Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Palun klõpsake siin 2. osa juurde

Cistanche on väga hea neuroprotektiivse toimega

Gabriel Gonzalez 1,2, Jiˇrí Grz 1, Cosimo Walter D'Acunto 1, Petr Ka ˇnovsk2 ja Miroslav Strnad 1,2,*

1. Kasvuregulaatorite labor, Tšehhi Teaduste Akadeemia Eksperimentaalbotaanika Instituut,

ja Palacký ülikooli loodusteaduskond, Šlechtitel ˚u 27, CZ-78371 Olomouc, Tšehhi Vabariik;

Gonzalez.gabriel@seznam.cz (GG); jiri.gruz@upol.cz (JG); waldacun@gmail.com (CWD)

2. Olomouci ülikooli haigla neuroloogiaosakond ning arsti- ja hambaraviteaduskond,

Palacký Ülikool Olomouc, CZ-775 20 Olomouc, Tšehhi Vabariik; Petr.Kanovsky@fnol.cz

* Kirjavahetus: miroslav.strnad@upol.cz; Tel.: pluss 420-585-634-850

Abstraktne: Tsütokiniinidon adeniinil põhinevad fütohormoonid, mis reguleerivad taimedes toimuvaid võtmeprotsesse, nagu rakkude jagunemine ja diferentseerumine, juurte ja võrsete kasv, tipu domineerimine, hargnemine ja seemnete idanemine. Esialgsetes uuringutes on nad näidanud ka kaitsvat toimet inimese neurodegeneratiivsete haiguste vastu. Teadmiste laiendamiseks nende pakutavast kaitsest (kaitsetegevusest) uurisime looduslikke tegevusitsütokiniinidsalsolinooli (SAL) põhjustatud toksilisuse vastu (aParkinsoni tõbimudel) ja glutamaadi (Glu) põhjustatud surmneuron- nagu dopamiinergilised SH-SY5Y rakud. Leidsime, et SAL-indutseeritud PD mudelis olid aktiivsed kinetiin-3-glükosiid, cis-zeatiinribosiid ja N6-isopentenüüladenosiin. Lisaks vähendasid trans-, cis-zeatiin ja kinetiin koos rauda kelaativa deferoksamiiniga (DFO) ja nekroptoosi inhibiitoriga nekrostatiin 1 (NEC{10}}) märkimisväärselt rakusurma määra Glu-indutseeritud mudelis. Laktaatdehüdrogenaasi testid näitasid, ettsütokiniinidsätestatud madalamalneuroprotektiivnetegevust kui DFO ja NEC-1. Lisaks vähendasid nad apoptootilist kaspaasi{1}}/7 aktiivsust vähem tugevalt kui DFO. Siiski,tsütokiniinidavaldasid superoksiidi radikaalide tootmisele väga sarnast mõju DFO-le ja NEC-le{0}}. Üldiselt näitasid nad SAL-indutseeritud mudelis kaitsvat toimetparkinsonistneuronaalnerakusurma ja Glu-indutseeritud oksüdatiivse kahjustuse mudelit peamiselt oksüdatiivse stressi vähendamise kaudu.

Märksõnad: tsütokiniin; fütohormoon; neuroprotektsioon; neuronilaadsed SH-SY5Y rakud; tsütotoksilisus; salsolinool; glutamaat; oksüdatiivne stress; Parkinsoni tõbi

