui ka vanemate nahabiopsiate põhjal. Kõiki rakuliine (loetletud tabelis S2) kultiveeriti 37 kraadi juures 5% CO2 indiumi atmosfääris (Thermo Fisher Scientific), millele oli lisatud penitsilliini/streptomütsiini (Sigma-Aldrich) ja 10% FBS-i (Bodinco BV). Kõiki rakuliine testiti rutiinselt mükoplasma infektsiooni suhtes.

Fibroblasti immortaliseerimine hTERT-ga

WT (48BR) ja PV50LD fibroblastid immortaliseeriti p Babe-Neo-TERT (Addgene Plasmid #1774) nukleofektsiooniga, kasutades Amaxa Nucleofectorit (programm U23). Iga elektroporatsioon sisaldas 400 000 fibroblasti ja 2,5 µg plasmiidset DNA-d. Pärast elektroporatsiooni külvati rakud 25-cm2 koekultuuri kolbidesse, mis sisaldasid 5 ml DMEM-i ja 10 protsenti FBS-i. 2 päeva pärast asendati sööde söötmega, mis sisaldas 20 ug/ml neomütsiini.

/streptomütsiin (Sigma-Aldrich) ja 10 protsenti FBS (Bodinco BV). Kõiki rakuliine testiti rutiinselt mükoplasma infektsiooni suhtes.

Plasmiidkonstruktsioonid

All plasmids used in this study are listed in Table S3. The GFP gene in pERCC1-GFP-N1 (Houtsmuller et al., 1999) was replaced with m Venus (a gift of Joachim Goedhart, Amsterdam, Netherlands) using AgeI and BsrGI. The GFP-NLS gene (Luijsterburg et al., 2017) was inserted into pcDNA5-FRT-TO-Puro. The ERCC1-m Venus cassette was amplified by PCR (see Table S1 for primers) and inserted as a NheI and BspEI fragment into plenty-CW57-TO-GFP digested with NheI and AgeI to generate plenty-CW57-TO-ERCC1WT-mVenus. Overlap PCR was used to introduce the c.466C>T-mutatsioonid ERCC1-s. Kattuv PCR-produkt sisestati NheI ja AgeI fragmendina, et tekitada palju-CW57-TO-ERCC1R156W-mVenus. ERCC1WT ja ERCC1R156W sisestati NheI ja AgeI fragmentidena pcDNA5-FRT-TO Puro-EGFP-N1-sse, et luua pcDNA5-FRT-TO-Puro-ERCC1WT-EGFP ja pcDNA5-FRT-TO -Puro-ERCC1R156W-EGFP. Punktmutatsioonide sisestamiseks pMacro Bac-XPF-ERCC1WT-sse kasutati saidile suunatud mutageneesi, kasutades KOD-plus mutageneesikomplekti (Toyobo), nagu on kirjeldatud tootja protokollis, kasutades tabelis S1 loetletud praimereid. Kõik järjestused kontrolliti Sangeri sekveneerimisega.

KO raku genereerimine

liinid üksikute KOde genereerimiseks, U2OS(FRT) ja RPE1-hTERT (PuroR/TP53-dKO) rakud kotransfekteeriti pLV-U6g-PPB-ga, mis kodeeris Leideni ülikooli meditsiinikeskuse/Sigma juht-RNA-d. -Aldrichi ühe juhitava RNA (sgRNA) raamatukogu (plasmiidide kohta vt tabelist S3 ja sgRNA järjestuste kohta tabel S4), mis sihib ERCC1 geeni koos ekspressioonivektoriga, mis kodeerib Cas9-2A-GFP (pX458; Addgene #48138), kasutades Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Transfekteeritud U2OS(FRT) rakud selekteeriti puromütsiinil (1 ug/ml) 3 päevaks ja plaaditi madala tihedusega, misjärel isoleeriti üksikud kloonid. Transfekteeritud RPE1-hTERT-rakud sorteeriti FACS-iga BFP/GFP-l ja plaaditi madala tihedusega, mille järel eraldati üksikud kloonid. KO kloonid kontrolliti Western blot analüüsiga. Cas9 integratsiooni / stabiilse ekspressiooni puudumist kinnitas Western blot.

Stabiilsete rakuliinide genereerimine

Ühte ERCC1 KO klooni U2OS(FRT) taustal (vt tabelit S2) kasutati ERCC1WT-GFP, ERCC1R156W-GFP või GFP-NLS stabiilseks ekspresseerimiseks neid kodeeriva pcDNA5-FRT-TO-puroplasmiidi kotransfektsiooni teel. cDNA-d (2 µg) koos pOG44 plasmiidiga, mis kodeerib Flp rekombinaasi (0,5 µg). Pärast selektsiooni 1 µg/ml puromütsiini ja 4 µg/ml blastitsidiini S-ga saadi polüklonaalne rakupopulatsioon. GFP-märgistatud ERCC1 valkude või GFP-NLS ekspressioon indutseeriti 2 µg/ml doksütsükliini lisamisega 24 tunni jooksul.

