Osa 1: Proteinaarne krooniline neeruhaigus on seotud punaste vereliblede eluea, deformeerumise ja ainevahetusega

Kontakt: emily.li@wecistanche.com

Rosi Bissinger jt

¹Endokrinoloogia, Diabetoloogia ja Nefroloogia osakond, sisehaiguste osakond, Tübingeni ülikooli haigla, Tübingen, Saksamaa;²Biokeemia ja molekulaargeneetika osakond, Colorado ülikooli Anschutzi meditsiinilinnak, Aurora, Colorado, USA;³Hematoloogia osakond, Colorado ülikool Denver, Aurora, Colorado, USA;⁴Molekulaarse ja rakulise spordimeditsiini instituut, Kölni Saksa Spordiülikool, Köln, Saksamaa;⁵Müncheni Helmholtzi keskuse diabeediuuringute ja metaboolsete haiguste instituut (IDM) Tübingeni ülikoolis, Tübingenis, Saksamaal;⁶Saksamaa diabeediuuringute keskus (DZD) Tübingeni ülikoolis, Tübingen, Saksamaa;⁷Kliinilise transfusioonimeditsiini keskus, Tübingeni ülikooli haigla, Tübingen, Saksamaa;⁸Patoloogia osakond, Eberhard Karls University Tübingen, Tübingen, Saksamaa;⁹Dermatoloogia osakond, Eberhard Karls University Tübingen, Tübingen, Saksamaa;¹⁰Oslo Ülikooli hambaarstiteaduskonna suubioloogia instituut, Oslo, Norra;¹¹Meditsiini osakond, Hamburg-Eppendorfi ülikooli meditsiinikeskus, Hamburg, Saksamaa; ja¹²Terviseteaduste teaduskond, Ontario Tehnikaülikool, Oshawa, Ontario, Kanada

Aneemia on tavaline tüsistuskrooniline neeruhaigus, mis mõjutab patsientide elukvaliteeti. Erinevate tegurite hulgas, nagu raua ja erütropoetiini puudulikkus, on punaste vereliblede (RBC) eluea lühenemine seotud aneemia patogeneesiga. Kuid mehaanilised andmed in vivo RBC düsfunktsiooni kohta aastalneeruhaiguson puudulikud. Siin kirjeldame kroonilise neeruhaigusega seotud aneemia teket proteinuurse neeruhaigusega hiirtel, mis on tingitud kas doksorubitsiini manustamisest või indutseeritavast podotsiini puudulikkusest. Mõlemas katsemudelis ilmnes aneemia 10. päeval ja progresseerus 30. päeval, vaatamata tsirkuleeriva erütropoetiini taseme tõusule ja erütropoeesile luuüdis ja põrnas.

Mõlemas hiiremudelis ringlevad RBC-d näitasid muutunud morfoloogiat ja vähenenud osmootselt tundlikku deformeeritavust koos suurenenud fosfatidüülseriini välise plasmamembraaniga, mis on RBC surma tunnus. RBC-de fluorestsentsmärgistamine doksorubitsiini indutseeritud hiirte 20. päevalneeruhaigusnäitas enneaegset vabanemist vereringest. Mõlema hiiremudeli RBC-de metaboolsed analüüsid näitasid ajalisi muutusi redoks-ringlussevõtu radades ja Landsi tsüklis, membraani lipiidide ümberkujundamise protsessis. Aneemilised proteinuuriaga patsiendidneeruhaigusoli suurenenud tsirkuleerivate fosfatidüülseriini suhtes positiivsete punaste vereliblede osakaal.

Seega näitavad meie tähelepanekud, et punaste vereliblede eluea vähenemine, mida vahendab muutunud RBC metabolism, vähenenud erütrotsüütide deformeeritavus ja suurenenud rakusurm, aitavad kaasa aneemia tekkele proteinuuris.neeruhaigus.

Kidney International (2021) 100, 1227–1239; https://doi.org/10.1016/ j.kint.2021.08.024

MÄRKSÕNAD:Cistanche, Cistanche eelised,neeruhaigus, neerupuudulikkus, krooniline neeruhaigus, aneemia, rakusurm; deformeeritavus, Landsi tsükkel; ainevahetus; proteinuuria; punased verelibled; redoks-ringlussevõtt

Autoriõigus ª 2021, International Society of Nephrology. Väljaandja Elsevier Inc. See on avatud juurdepääsuga artikkel CC BY-NC-ND litsentsi alusel

Cistanche eelised neerufunktsioon.