cistanche taimmõjude kohtaNeuroprotektsioon

1. Sissejuhatus

Parkinsoni tõbi(PD) on teine ​​​​kõige levinum motoorne neurodegeneratiivne haigus ja ülemaailmselt diagnoositud haigusjuhtude arv kasvab 2015. aasta 6 miljonilt 2040. aastaks enam kui 12 miljonile [1]. Seda iseloomustavad motoorsed sümptomid, mis on seotud spetsiifilise degeneratsiooniga ja ligikaudu 30–70% dopamiinergilise (DA) kadumisega.neuronidsubstantia nigra pars compacta ja nende projektsioonid juttkehasse [2,3]. Mõned PD paljudest teadaolevatest molekulaarsetest tunnustest hõlmavad suurenenud oksüdatiivset ja nitrosatiivset stressi, mitokondriaalset düsfunktsiooni [4–7], eksitotoksilisust [8], ubikvitiini/proteasomaalse süsteemi düsfunktsiooni [9] ja neuropõletikku [10]. Praegustel ravimeetoditel on mitmesugused ebasoodsad kõrvalmõjud ja need pakuvad ainult sümptomaatilist leevendust [11], mistõttu tehakse intensiivseid jõupingutusi selliste ravimite väljatöötamiseks, millel on degenereeruvale DA-le tõhus raviv toime.neuronid. Ressursid, mis võivad selliseid jõupingutusi aidata, hõlmavad looduslikke ühendeid, millel on tavaliselt vähem kõrvaltoimeid. Muuhulgas on Ginkgo biloba (ginkgetiin, ginkgoliid, bilobaliid), ženšenni (ginsenosiidid) ja flavonoidide (baikaleiin, kaempferool, rutiin ja luteoliin) ained mitmetes in vitro mudelites (sealhulgas inimese neuroblastoomi rakuliinis SH) näidanud laialdast kaitsvat toimet. -SY5Y) ja 1,1'-dimetüül-4,4'-bipüridiiniumdikloriidi (parakvaat), 1-metüül- 4-fenüül-1 poolt indutseeritud PD in vivo mudelid, 2,3,6-tetrahüdropüridiin (MPTP), 1-metüül-4-fenüülpüridiinium (MPP pluss ) ja 6-hüdroksüdopamiin (6-OHDA) [12].

Siin esitatud uuring keskendus looduslike fütohormoonide klassi mõjuletsütokiniinid(CK) ja nende metaboliidid, mis on taimedes hästi tuntud rakkude jagunemise, kasvu, diferentseerumise ja lehtede vananemise regulaatorid [13]. Struktuuriliselt on CK-d adeniini derivaadid, mis on asendis N6- asendatud kas prenüül- (isopentüül-) või aromaatse külgahelaga. Looduslike vormide hulka kuuluvad 6-(E)-4-hüdroksü-3-metüül-but-2-enüülaminopuriin (transzeatiin, tZ), selle 6-(Z)-isomeer ( cis-zeatiin, cZ), N6-isopentenüüladeniin (iP), 6-bensüülaminopuriin (BAP), 6-furfurüülaminopuriin (kinetiin, K) ja orto-, meta-, ja BAP parahüdroksüülitud või metoksüleeritud derivaadid, mida nimetatakse topoliinidena (oT, mT, pT, MeoT, MemT, MepT). Sageli esinevad ka nende vormide mitmesugused 9-ribosiidid, 9-nukleotiidid, aga ka 7-, 9 ja O-glükosiidid, nagu on näidatud tabelis 1. Lisaks nende loomulikele rollidele taimed, CK-d on näidanud tugevat antioksüdantset toimet reaktiivsete hapnikuliikide (ROS) suhtes, mis pakub kaitset mitmete vananemisega seotud häirete in vitro stressimudelite korral [14].

Tabel 1. Struktuuridtsütokiniinidja positiivsed kontrollained.