KI rakuliinide genereerimine

Homosügootsete KIde genereerimiseks töödeldi RPE{{0}}hTERT rakke esmalt 30 minutit 1 µM DNA-PK inhibiitoriga (NU7441), et pärssida veaohtlikku DSB parandamist ja suurendada homoloogiast sõltuva paranduse kasutamist. Seejärel resuspendeeriti 350,{8}} rakku 20 µl nukleofektorpuhvris (V4XP-3032; Lonza) 4,5 µg plasmiidi, mis sisaldas Cas9 ja sgRNA, mis oli suunatud ERCC1 geenile (plasmiidide ja plasmiidide ja tabelis T3) juuresolekul. S4 forsgRNA järjestused) ja 100 uM üheahelalist doonori DNA-d, mis sisaldab patsiendi mutatsiooni, samuti vaikivaid mutatsioone, et hävitada PAM sait, et vältida Cas9-ga ümberlõikamist, ja vaiksed mutatsioonid HindIII restriktsioonisaidi sisseviimiseks, et hõlbustada KI kloonide skriinimist. Rakud elektroporeeriti, kasutades Amaxa 4D-X Nucleofector Unit (Lonza), kasutades programmi EA-104. Pärast elektroporatsiooni kanti rakud madala tihedusega McCoy söötmesse, milles oli 10 protsenti FBS-i. Järgmisel päeval asendati sööde DMEM-iga (10% FBS ja 1% penitsilliini/streptomütsiini) ning rakkudel lasti moodustada kolooniaid. Ligikaudu 400 kolooniat eraldati ja laiendati. Genoomne DNA eraldati ja fragment, mis sisaldas sisestatud mutatsiooni ja sisestatud restriktsioonisaiti (HindIII), amplifitseeriti pesastatud PCR-ga (praimerite kohta vt tabelit S1). PCR fragmente lõigati HindIII-ga (NEB) 3 tundi 37 kraadi juures ja seejärel eraldati geelelektroforeesiga. Kloone, millele oli sisse viidud HindIII restriktsioonisait, analüüsiti Sangeri sekveneerimisega (praimerite kohta vt tabelit S1). Saime 400 eraldatud klooni hulgast kaks homosügootset KI klooni, mis vastab KI efektiivsusele ∼ 0,5 protsenti.

Lentiviiruse transduktsioon

lentiviiruse transduktsiooni jaoks sisestati mVenus-ERCC1WT või mVenus ERCC1R156W lentiviiruse vektorisse pLenti-CW57-TO. HEK293T transfekteeriti vektoritega, mis kodeerivad neid ERCC1 liite, VSV-G, RRE ja REV, kasutades viiruse tootmiseks JetPEI (Sigma Aldrich). Viirust sisaldav supernatant koguti 24 tunni pärast ja filtreeriti 0.44-µm filtriga. Primaarsed fibroblastid PV46LD ja PV50LD transdutseeriti lentiviraalselt polübreeni (Sigma-Aldrich) juuresolekul. Rakud selekteeriti 15 ug/ml puromütsiiniga. mVenus-märgistatud ERCC1 valkude ekspressioon indutseeriti 2 µg/ml doksütsükliini lisamisega 24 tunni jooksul.

Klonogeense ellujäämise testid

Cells were trypsinized, seeded at low density, and allowed to attach. The next day, cells were either mock-treated or exposed to an increasing dose of UV light (1, 2, 3, and 4 J/m2 of UV-C 266nm), an increasing dose of IR (2, 4, 6, and 8 Gy), or increasing concentrations of MMC (2, 4, 6, and 8 ng/ml). After 7–9 d, the cells were washed with 0.9% NaCl and stained with methylene blue. Colonies of >Hinnati 20 rakku. Ellujäämiskatsed viidi läbi kahes eksemplaris ja neid korrati vähemalt kaks korda.

Immunosadestamine Co-IP jaoks

Rakke töödeldi imitatsiooniga või kiiritati UV-C-ga (20 J/m2) ja koguti 1 tunni pärast. Rakupelleteid lüüsiti 20 minutit jääl EBC-150 puhvris (50 mM Tris, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,5% NP-40, 2 mM MgCl2 ja proteaasi inhibiitor kokteil [Roche]), millele on lisatud 500 U/ml bensonaasi nukleaasi (Novagen). Rakulüsaate inkubeeriti 1,5 tundi 4 kraadi juures GFP-Trap A helmestega (Chromotek). Seejärel pesti helmeid kuus korda EBC-150 puhvriga (50 mM Tris, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,5% NP-40, 1 mM EDTA ja proteaasi inhibiitori kokteil) ja keedeti Laemmli-SDS-is. proovipuhver.

Western blot

Rakud tsentrifuugiti, pesti PBS-ga ja keedeti 1 0 min Laemmli puhvris (40 mM Tris, pH 6,8, 3,35% SDS, 16,5% glütserool, 0,0005% bromofenoolsinine ja 0,05%). M-ditiotreitool). Valgud eraldati 4–12-protsendilistel Criterion XT Bis-Tris geelidel (#3450124; Bio-Rad) NuPAGE MOPSrunning puhvris (NP0001-02; Thermo Fisher Scientific) ja blotiti polüvinülideenfluoriidmembraanidele (IPFL0MD Millipore; ). Membraan blokeeriti blokeeriva puhvriga (MB-070-003; Rock land) 1 tund toatemperatuuril. Seejärel testiti membraani antikehadega (loetletud tabelis S5), nagu näidatud. Tuvastamiseks kasutati Odyssey CLx süsteemi (LI-COR Biosciences).