Tõlkeavaldus

See uuring näitab, et proteinuurilineneeruhaigushiiremudelites põhjustab punaste vereliblede (RBC) enneaegse kliirensi, põhjustades lõpuks aneemia arengut. RBC-de suremus suureneb ka patsientidel, kellel onkrooniline neeruhaigusja aneemia. Erütrotsüütide düsfunktsioon ureemilises keskkonnas on oluline mehhanism erütrotsüütide kadumiseks ja neeruhaigustega seotud aneemia tekkeks, olenemata endogeense erütropoetiini sekretsioonist.

Aneemia tekkimine on arenenud tüüpiline tüsistuskrooniline neeruhaigus(CKD) ja on seotud elukvaliteedi halvenemisega1 ja suurenenud kardiovaskulaarsete sündmuste riskiga²ja haiglaravi,³samuti kognitiivne langus.4 Aneemia raskusastet on peetud sõltumatuks suremuse ennustajaks nii dialüüsi saavatel kui ka dialüüsist mittesõltuvatel kroonilise neeruhaigusega patsientidel.⁵ Neeruhaigusega seotud aneemia patofüsioloogia on keeruline ja hõlmab raua ja erütropoetiini (EPO) puudulikkust madala astme põletiku taustal, mis omakorda kahjustab kroonilise neeruhaigusega patsientide normaalset erütropoeesi.6 Kaugelearenenud kroonilise neeruhaiguse korral on EPO vastus ebapiisav. madal võrreldes aneemia astmega.^7,8Samaaegse rauapuuduse kõrge esinemissagedus kroonilise neeruhaiguse korral on raua homöostaasi häire tagajärg.⁹ Kroonilise neeruhaiguse rauakaotuse üks tähelepanuta jäetud mehhanism on proteinuuria, mis võib põhjustada transferriiniga seotud raua kadu uriiniga (kuni 0,3 mg/päevas), kui proteinuuria jõuab nefrootilise vahemikuni.¹⁰

Another factor that is thought to contribute to anemia in CKD patients is the shortened lifespan of red blood cells (RBCs), first described >60 aastat tagasi.^6,11,12Hiljutine uuring, milles kasutati süsinikmonooksiidi hingamistesti, näitas, et punaste vereliblede eluiga vähenes järk-järgult 120 päevalt 1. staadiumi kroonilise neeruhaigusega patsientidel 60 päevani 5. staadiumi kroonilise neeruhaigusega patsientidel.¹³Nimelt järgnes allogeensete punaste vereliblede ülekandmisele tervetelt doonoritelt kroonilise neeruhaigusega patsientidele transfusiooniga punaste vereliblede kiire kliirens ilma hemolüüsita.¹²Selle vaatluse usutavaks mehhanismiks võib olla apoptoosilaadse rakusurma stimuleerimine nukleaarsetes RBC-des, mis tähistab vigastusmustrit, mille puhul rakumembraani terviklikkus ei ole kahjustatud ja tsütoplasma sisaldus jääb puutumatuks.¹⁴Rakusurma läbivatel RBC-del ilmnevad mitmesugused morfoloogilised muutused, mis tulenevad tsütoskeleti kahjustusest, nagu pinnamullide moodustumine, membraani elastsuse kaotus ja/või raku dehüdratsioon.¹⁵Molekulaarsel tasandil seostatakse erütrotsüütide surma intratsellulaarse Ca2 akumulatsiooni, muutunud raku energiaseisundi ja fosfolipiidide asümmeetria lagunemisega, mis lõpuks viib fosfatidüülseriini (PS) välisele plasmamembraanile.^15,16Selle tulemusena tunnevad makrofaagid ja spetsialiseeritud dendriitrakud kiiresti ära PS-i välistatud RBC-d, mis põhjustab erütrofagotsütoosi ja nende katabolismi põrnas ja maksas.¹⁷

Inimeste neeruhaigustega seotud aneemia segava patofüsioloogia tõttu on loomkatsed õigustatud, et selgitada välja mehhanismid. Doksorubitsiini poolt indutseeritud nefropaatia (DIN) 129S1/SvImJ hiirtel18 ja indutseeritava podotsiini puudulikkusega hiirtel (Nphs2Dipod)¹⁹on 2 mudelit, mida iseloomustab nefrootilise ulatuse proteinuuria esilekutsumine päevade jooksul, progresseerumineneerupuudulikkus3 nädala pärast ja surm 6-7 nädala pärast.^19–21Mõlemad hiiremudelid võtavad tõhusalt kokku inimese kroonilise neeruhaiguse kõik etapid. Käesolevas uuringus testisime, kas see on progressiivneneerupuudulikkusnendel hiirtel proteinuuriaganeeruhaigusmõjutab erütrotsüütide eluiga ja aitab kaasa aneemia tekkele. Paralleelselt uurisime RBC fenotüüpi nefrootilise ulatusega proteinuuriaga kroonilise neeruhaigusega patsientidelt võetud veres.