Eelkõige on CK-del väidetavalt tsütoprotektiivne toime sellistes mudelites nagu H2O2--indutseeritud inimese fibroblastide rakusurm [15] ja D-galaktoosi poolt indutseeritud glükosidatiivne stress roti astrotsüütides [16]. Mis veelgi olulisem, selles kontekstis on nad näidanudneuroprotektiivnemõju mudelitele, mis on seotud neurodegeneratiivsete haigustega, nagu perekondlik PD, proteasoomi inhibiitori MG 132-indutseeritud või H2O2- indutseeritud toksilisus SH-SY5Y rakkudes [17], Glu-indutseeritud hiire hipokampuse HT22 oksüdatiivne kahjustusneuronaalnerakud [18] ja Huntingtoni tõve PC12 rakumudel [19]. Teised uuringud näitavad, et CK-de kaitsetegevus hõlmab nii otsest [20, 21] kui ka kaudset [15, 16, 22] raku redokssüsteemide moduleerimist. Lisaks CK-de iseloomulikule antioksüdantsele toimele on neil väidetavalt mitokondrites regulatiivne toime, mis suurendabneuronaalneelujõulisus [17]. Lisaks võib K stabiliseerida mitokondriaalse membraani potentsiaali ja suurendada ATP tootmist, leevendades seeläbi HT22 rakkude Glu-indutseeritud surma [18]. Vaatamata leidudele nende mõju kohta mitmetes mudelites, on CK-de kaitsva aktiivsuse kohta PD kõige tavalisema (juhusliku) vormi puhul siiski vähe teadmisi.

Eespool kirjeldatud teadmiste puudujäägi kõrvaldamiseks hindasime süstemaatiliselt looduslike CK-de ja nende metaboliitide mõju kahes in vitro mudelis: salsolinooli (SAL) indutseeritud PD mudel ja glutamaadi (Glu) poolt indutseeritud oksüdatiivse kahjustuse mudelneuron- nagu SH-SY5Y rakud. Seda liini kasutati selle dopamiinergilise fenotüübi, tundlikkuse tõttu dopamiinergiliste toksiinide, nagu SAL, ja suhteliselt stabiilsete diferentseeritud populatsioonide mugava moodustamise tõttu.neuronaalnevähenenud proliferatsioonikiirusega rakud pärast 48-tunnist kokkupuudet 10 uM all-trans-retinoehappega (ATRA) [23–25].

Neuron-sarnased rakud eksponeeriti endo/eksotoksiin SAL-iga, et jäljendada PD patoloogiat rakulise redokssüsteemi düsfunktsiooni kaudu: glutatiooni (GSH) vähenemine ja nii antioksüdantse ensüümi (Cu/Zn superoksiidi dismutaas ja katalaas) kui ka mitokondriaalse aktiivsuse pärssimine. kompleksid (I ja II), mis põhjustavad apoptoosi ja nekroosi [26]. Teises mudelis kutsub Glu esile potentsiaalselt surmava oksüdatiivse kahjustuse, katkestades redokssüsteemi. Mõlemat SH-SY5Y rakuliini mudelit on varem kasutatud neuroprotektsiooni uuringutes [26,27].

Testitud on K, iP, BAP, iPR, tZR ja nende vabade aluste degeneratiivsete häiretega seotud tsütoprotektiivset ja/või antioksüdantset toimet ning (nagu ülalpool kirjeldatud) on leitud, et mõnedel CK-del on kaitsev toimeneuronaalnerakud. Siiski ei ole varem avaldatud uuringud uurinud struktuurineuroprotektiivnelooduslike CK-de aktiivsussuhe (SAR) (tabel 1). Seetõttu viidi see uuring läbi, et uuridaneuroprotektiivne(anti-parkinsonist) peaaegu kõigi teadaolevate looduslikult esinevate CK-de aktiivsust valitud SAL- ja Glu-indutseeritud neurodegeneratsiooni mudelites. Esiteks hindasime iga CK hapnikuradikaali neeldumisvõimet (ORAC) ja (ohutustestides) tsütotoksilisust.neuron- nagu SH-SY5Y rakud. Seejärel hindasime ühendite neuroprotektiivset toimet ja mõju oksüdatiivse stressi tasemele, mõõtes superoksiidi (O2.) tootmist (dihüdroetiidium, DHE test) ja apoptootilise kaspaasi -3,7 aktiivsust. Tulemused annavad esimesed süstemaatilised viited seostele looduslike CK-de struktuuride janeuroprotektiivnetegevused.