RNA taastamise test (RRS)

30,000 rakku külvati 12-mm klaasist katteklaasidele 24-süvendiplaatidele DMEM-is 1% FBS-iga. 24 tunni pärast kiiritati rakke UV-C-ga annuses 6 J/m2 ja inkubeeriti konditsioneeritud söötmes erinevatel ajavahemikel ({{20}} h, 3 h ja 18 h). Pärast inkubeerimist märgistati tekkivad transkriptid, inkubeerides rakke 400 µM 5-etünüüluridiiniga (CLK-N002-10; Jena Bioscience), mis seejärel visualiseeriti Click-iT seguga, mis koosnes 50 uM. mM Tris puhver, pH 8,0, 60 µM Atto Azide (647N-101; ATTO-TEC), 4 mM CuSO4•5H2O, 10 mM L-askorbiinhape (A0278; Sigma-Aldrich) ja 0,1 µg/ml DAPI (D1306; Thermo Fisher Scientific) 1 tund. Rakke pesti kolm korda 5 minutit PBS-ga ja paigaldati mikroskoobi alusklaasidele (Thermo Fisher Scientific), kasutades Aqua Polymounti (Brunschwig).

Immunofluorestsents

Immunofluorestsentsvärvimiseks külvati 250,000 rakku 18-mm klaasist katteklaasidele. Järgmisel päeval fikseeriti rakud 4% paraformaldehüüdiga, millele järgnes permeabiliseerimine {{10}},5% Triton X-100-ga 10 min. Rakke töödeldi 100 gl glütsiiniga PBS-is 10 minutit, et blokeerida reageerimata aldehüüdrühmad, loputati PBS-iga ja tasakaalustati pesupuhvris (PBS, mis sisaldas 0,5% BSA-d ja 0,05% Tween{14}}; Sigma-Aldrich) 10 minutit. Antikeha etapid ja pesud olid pesupuhvris. Primaarseid antikehi inkubeeriti 2 tundi toatemperatuuril, seejärel sekundaarseid antikehi 1 tund ja DAPI-d 5 minutit. Primaarsed ja sekundaarsed antikehad on loetletud tabelis S5. Rakke inkubeeriti 0,1 µg/ml DAPI-ga ja paigaldati Aqua Polymount abil.

H2AX värvimine

200,000 rakku külvati 18-mm klaasist katteklaasidele 24-süvendiplaatidele DMEM-iga (10 protsenti FBS ja 1 protsenti P/S). Järgmisel päeval eksponeeriti rakud IR-ga YXlon Internationali röntgenigeneraatoriga (200 KV, 4 mA; doosikiirus 2 Gy/min). Näidatud ajahetkedel fikseeriti rakud 3% paraformaldehüüdiga PBS-s 10 minutit ja värviti H2AX jaoks 1 tund (vt eespool). Pildid kvantifitseeriti, kasutades ImageJ kohandatud makrot, mis võimaldas automaatset ja objektiivset fookuste arvu analüüsi raku kohta, nagu eelnevalt kirjeldatud (Typas et al., 2015).

Fikseeritud rakkude mikroskoopiline analüüs

Fikseeritud proovide pildid saadi Zeiss AxioImagerM2 või D2 laia väljaga fluorestsentsmikroskoobiga, mis oli varustatud 63 × PLAN APO (1,4 numbrilise avaga [NA]) õlikümblusobjektiividega (Zeiss) ja ergastamiseks kasutatud HXP 120 metallhalogeniidlambiga. Fluorestseeruvate sondide tuvastamiseks kasutati järgmisi DAPI filtreid (ergastusfilter: 350/50 nm; dikroonne peegel: 400 nm; emissioonifilter: 460/50 nm), Alexa 555 (ergastusfilter: 545/25 nm; dikrooniline peegel: 56 nm: ; emissioonifilter: 605/70 nm) või Alexa 647 (ergastusfilter: 640/30 nm; dikroonne peegel: 660 nm; emissioonifilter: 690/50 nm). Pildid salvestati ZEN 2012 tarkvaraga ja analüüsiti ImageJ-s.

UV laser mikrokiirgus

Rakke kasvatati 18-mm kvartsist (UV-C) või klaasist (UV-A) katteklaasidel ja paigutati Chamlide CMB magnetkambrisse, milles kasvusööde asendati CO2-sõltumatu Leibovitz L{ga. {4}} keskmine (Thermo Fisher Scientific). UV-C laserrajad tehti dioodiga pumbatava tahkis-266- mm ütrium-alumiiniumgranaatlaseriga (keskmine võimsus 5 mW, kordussagedus kuni 10 kHz ja impulsi pikkus 1 ns). Enne UV-Amicro kiiritamist sensibiliseeriti rakke 6 uM trioksaleeniga 1 tund, et tekitada ICL-sid, või 15 uM BrdU-ga 24 tundi, et tekitada DSB-sid. UV-A laserrajad tehti dioodpumbaga tahkis-355-nm ütriumalumiiniumgranaatlaseriga (keskmine võimsus 14 mW ja kordussagedus kuni 200 Hz). Mõlemad laserid integreeriti UGA{24}}Caliburn/2L punktvalgustussüsteemi (Rapp OptoElectronic).