Cistanche ravib kroonilist neeruhaigust ja kaitseb neere

MEETODID

Üksikasjalik teave materjalide ja meetodite kohta on esitatud lisamaterjalides ja -meetodites.

Hiireuuringud

Katsed viidi läbi 8-nädala vanuste metsiktüüpi 129S1/SvImJ mõlemast soost hiirtega (Charles River). DIN indutseeriti doksorubitsiini ühe süstiga (14, 5 mg / g kehamassi kohta), nagu eelnevalt kirjeldatud.^18,22Doksorubitsiini müelotoksilise toime kontrollimiseks, mis ei olnud seotud nefropaatia tekkega, allutati ka doksorubitsiiniresistentsetele C57BL/6 hiirtele sama raviprotokoll.23 Lisaks viidi sarnased katsed läbi 8-nädala vanuste hiirtega, kellel oli podotsiini (B6-Nphs2tm3.1Antc*Tg [Nphs1-rtTA*3G]8Jhm*Tg[tetO-cre]1Jaw) või Nphs2Dipodi hiirte indutseeritav deletsioon, keda töödeldi doksütsükliiniga 14 päeva.¹⁹Kõik loomkatsed viidi läbi vastavalt riiklike tervishoiuinstituutide laboriloomade hooldamise ja kasutamise juhendile ning Saksamaa loomade heaolu seadusele ning kohalike ametiasutuste heakskiidul (Regierungspräsidium Tübingen, loanumbrid M12/17 ja M17/19G). ).

Hiire uuringute eksperimentaalne ülesehitus on esitatud lisajoonisel S1.

Patsiendid

Patsiendiuuring viidi läbi kooskõlas Helsingi deklaratsiooniga ja selle kiitis heaks Tübingeni ülikooli haigla kohalik eetikakomitee (556/2018BO2). Liitium-hepariini vere- ja uriiniproovid võeti ülikooli nefrootilise ulatusega proteinuuria ja säilinud glomerulaarfiltratsiooni sagedusega (GFR; staadiumid 1–2; n 10) ja vähenenud GFR-iga (CKD staadium 3–5; n 15) patsientidelt. Tübingeni haigla. Kontrollrühmana andis Tübingeni ülikooli kliinikumi verepank vanuse ja sooga sobivate tervete vabatahtlike (n 25) verd. Kõik inimproovid koguti pärast teadlikku nõusolekut. Patsientide kliinilised omadused on toodud tabelis 1.

Voolutsütomeetria analüüsid

RBC rakkude surma erinevad parameetrid määrati voolutsütomeetria abil.¹⁴ Punaste vereliblede eluea määramiseks in vivo süstiti retrovedelikku 25 ml 5,6-karboksüfluorestseiindiatsetaadi suktsiinimidüülestri [5(6)-CFDA, SE] värvainet kontsentratsioonis 9,96 mM (lahustunud dimetüülsulfoksiidis). - metsikut tüüpi 129S1 / SvImJ ja doksorubitsiini süstitud hiirte orbitaalne põimik, nagu eelnevalt kirjeldatud.²⁴ Näidatud ajahetkedel võeti hiirte retro-orbitaalsest põimikust verd ja voolutsütomeetria analüüsiga tuvastati 5(6)-CFDA, SEþ rakkude protsent. Lõpuks analüüsiti andmeid FlowJo tarkvara (FlowJo LLC) abil.

RBC deformeeritavus ja osmootse gradiendi ektatsütomeetria RBC deformeeritavust mõõdeti laser-assisteeritud optilise pöörleva raku analüsaatori (LORCA MaxSis; RR Mechatronics) abil, mida on üksikasjalikult kirjeldatud mujal.²⁵ Osmootse gradiendi ektatsütomeetria (osmoskaani) analüüsid viidi läbi ka LORCA MaxSis abil ja mõõdeti deformeeritavust erinevates osmootsetes tingimustes.²⁶

Histoloogiline uuring

Hematoksüliini ja eosiini värvimiseks värviti põrnad ja reieluud hematoksüliini ja eosiiniga. Kõik slaidid värviti primaarse antikehaga Ter 119 (BD Pharmingen; lahjendus 1:500). Perioodilise happe-Schiffi värvimiseks värviti 25- mm paksused neeruviilud perioodilise happe-Schiffi reagendiga (Carl Roth) ja hematoksüliiniga (abcam). RBC kuju muutuste määramiseks viidi läbi May-Grünwald-Giemsa värvimine (Pappenheimi meetod), nagu eelnevalt kirjeldatud.²⁷ Glomeruli eraldamine viidi läbi biotinüülimise lähenemisviisi ja rakkude sorteerimise abil.¹⁹ Podotsiini valgu tuvastamiseks kasutati Sigma antikeha (P0372).¹⁹ Tuumade värvimiseks kasutati Roti-Mount Fluor Care 40,6-diamidino-2-fenüülindooli (DAPI; Carl Roth).