Cistanche herbaon väga heaneuroprotektiivnemõju

2. Tulemused ja arutelu

2.1. Tsütokiniinide hapnikuradikaalide neeldumisvõime (ORAC)

Kuna neurodegeneratiivseid haigusi seostatakse kõrgenenud oksüdatiivse stressiga, mängib antioksüdantne aktiivsus võtmerollineuronaalnerakud. CK-de bioloogilise potentsiaali hindamiseks määrati antioksüdantide võime ORAC abil, mida tavaliselt kasutatakse ainete antioksüdantse võime määramiseks [28]. Antioksüdantide võime väljendati Troloxi ekvivalentidena (TE), mis määrab ühendite efektiivsuse (madalamast kuni kõrgemani) kui Trolox ekvimolaarsel alusel. Tabelis 1 esitatud tulemused näitavad, et topoliinidel (oT, mT ja pT) ja nende ribosiididel (oTR, mTR, pTR) on kõrge antioksüdantne toime, mis on tõenäoliselt tihedalt seotud nende C{{ elektronirikka süsteemiga. 3}}hüdroksübensüülaminoasendaja. Vaatamata nende kõrgetele ORAC väärtustele ei olnud topoliinidel kõrgeidneuroprotektiivnetegevust. Kuid mitmed heteroaromaatsed CK-d, sealhulgas K (N6-furfurüülaminopuriin) ja mittearomaatne cis-zeatiin-O-glükosiid (cZOG), millel on 4-hüdroksü-3-metüülbut{{7} }en-1-üül)aminoasendaja, näitas samuti suurt antioksüdantset võimet (tabel 2). Muud CK metaboliidid, sealhulgas kinetiin{10}glükosiid (K3G), kinetiinribosiid 5<-monophosphate (kmp),="" kinetin-9-glucoside="" (k9g),="" and="" trans-zeatin=""><- monophosphate="" (tzmp)—had="" moderate="" antioxidant="" activity.="" all="" the="" others="" had="" detectable="" capacity="" except="" bap.="" these="" results="" confirm="" previous="" findings="" that="" ip,="" pt,="" k="" can="" act="" as="" direct="" radical="" scavengers,="" but="" conflict="" with="" the="" previously="" reported="" activity="" of="" bap="" in="" the="" orac="" test="" [20,21].="" to="" conclude,="" these="" compounds="" have="" potential="" in="" the="" treatment="" of="" neurodegenerative="" diseases="" associated="" with="" increased="" oxidative="" stress="">

cistanche varre eelisedpealAlzheimeri tõve vastane

2.2. SH-SY5Y rakkude diferentseerumine

CK-de uurimiseksneuroprotektiivneSH-SY5Y neuroblastoomirakud (valitud juba kirjeldatud põhjustel [23]) diferentseeriti kokkupuutel 10 uM ATRA-ga 48 tunni jooksul, nagu eelnevalt kirjeldatud [23, 24]. Seejärel värviti need membraanivärvimiskomplekti abil, et uurida morfoloogilisi erinevusi diferentseerumata ja diferentseerunud rakkude vahel. Nagu on näidatud joonisel 1A,neuron-sarnased diferentseerunud rakud kasvasid vähem tihedalt, olid pikemaajalised ja tekitasid rohkem neuriite (joonisel on näidatud kollaste nooltega) kui diferentseerumata rakud. Neid diferentseerumisega seotud morfoloogilisi muutusi on varem täheldatud isegi pärast lühemat kokkupuudet (24 tundi) ATRA-ga [24, 30]. Veelgi olulisem on see, et neuriitide arv tõuseb järsult tasemele, mil nad suudavad luua neuriitide võrgustiku. Sel põhjusel mõõdeti rakkude elujõulisust, et võrrelda diferentseerumata ja diferentseerunud SH-SY5Y rakkude proliferatsiooni kiirust. Diferentseerumata SH-SY5Y elujõulisust peeti maksimaalseks proliferatsioonikiiruseks. Tulemused on esitatud

Joonisel fig 1B on näidatud, et SH-SY5Y proliferatsioonikiirus (hinnatud Calcein AM elujõulisuse testiga) vähenes pärast 48-tunnist ATRA-ravi 23 protsenti.