Mikrokiiritamine kombineeriti elusrakkude pildistamisega keskkonnakambris, mis oli seatud 37 kraadini täiskvartsist laia väljaga fluorestsentsmikroskoobi Zeiss Axio Observer 7 abil, kasutades 100× (1,2NA) ultrafiltri glütserooli sukeldumisobjektiivi (UV-C). ) või Plan-Neofluar 63× (1,25 NA) õliimmersioonobjektiiv (UV-A). Lasersüsteem on ühendatud mikroskoobiga TriggerBoxi kaudu ja neutraalse tihedusega (ND-1) filter blokeerib 90 protsenti laservalgusest. Ergastamiseks kasutati AnHXP 120-V metallhalogeniidlampi. Pildid saadi Zeiss ZENis ja kvantifitseeriti ImageJ-s.

Kromosoomi purunemise test

2 × 1{{20}}6 fibroblasti külvati 175-cm2 koekultuuri kolbidesse DMEM-iga (10 protsenti FBS) ja kultiveeriti 37 kraadi juures 50 nM MMC juuresolekul või puudumisel. 48 tunni pärast lisati igasse kultiveerimiskolbi 600 µl demekoltsiini (10 µg/µl) ja rakke inkubeeriti metafaaside rikastamiseks veel 30 minutit 37 kraadi juures. Seejärel rakud trüpsiiniti ja resuspendeeriti 75 mM KCL-s ja inkubeeriti 20 minutit toatemperatuuril. Rakud tsentrifuugiti, resuspendeeriti 10 ml fiksaatoris (75% metanooli ja 25% äädikhapet), inkubeeriti 30 minutit toatemperatuuril ja tsentrifuugiti. Pelletid resuspendeeriti 10 ml fiksaatoris ja inkubeeriti 5 minutit toatemperatuuril. Seda sammu korrati ja lõpuks suspendeeriti pellet uuesti 0, 5–1, 0 ml fiksaatoris. Rakususpensioon tilgutati objektiklaasile ja lasti kuivada. Slaidid värviti 5 minutit 3-protsendilises Giemsa lahuses, loputati kraanivees ja lasti kuivada. Slaidid kodeeriti ja igast kodeeritud kultuurist uuriti 50 metafaasi kromosomaalsete kahjustuste suhtes. Pärast punktide määramist slaidid dekodeeriti ja tulemusi analüüsiti esitatud viisil (Stoepker et al., 2011).

UDS

180,000 rakku külvati 18-mm klaasist katteklaasidele 12-süvendiplaatidele DMEM-is 1% FBS-iga. 24 tunni pärast kiiritati rakke lokaalselt läbi 5-µm filtri 30 J/m2 UV-C-ga. Seejärel märgistati rakud impulssmärgistusega 20 uM EdU (VWR) ja 1 uM 5-fluoro-desoksüuridiiniga (Sigma-Aldrich) kas 1 või 4 tundi. Pärast märgistamist töödeldi rakke söötmega 10 uM tümidiiniga DMEM-is ilma toidulisanditeta 30 minutit ja fikseeriti 15 minutit 3,7-protsendilise formaldehüüdiga PBS-is. Rakud permeabiliseeriti 20 minutit PBS-is 0,5% Triton-X100-ga ja blokeeriti 3% BSA-s (Thermo Fisher Scientific) PBS-is. Sisseehitatud EdU ühendati Attoazide Alexa Fluor 647-ga, kasutades Click-iT keemiat vastavalt tootja juhistele (Invitrogen). Pärast sidumist fikseeriti rakud 10 minutit 2-protsendilise formaldehüüdiga ja seejärel blokeeriti 100 mM glütsiiniga. DNA denatureeriti 0,5 M NaOH-ga 5 minutit, millele järgnes blokeerimine 10-protsendilise BSA-ga 15 minutit. Järgmisena inkubeeriti rakke tsüklobutaanpürimidiini dimeeride vastaste antikehadega (vt tabel S5) 2 tundi, seejärel sekundaarsete antikehadega 1 tund ja DAPI-ga 5 minutit. Rakud paigaldati Polymounti (Brunschwig).

MS andmete kogumine

MS viidi läbi põhimõtteliselt nii, nagu eelnevalt kirjeldatud (Salas Lloret et al., 2019). Kõik katsed viidi läbi süsteemiga EASY-nLC 1000 (Proxeon), mis oli nanoelektropihustusiooni allika kaudu ühendatud Q-Exactive Orbittrapiga (Thermo Fisher Scientific). Q-Exactive ühendati ettevõttesisese 25-cm ränidioksiidi emitteriga (FS360-75-15-N-5-C25; NewObjective), mis oli pakitud 1,9 µm C18-AQ helmestega (Reprospher -DE; Pur; Dr. Manish, Ammerbuch-Entringen, Saksamaa). Proove töödeldi 40-min kromatograafilise gradiendiga 0 protsendilt 30 protsendini atsetonitriili ja seejärel suurendati 95 protsendini atsetonitriili enne kolonni uuesti tasakaalustamist voolukiirusega 200 NL/min. Massispektromeetrit kasutati andmetest sõltuvas kogumisrežiimis seitsme parima meetodiga ja skaneerimisvahemikuga 300–1600 m/z. Täisskaneerimisega MS-spektrid saadi sihtväärtusega 3 × 106 ja eraldusvõimega 70,000 ning kõrgemad kokkupõrke dissotsiatsiooni tandemmassispektrid (MS/MS) registreeriti sihtväärtusel 105 ja eraldusvõimega 35 000, isolatsiooniaknaga 2,2 m/z ja normaliseeritud kokkupõrkeenergiaga 25 protsenti. Minimaalne automaatse võimenduse reguleerimise sihtmärk oli 104. Maksimaalsed MS1 ja MS2 süstimisajad olid vastavalt 250 ja 120 ms. Skaneeritud ioonide prekursoriioonide massid jäeti MS / MS analüüsist dünaamiliselt välja 30 sekundiks. Ioonid, mille laeng oli 1 ja suurem kui 6, jäeti MS2 analüüsi käivitamisest välja.