Joonis 1. (A) SH-SY5Y rakkude fluorestseeruvad mikropildid, mille membraanid on värvitud Neurite väljakasvukomplektiga (Invitrogen™): Kontroll, diferentseerumata rakud (eksponeeritud näidistöötluslahusega:<0.1% dmso);="" cells="" differentiated="" by="" exposure="" to="" 10="" um="" all-trans="" retinoic="" acid="" (atra)="" for="" 48="" h.="" bars="50" um.="" (b)="" proliferation="" rates="" of="" undifferentiated="" and="" differentiated="" sh-sy5y="" cells:="" numbers="" of="" viable="" cells="" after="" 48="" h="" exposure="" to=""><0.1% dmso="" and="" 10="" um="" atra,="" respectively.="" data="" were="" obtained="" from="" five="" independent="" experiments="" with="" triplicate="" cultures:="" asterisks="" show="" the="" significance="" of="" differences="" in="" numbers="" of="" viable="" cells="" (as="" percentages="" of="" numbers="" of="" undifferentiated="" cells)="" between="" the="" cultures:="" *="" p="" <="">

Tabel 2. Katsetatava hapnikuradikaali neeldumisvõime (ORAC).tsütokiniinid(CK) väljendatuna Troloxi ekvivalentidena (TE) ekvimolaarsetel alustel. CK-de nimed, lühendid ja struktuurid on toodud joonisel 1.

2.3. Tsütokiniinide tsütotoksilisus neuronitaoliste SH-SY5Y rakkude suhtes

CK-de võimaliku tsütotoksilisuse testides Calcein AM elujõulisuse testiga [31] näitas enamik neist madalat toksilisust.neuron- nagu SH-SY5Y rakud. Elujõulisuse vähenemist alla 90 protsendi peeti neurotoksilise toime läveks. Ainsad kaks erandit olid KR (11,9 protsenti) ja pTR (10,5 protsenti), vastavalt varasematele järeldustele, et mõnedtsütokiniinmetaboliitidel, eriti ribosiididel, võib olla tsütotoksiline toime [32]. Teised ribosiidid, nagu cZR, iPR, oTR, mTR, ei põhjustanud nähtavat vähenemistneuron-sarnaste SH-SY5Y rakkude elujõulisus (tabel 3). Meie in vitro mudelis positiivsete kontrollidena kasutatud DFO [33,34] ja NEC{6}} [35,36] on samuti tõestanud, et teised SH-SY5Y rakkudega tehtud uuringud on mittetoksilised. Kokkuvõttes näitasid peamiselt derivaadid KR ja pTR madalamat elujõulisust kui 90 protsenti ja seetõttu peeti neid mõlemas neurodegeneratsiooni in vitro mudelis edasiseks hindamiseks vähem huvitavaks.

Tabel 3. Rakkude elujõulisusneuron- nagu SH-SY5Y rakud pärast kokkupuudettsütokiniinid24 tunniks. Elujõulisust väljendatakse DMSO kontrolli protsendina.

2.4. Neuroprotektiivsete tsütokiniinide tuvastamine SAL-indutseeritud PD mudelis

Nende testide jaoksneuronaalneSH-SY5Y rakke diferentseeriti 48 tundi, seejärel töödeldi neid koos 500 uM SAL-iga ja iga CK-ga kolmes kontsentratsioonis (0,1, 1, 10 uM). Nagu on näidatud punktiirjoonega joonisel 2A, vähendas neurotoksiini SAL-i manustamine kontsentratsioonis 500 uM Calcein AM testi järgi diferentseerunud SH-SY5Y rakkude elujõulisust 30 protsenti. N-atsetüültsüsteiini (NAC) kasutati nendes testides positiivse kontrollina, kuna sellel oli varem teatatud neuroprotektiivne toime samas SH-SY5Y rakupõhises in vitro mudelis [37]. Osalise või peaaegu täieliku taastumise esilekutsumiseks SAL-mudelis kasutati NAC kontsentratsioone 10, 100 ja 1000 uM. NAC suutis suurendada rakkude elujõulisust kontsentratsioonidel 100 uM ja 1 mM, mis vastab vastavalt 83,39 ± 1,74 protsendile ja 89,21 ± 2,89 protsendile. NAC-i kaitsvat aktiivsust 100 uM juures (näidatud katkendjoonega joonisel fig 2A) kasutati tugevuslävena CK-de valimisel edasisteks testideks. Selle seadistuse kohaselt on bioloogiliselt olulisi neuroprotektiivseid toimeid täheldatud K3G-ga 10 uM (81,84 ± 2,36 protsenti), cZR-i puhul 0,1 uM (81,14 ± 2,30 protsenti) ja 1 uM (81,53 ± 2,30 protsenti) ja 1 uM juures (81,53 ± 2,36 protsenti ± )12i 2i. uM (82,43 ± 2,51 protsenti). Seega olid iPR ja cZR efektiivsed neuroprotektorid madalamates mikro- või submikromolaarsetes kontsentratsioonides kui NAC. Thetsütokiniinsõelumine näitas ka, et paljud teised metaboliidid võivad mõõdukalt suurendada SAL-iga kokkupuutunud diferentseerunud SH-SY5Y rakkude elujõulisust. Mõnel testitud CK-l (sealhulgas tZR, tZMP, mT, mTR, pT ja pTR) oli aga väga väike kaitseefekt.

Joonis 2. (A)Neuroprotektiivnetegevustsütokiniinidja N-atsetüültsüsteiini (NAC) SAL-indutseeritud PD mudelisneuron- nagu SH-SY5Y rakud. Katkendjoon näitab NAC-efekti läve, mille juurestsütokiniinidvaliti edasiseks testimiseks; punktiirjoon loendab seejärel elusrakkude arvu Calcein AM testis pärast rakkude töötlemist 500 uM SAL-ga; terved kontrollrakud (CTR, DMSO < 0,1="" protsenti).="" kolmekordne="" vähemalt="" kolme="" eraldiseisva="" päeva="" jooksul.="" (b)="" normaliseeritud="" sh-sy5y="" rakusurm="" pärast="" propiidiumjodiidiga="" värvimist.="" kolmekordistub="" vähemalt="" viie="" sõltumatu="" päeva="" jooksul.="" *="" p="" võrreldes="" sõidukiga,="" mille="" sal="" on="" 500="" um,="" #="" p="" võrreldes="" sõidukiga,="" millel="" puudub="" 500="" um="">