MS andmete analüüs Kõiki toorandmeid analüüsiti MaxQuanti (versioon 1.6.6.0) abil, nagu eelnevalt kirjeldatud (Tyanova et al., 2016a). Otsisime Homo sapiens'i jaoks in silico-seeditud UniProti võrdlusproteoomi, sealhulgas kanoonilisi ja isovormi järjestusi (27. mai, 2019). Andmebaasiotsingud viidi läbi vastavalt standardseadistele järgmiste muudatustega. Kasutati seedimist Trypsin/P-ga, mis võimaldas neljal ärajäänud lõhustamisel. Oksüdatsioon (M) ja atsetüül (valgu N-termin) olid lubatud muutuvate modifikatsioonidena maksimaalse arvuga kolm. Karbamido-metüül (C) keelati fikseeritud modifikatsioonina. Sildivaba kvantifitseerimine (LFQ) oli lubatud, kuid ei võimaldanud kiiret LFQ-d. Max-Quant väljundandmeid töödeldi edasi, kasutades Perseuse arvutusplatvormi (v 1.6.6.0; Tyanova et al., 2016b). LFQ intensiivsuse väärtused transformeeriti log2 ning võimalikud saasteained ja valgud, mis tuvastati ainult saidi või pöördpeptiidide järgi, eemaldati. Proovid rühmitati eksperimentaalsetesse kategooriatesse ja vähemalt ühes rühmas eemaldati ka valgud, mida ei tuvastatud neljas korduses neljast. Puuduvad väärtused imputeeriti, kasutades normaalselt jaotatud väärtusi 1,8 allakäiguga (log2) ja randomiseeritud 0,3 laiusega (log2), võttes arvesse kogu maatriksi väärtusi. Viidi läbi statistiline analüüs (t-testid), et teha kindlaks, millised valgud olid oluliselt rikastatud. Loodi vulkaanigraafikud ja statistilise analüüsi väljundtabeleid töödeldi edasi Microsoft Excelis. MS proteoomika andmed on talletatud ProteomeXchange konsortsiumi PRIDE (Perez-Riverol et al., 2019) partnerhoidla kaudu andmestiku identifikaatoriga PXD017940.

Rekombinantse ERCC{0}}XPF puhastamine

Bakuloviiruse tootmine viidi läbi nii, nagu kirjeldatud, kasutades pMacroBac-His-ERCC1/XPF-HA konstrukte (Enzlin ja Sch¨ arer, 2002). ERCC1WT ja ERCC1R156W ekspresseeriti koos XPFWT-ga ühest bakuloviirusest Sf9 putukarakkudes. Heterodimeerid puhastati nikli afiinsuse, suuruse välistamise ja hepariini kromatograafia abil, nagu kirjeldatud (Enzlin ja Sch¨arer, 2002). ERCC1-XPF elueeriti hepariini kolonnist ligikaudu 600 mM NaCl juures. Valkude kontsentratsioonid olid vahemikus 0,1 kuni 0,2 mg/ml.

Nukleaasi analüüs

Tüviahela substraat (GCCAGCGCTCGG(T)22CCGAGCGCTGGC), mis sisaldab fluorestsentsvärvi Cy5 (50 pmol) 39 otsas (IDT), lõõmutati 100-µl anniilimispuhvris (1{{21}). mM Tris, pH 7,5 ja 50 mM NaCl), kuumutades 95 kraadi juures 5 minutit ja jahutades aeglaselt 2 tunni jooksul. 200 fmol lõõmutatud substraati kasutati 20-µl reaktsioonides, mis sisaldasid 25 mM HEPES, pH 8,0, 2 mM MgCl2, 10 protsenti glütserooli, 0,5 mM -merkaptoetanooli, 0,1 mg/ml BSA, 40 mM NaCl ja 0–40 nM valku. Reaktsioone inkubeeriti 30 kraadi juures 30 minutit ja peatati 10 µl 90% formamiidi/10 mM EDTA lisamisega. Pärast 5-minutilist kuumutamist 95 kraadi juures ja jääl jahutamist kanti 15 µl igast proovist 15% denatureerivale polüakrüülamiidgeelile. Geele töödeldi 30 mA juures 30 minutit ja ribad visualiseeriti fluorestsentsi abil Typhoon RGB (Amersham Biosciences) abil.

In vitro NER test

XPF-puudulikud (XP2YO) rakuekstraktid ja kohaspetsiifilist dG-AAF-i kahjustust sisaldav plasmiid genereeriti vastavalt eelnevalt kirjeldatule (Gillet et al., 2005; Shivji et al., 1999). . Iga reaktsiooni jaoks 2 µl paranduspuhvrit (2{{40}}0 mM Hepes-KOH, 25 mM MgCl2, 2,5 mM DTT, 10 mM ATP, 110 mM fosfokreatiini ja 1,8 mg / ml BSA, lõplik pH 7,8), 0,2 µl kreatiinfosfokinaasi puhvrit (2,5 mg/ml kreatiinfosfokinaasi küüliku lihasest [Sigma Aldrich], 10 mM glütsiini, pH 9,0 ja 50 protsenti glütserooli), 3 µl XPF-i puudujääki. ekstrakti, NaCl (lõppkontsentratsioonini 70 mM) ja puhastatud ERCC1-XPF valke kogumahus 9 µl eelsoojendati 30 kraadi juures 10 minutit. Igale reaktsioonile lisati 1 µl dG-AAF-i sisaldavat plasmiidi (50 ng/µl) ja reaktsioone inkubeeriti 30 kraadi juures 45 minutit. Seejärel jahutati reaktsioonisegu jääl 5 minutit, millele järgnes 0,5 µl 1 uM komplementaarse ahela d (GGGGCATGTGGCGCCGGTAATAGC TACGTAGCTC) lisamine ja reaktsioonisegu denatureeriti, kuumutades 95 kraadi juures 5 minutit. Pärast 15-minutilist anniilimist toatemperatuuril lisati 1 µl järjestuse segu (mis sisaldas 0,13 U järjestust ja 2,0 uCi [-32P] dCTP iga reaktsiooni kohta). Pärast eelinkubeerimist 37 kraadi juures 3 minutit lisati 1,2 ui desoksüribonukleotiidtrifosfaadi segu (50 uM dCTP, 100 uM dTTP, 100 uM dATP ja 100 uM dGTP). Reaktsioonisegu inkubeeriti 37 kraadi juures 12 minutit ja reaktsioon peatati 8 µl laadimisvärvi (80 protsenti formamiid ja 10 mM EDTA) lisamisega. Proove kuumutati 95 kraadi juures 5 minutit, jahutati jääl ja kanti 14% denatureerivale polüakrüülamiidgeelile. Geele töödeldi 45 W juures 2,5 tundi ja ribad visualiseeriti seadmega PhosphorImager (Typhoon RGB).

Veebipõhine lisamaterjal

Joonisel S1 on näidatud õe-venna 1 ja venna 2 maksa- ja neerufunktsioonide laboratoorsed väärtused. Joonisel S2 on näidatud genoomse järjestuse andmed, mis kinnitavad missense mutatsiooni ja ERCC1 geeni intrageenset deletsiooni. Joonisel S3 on näidatud ERCC1 ja XPF valgu ekspressioon patsiendi fibroblastides. Joonisel S4 on näidatud puhastatud rekombinantsed ERCC1 ja XPF valgud ning ERCC1WT ja ERCC1R156W Co-IP. Joonisel S5 on näidatud UDS-i, H2AX-i fookuste ja patsiendi mutatsioonide asukoha ERCC1-XPF mikroskoopiapildid. Tabel S1 sisaldab kõigi selles uuringus kasutatud praimerite ja sondide järjestusi. Tabelis S2 on loetletud kõik selles uuringus testitud rakuliinid. Tabelis S3 on loetletud kõik selles uuringus osalenud plasmiidid. Tabelis S4 on toodud uuringu sgRNA järjestused ja tabelis S5 on näidatud antikehad. Tabelis S6 on toodud joonistel kvantifitseerimiseks kasutatud rakkude arv. Data S1 kuvab kõik kärpimata Western blot failid.

Tänuavaldused

Autorid tunnustavad nii õdesid-vendi kui ka nende vanemaid sellesse artiklisse panustamise eest, Sylvie Noordermeeri (Leideni ülikooli meditsiinikeskus [LUMC], Leiden, Holland) thepLenti-CW57-TO-GFP lentiviiruse ekspressioonivektori ja nõuande eest KI genereerimiseks. rakud, Joachim Goedhart (Amsterdami Ülikool, Amsterdam, Holland) mVenuse cDNA jaoks, Bert van derKooij (LUMC, Leiden, Holland) DNA-PK inhibiitori jaoks, Wim Vermeulen ja Anja Rams (Erasmus MC, Rotterdam, Holland) pakkumise eest. 165TOR rakud, Tomoo Ogi (Nagoya Ülikool, Jaapan) CS20LO rakkude pakkumise eest, Alan Lehman (Sussexi ülikool, Ühendkuningriik) CSL16NG ja CSL16NG hTERT rakkude pakkumise eest ning Joost Schimmel (LUMC, Leiden, Holland) nõustamiseks KI rakkude loomisel .

Seda tööd rahastasid Leideni ülikooli meditsiinikeskuse teadusstipendium ja Nederlandse Organisatie voor We tenschappelijk Onderzoek VIDI stipendium (ALW.016.161.320) MSLuijsterburgile, Euroopa Teadusnõukogu starditoetus (310913) ACO Vertegaalile, KWF Young Kankergabes'i stipendiumile. 11367) R. Gonz´alez-Prietole, KWF Kan kerbestrijding stipendium (VU 2013-5983) MA Rooimansile ning Korea alusteaduste instituudi (IBS-R022-A1) ja riikliku stipendiumid Vähiinstituut (P01CA092584) ODSch arerile.