Kinnitamaks kõige aktiivsemate looduslike CK-de anti-PD aktiivsust, kvantifitseeriti üldine rakusurma propiidiumjodiidi (PI) värvimisega, mis (erinevalt raku metabolismil põhinevatest elujõulisuse testidest) märgistab ainult kahjustatud membraani terviklikkusega rakke ja surevaid rakke. ja juba surnud rakud [38]. Tulemused normaliseeriti rakusurma määra suhtes pärast ravi ainult SAL-iga (määratud 100 protsenti). Nagu on näidatud joonisel 2B, vähendas NAC positiivne kontrollaine märkimisväärselt rakusurma määra nii 100 kui ka 1000 uM juures (vastavalt 77,3 ± 2,21 protsendini ja 77,5 ± 4,44 protsendini). Üldiselt osutus NAC aneuroprotektiivneaine, mille toime on võrreldav teistes uuringutes registreeritud toimega annusest sõltuval viisil (vahemikus 50–500 uM) SH-SY5Y rakkude puhul [37]. PI-analüüs näitas ka, et CK-del cZR, K3G ja iPR on kaitsev toime, eriti cZR, mis vähendas rakusurma määra 0,1 uM juures 71,6 ± 5,08 protsendini. Erinevalt cZR-st oli K3G-l vastupidine annusest sõltuv toime, maksimaalne aktiivsus oli 10 uM (vähendades rakusurma määra 75,0 ± 3,69 protsendini) ja NPR aktiivsus saavutas haripunkti 1 uM (vähendades määra 73,9 ± 4,99 protsendini). Kokkuvõttes, nagu on näidatud joonisel 2, andsid CK-d võrreldava tulemuseneuroprotektiivneaktiivsus 100 uM NAC-ni vastavalt nii elujõulisuse kui ka tsütotoksilisuse analüüsidele. Veelgi enam, CK-de, nagu cZR ja iPR, efektiivsed kontsentratsioonid olid submikromolaarsetes ja mikromolaarsetes vahemikes palju madalamad kui NAC-i omad. Varasemad tähelepanekud, mis saadi pärast topeltvärvimist PI ja anneksiin V/PI-ga, näitavad, et K võib vähendada apoptoosi [39], seega uurisime ka CK-de ja NAC mõju oksüdatiivsele stressile ja kaspaasi -3,7 aktivatsioonile (hästi tuntud apoptoosimarker).