Autori kaastööd: K. Apelt genereeris KO rakud, KI rakud ja stabiilsed rakuliinid; viidi läbi Western blot ja immunovärvimised ERCC1 ja XPF ekspressiooniks, lentiviiruse transduktsioonid, klonogeensed ellujäämised (UV, MMC, IR), Co-IP katsed Western blot analüüsiks, UDS katsed, Co-IP katsed MS jaoks ja H2AX värvimised; ja kirjutas paberit. A. Kragten tegi pärast kohalikku UV-kiirgust UDS-i, RRS-i ja immunovärvimise. AP Wonder gem genereeris KO- ja KI-rakud ning viis missense-mutatsiooni kinnitamiseks läbi UDS-katsed, Western blot ja Sangeri sekveneerimise. SM White nõustas patsiente, analüüsis eksoomiandmeid, tegi biopsiaid, genereeris primaarsed fibroblastid ja kirjutas patsiendi kliinilise kirjelduse. S. Lunke ja BT Wilson genereerisid NGS-i andmed. S. Pantaleo ja D. Flanagan viisid deletsiooni kinnitamiseks läbi qPCR. C. Quinlan kirjutas neeru kliinilise kirjelduse. W. Hardikar kirjutas maksa kliinilise kirjelduse. MA Rooimans ja R.MF Wolthuis genereerisid hTERT-immortaliseeritud 48BR ja PV50LD fibroblastid ning viisid läbi MMC-indutseeritud kromosoomi purunemise testid. R. Gonzalez-Prieto ja ACO Vertegaal analüüsisid kõiki MS katseid. WW Wiegant ja H. vanadium teostasid U2OS rakkudes (IR) klonogeenseid ellujäämisi. J.-E.Yeo ja HS Kim puhastasid rekombinantseid valke ning viisid läbi nukleaasitesti ja in vitro NER-testid. OD Sch¨arersi poolt juhendatud in vitro NER töö aitas kaasa R156W alleeli struktuursele tõlgendamisele ja toimetas paberit. MS Luij sterburg juhendas projekti ja kirjutas paberi.

Viited

Abdel Ghaffar, TY, ES Elsobky ja SM Elsayed. 2011. Kolestaas Cockayne'i sündroomiga patsientidel ja kliinilise diagnoosi muudetud kriteeriumid. OrphanetJ. Haruldane Dis. 6:13. -1172-6-13

Abdullah, UB, JF McGouran, S. Brolin, D. Ptchelkine, AH El-Sagheer, T. Brown ja PJ McHugh. 2017. RPA aktiveerib XPF-ERCC1 endonukleaasi, et algatada DNA ahelatevaheliste ristsidemete töötlemine. EMBO J. 36: 2047–2060.

Adair, GM, RL Rolig, D. Moore-Faver, M. Zabelshansky, JH Wilson ja RS Nairn. 2000. ERCC1 roll pikkade mittehomoloogsete sabade eemaldamisel suunatud homoloogse rekombinatsiooni ajal. EMBO J. 19:5552–5561.

Ahmad, A., AR Robinson, A. Duensing, E. van Drunen, HB Beverloo, DB Weisberg, P. Hasty, JH Hoeijmakers ja LJ Niedernhofer. 2008. ERCC1-XPF endonukleaas hõlbustab DNA kaheahelalise katkestuse parandamist. Mol. Kamber. Biol. 28:5082–5092.

Ahmad, A., JH Enzlin, NR Bhagwat, N. Wijgers, A. Raams, E. Appledoorn, AF Theil, JH J Hoeijmakers, W. Vermeulen, NG J Jaspers jt. 2010. XPF-ERCC1 nukleaasi vale lokaliseerimine aitab kaasa DNA paranemise vähenemisele XP-F patsientidel. PLoS Genet. 6:e1000871.

Auerbach, AD 2009. Fanconi aneemia ja selle diagnoos. Mutat. Res. 668:4–10.

Ben Chehida, A., N. Ghali, R. Ben Abdelaziz, F. Ben Moussa ja N. Tebib. 2017. Kahe Cockayne'i sündroomiga õe-venna neerukahjustus. Iraan. J. Kidney Dis. 11:253–255.

Biggerstaff, M., DE Szymkowski ja RD Wood. 1993. ERCC1, ERCC4 ja xeroderma pigmentosum rühma F DNA parandamise defektide kooskorrektsioon in vitro. EMBO J. 12:3685–3692.

-2075.1993.tb06043.xBogliolo, M., B. Schuster, C. Stoepker, B. Derkunt, Y. Su, A. Raams, JP Trujillo, J. Minguillón, MJ Ramı´rez, R. Pujol jt. 2013. Mutatsioonid ERCC4-s, mis kodeerivad DNA-d parandavat endonukleaasi XPF, põhjustavad Fanconi aneemiat. Olen. J. Hum. Genet. 92:800–806.

Ceccaldi, R., P. Sarangi ja AD D'Andrea. 2016. Fanconi aneemia rada: uued mängijad ja uued funktsioonid. Nat. Rev Mol. Cell Biol. 17: 337–349.

de Laat, WL, E. Appeldoorn, NG Jaspers ja JH Hoeijmakers. 1998a. ERCC1-XPF endonukleaasi aktiivsuseks vajalikud DNA struktuurielemendid. J. Biol. Chem. 273:7835–7842.

de Laat, WL, AM Sijbers, H. Odijk, NG Jaspers ja JH Hoeijmakers. 1998b. Inimese parandusvalkude ERCC1 ja XPF interaktsioonidomeenide kaardistamine. Nucleic Acids Res. 26:4146–4152.

nar/26.18.4146

de Vries, A., CT van Oostrom, FM Hofhuis, PM Dortant, RJ Berg, FR de Gruijl, PW Wester, CF van Kreijl, PJ Capel, H. van Steeg ja SJ Verbeek. 1995. Suurenenud vastuvõtlikkus ultraviolett-B ja kantserogeenide suhtes hiirtel, kellel puudub DNA ekstsisiooni parandamise geen XPA. Loodus. 377:169–173.

DiGiovanna, JJ ja KH Kraemer. 2012. Säravad valgust xeroderma pigmentosumile. J. Invest. Dermatol. 132:785–796.

Enzlin, JH ja OD Schrer. 2002. DNA parandamise endonukleaasi XPF-ERCC1 aktiivne sait moodustab väga konserveerunud nukleaasi motiivi. EMBO J. 21:2045–2053.

Funaki, S., S. Takahashi, H. Murakami, K. Harada ja H. Kitamura. 2006. Cockayne'i sündroom koos korduva ägeda tubulointerstitsiaalse nefriidiga. Pathol. Int. 56:678–682.

.02029.x

Gillet, LC, J. Alzeer ja OD Schrer. 2005. N-(desoksüguanosiin-8-üül)-2-atsetüülaminofluoreeni (dG-AAF) kohaspetsiifiline lisamine oligonukleotiididesse, kasutades modifitseeritud ülikerget DNA sünteesi. Nucleic Acids Res. 33:1961–1969.

Gregg, SQ, AR Robinson ja LJ Niedernhofer. 2011. ERCC1-XPF DNA parandamise endonukleaasi defektide füsioloogilised tagajärjed. DNA parandamine (Amst.). 10:781–791.

Guo, C., Y. Nakazawa, L. Woodbine, A. Bjorkman, M. Shimada, H. Fawcett, N. Jia, K. Ohyama, TS Li, ​​Y. Nagayama jt. 2015. XRCC4 puudulikkus inimestel põhjustab märkimisväärset neuroloogilist fenotüüpi, kuid mitte ilmset immuunpuudulikkust. J. Allergy Clin. Immunol. 136:1007–1017.

Helfricht, A., PE Thijssen, MB Rother, RG Shah, L. Du, S. Takada, M. Rogier, J. Moritz, H. IJspeert, C. Stoepker jt. 2020. ZBTB24 kadumine kahjustab ICF-i sündroomiga patsientidel mittehomoloogilist lõpp-liitumist ja klassivahetuse rekombinatsiooni. J. Exp. Med. 217:e20191688.

Houtsmuller, AB, S. Rademakers, AL Nigg, D. Hoogstraten, JH Hoeijmakers ja W. Vermeulen. 1999. DNA parandamise endonukleaasi ERCC1/XPF toime elusrakkudes. Teadus. 284:958–961. h

teadus.284.5416.958

Jaspers, NG, A. Raams, MC Silengo, N. Wijgers, LJ Niedernhofer, AR Robinson, G. Giglia-Mari, D. Hoogstraten, WJ Kleijer, JH Hoeij-makers ja W. Vermeulen. 2007. Esimesel teatatud patsiendil, kellel on inimese ERCC1 puudulikkus, on tserebro-oculofacio-skeleti sündroom, millel on nukleotiidide ekstsisiooni parandamise kerge defekt ja tõsine arengupuudulikkus. Olen. J. Hum. Genet. 80:457–466.

Joenje, H., AB Oostra, M. Wijker, FM di Summa, CG van Berkel, MA Rooimans, W. Ebell, M. van Weel, JC Pronk, M. Buchwald ja F. Arwert. 1997. Tõendid vähemalt kaheksa Fanconi aneemia geeni kohta. Olen. J. Hum. Genet. 61:940–944.

Jones, M., F. Beuron, A. Borg, A. Nans, CP Earl, DC Briggs, AP Snijders, M. Bowles, EP Morris, M. Linch ja NQ McDonald. 2020. XPF-ERCC1 endonukleaasi krüo-EM struktuurid näitavad, kuidas DNA-ühenduse seotus häirib automaatselt inhibeeritud konformatsiooni. Nat. Commun. 11: 1120.

Karikkineth, AC, M. Scheibye-Knudsen, E. Fivenson, DL Croteau ja VA Bohr. 2017. Cockayne'i sündroom: kliinilised tunnused, mudelisüsteemid ja rajad. Aging Res. Ilm 33:3–17.002

Kashiyama, K., Y. Nakazawa, DT Pilz, C. Guo, M. Shimada, K. Sasaki, H. Fawcett, JF Wing, SO Lewin, L. Carr jt. 2013. Nukleaasi ERCC1-XPF talitlushäire põhjustab erinevaid kliinilisi ilminguid ja põhjustab Cockayne'i sündroomi, pigmenti xeroderma ja Fanconi aneemiat. Olen. J. Hum. Genet. 92:807–819.