2.5. Tsütokiniinid vähendavad SAL-i indutseeritud superoksiidi radikaalide moodustumist

Oksüdatiivne stress (OS) on mitmete neurodegeneratiivsete haiguste peamine patoloogiline soodustaja ning nii SAL (> 100 uM) kui ka tetrahüdroisokinoliinid on tugevad OS-i indutseerijad [26,40]. Seega mõõtsime ka superoksiidi (ROS-i ja olulise OS-i markeri) moodustumist SAL-i juuresolekul koos valitud CK-de või NAC-ga ja ilma. Tagamaks, et SAL põhjustas SH-SY5Y rakkudes piisava OS-i kahjustuse vastuste tuvastamiseks, eksponeeriti rakke 24 tunniks 500 uM SAL-iga, nagu eelmises töös [37] ja vastavalt ülaltoodud leidudele. Seejärel värviti rakud dihüdroetiidiumiga (DHE), et tuvastada superoksiidi radikaalide moodustumist [41, 42]. Nagu on näha jooniselt 3A, vaadeldi rakke visuaalselt pärast märgistamist DHE-ga (mis annab pärast superoksiidiga reageerimist punaseid fluorestsentssignaale). SAL kutsus esile DHE fluorestsentsi selge tõusu, võrreldes kontroll- ja NAC-ga töödeldud rakkude tasemetega. Lisaks olid kolmel CK-l (cZR, K3G ja iPR) DHE fluorestsentsil sarnased visuaalsed efektid NAC-ga (100 uM). Lisaks oli spektrofotomeetriline kvantifitseerimine ainult SAL-iga töödeldud rakkudes tuvastatud tasemete suhtes (määratud 100 protsendiks) kooskõlas mikroskoopiaga. Nagu on näidatud joonisel 3B, oli normaliseeritud superoksiidi tase tervetes kontrollrakkudes (CTR) alla 39 protsendi ja positiivne kontrollaine NAC vähendas SAL-i poolt indutseeritud ROS-i tootmist mõõdukalt kuni täielikult 100 ja 1000 uM juures (76,3-ni). ± 4,33 ja 44,3 ± 5,12 protsenti, mis viitab sellele, et glutatiooni (GSH) vähenemine mängib mudelis võtmerolli [26]. Huvitaval kombel indutseeris SAL SH-SY5Y rakkude GSH sisalduse dramaatilist vähenemist, millega kaasnes OS-i tõus, tasemeni, mis sarnanes varem uuringus täheldatuga, mis registreeris ka NAC-vahendatud mõju rakkude elujõulisusele, rakusurmale ja glutatiooni sisaldusele [43]. . Siin esitatud tulemused näitavad, et NAC vähendas ka superoksiidi radikaalide moodustumist põhitasemeni (st tasemeni DMSO-ga töödeldud kontrollides). CK ribosiide testiti aktiivsetes kontsentratsioonides (0,1–1 uM) koos K3G-ga ja need vähendasid märkimisväärselt rakkude superoksiidi radikaalide sisaldust järgmistele tasemetele (võrreldes ainult SAL-iga töödeldud rakkudega): cZR 80,34 ± 5,99 protsenti 0,1 uM juures. ; K3G 77,1 ± 4,89 protsenti 10 uM juures; iPR 79,2 ± 5,91 protsenti 1 uM juures, mis on võrreldav 100 uM NAC mõjuga. Kokkuvõttes näitavad ortogonaalsed demonstratsioonid tugevalt, et tugev OS-i vastane aktiivsus mängib SAL-i indutseeritud PD mudelis NAC-i ja CK-de kaitsva toime võtmerolli. Korrelatsiooni operatsioonisüsteemi paranemise ja neuroprotektsiooni vahel on täheldanud ka teised autorid [29] ning mitmed uuringud on leidnud, et K ja BAP võivad otseselt parandada operatsioonisüsteemi aktiivsust [44], moodustades Cu2 pluss ioonidega komplekse, mille tulemuseks on superoksiidi dismutaas. nagu tegevus [45,46]. Siiski on CK-sid kirjeldatud ka kaudsete antioksüdantidena, mille mõju vahendab tuumafaktori erütroidi 2-seotud faktori 2 (NRF2) antioksüdantide vastuseraja (iPR) [22] esilekutsumine või glutatioonperoksidaasi ja SOD aktiivsuse osaline taastamine ( K) [16]. Lisaks on K-l väidetavaltneuroprotektiivneSH-SY5Y rakkudes H2O2 poolt indutseeritud operatsioonisüsteemi kahjustuste vastu [17]. Mõlemat tüüpi CK-de teatatud ROS-i vastane toime võib potentsiaalselt seletada cZR, K3G ja iPR mõju superoksiidi radikaalide vähenemisele SAL-indutseeritud SH-SY5Y raku PD mudelis [47–50].

Joonis 3. (A) Mikrofotod, mis näitavad SAL-i põhjustatud oksüdatiivset stressi ja oksüdatiivset stressi vähendavat toimettsütokiniinidinimeses diferentseeritudneuronSH-SY5Y rakud, mis on visualiseeritud fluorestsentsmikroskoopiaga pärast dihüdroetiidiumi (DHE) märgistamist. Baarid=50 um. Piltidel on rakud, mida on töödeldud DMSO lahusega (kontrollid), ainult 500 uM salsolinooliga (SAL) ning 500 uM SAL ja 1000 uM NAC (pluss NAC), 0,1 uM cZR (pluss cZR) kombinatsioonidega; 10 uM K3G (pluss K3G), 1 uM iPR (pluss iPR) 24 tundi enne DHE-ga värvimist. (B) SAL-indutseeritud superoksiidi radikaalide moodustumine jatsütokiniinvõi N-atsetüültsüsteiini (NAC) kaitsev toime. Graafik näitab DHE-värvitud rakkude kvantifitseerimist, kasutades mikroplaadilugejat Infinite M200 Pro (Tecan, Austria). Kolmekordistub vähemalt viie sõltumatu päeva jooksul. * P võrreldes sõidukiga, mille SAL on 500 uM, # P võrreldes sõidukiga, millel puudub 500 uM SAL.