Hiire punaste vereliblede ülikõrge jõudlusega vedelikkromatograafia-massispektromeetria metaboloomika

Analüüsid viidi läbi nagu varem avaldatud.²⁸ Lühidalt öeldes kasutab analüütiline platvorm Vanquishi ülikõrge jõudlusega vedelikkromatograafiasüsteemi (Thermo Fisher Scientific), mis on võrgus ühendatud Q Exactive massispektromeetriga (Thermo Fisher Scientific).

Statistilised analüüsid

Andmed esitatakse aritmeetiliste keskmiste SEM-i või mediaanidena interkvartiilide vahemikuga (25.–75. protsentiil), kus n tähistab vastavalt kasutatud loomade või kaasatud patsientide arvu. Andmete normaalsust testiti Kolmogorov-Smirnovi testi, D'Ag-ostino testi ja Shapiro-Wilki testiga. Dispersioone analüüsiti Bartletti testiga võrdsete dispersioonide jaoks. Tukey või Dunni mitme võrdluse järeltest, sidumata Student t test või Mann-Whitney U test viidi läbi GraphPad Prism 8 (GraphPad Software) abil. P < 0,05="" 2-suunatud="" testimisega="" peeti="" statistiliselt="" oluliseks.="" täiendavad="" graafikud="" joonistati="" läbi="" graphpad="" prism="">

TULEMUSED

Eksperimentaalne proteinuuriline neeruhaigus kutsub hiirtel esile aneemia

Pärast induktsiooni tekkis 129S1 / SvImJ hiirtel DIN ja Nphs2Dipod hiirtel nefrootilise ulatuse proteinuuria (joonis 1a ja täiendav joonis S2C) ja progresseeruv.neerupuudulikkusmida iseloomustab kõrge plasma uurea tase alates 20. päevast (joonis 1b ja täiendav joonis S2D). Esimese 10 päeva jooksul kogesid hiirtel kehakaalu suurenemist astsiidiga (joonis 1c ja täiendav joonis S2E), mis peegeldab seriinproteaaside või proteasuuria eritumisest põhjustatud naatriumipeetust.¹⁸ Pärast naatriumipeetuse spontaanset pöördumist kaotasid need hiired pidevalt kaalu. DIN-ga hiirtel ja Nphs2Dipodi hiirtel näitasid 10 päeva pärast jäädvustatud valgusmikroskoopilised kujutised tüüpilisi histomorfoloogilisi muutusi, mis on kooskõlas fokaalse segmentaalse glomerulaarskleroosiga (joonis 1d ja täiendav joonis S2B). Need puudusid doksorubitsiini süstitud C57BL / 6 hiirtel (joonis 1d). Doksorubitsiinravi kutsus 129S1/SvImJ ja C57BL/6 hiirtel esile hemoglobiini, erütrotsüütide arvu ja hematokriti (joonis 1e–g) tugeva languse alates 10. päevast, mis viimastel normaliseerusid 20. ja 30. päeval. 20. ja 30. päeval tekkis doksorubitsiini süstitud 129S1/SvImJ ja podotsiini puudulikkusega hiirtel progresseeruv aneemia, mida iseloomustab vähenenud keskmine korpuskulaarne maht (joonis 1h) ja vähenenud hemoglobiin (täiendav joonis S2F), mis viitab sellele, et aneemia on seotud progresseeruvaga.neerupuudulikkusja mitte doksorubitsiinraviga iseenesest.

Eksperimentaalse proteinuurilise neeruhaiguse aneemia ei ole põhjustatud kahjustatud erütropoeesist

Mõlemad aneemilised hiiremudelid näitasid tsirkuleerivate retikulotsüütide protsendi olulist suurenemist (joonis 2a ja täiendav joonis S3C). Plasma EPO kontsentratsioonid suurenesid 10. päeval järsult 129S1/SvImJ-s DIN-iga ja tervetel C57BL/6 hiirtel, kuid normaliseerusid uuesti päevadel 20 ja 30 (joonis 2b). Podotsiini puudulikkusega hiirtel tõusid plasma EPO kontsentratsioonid 10. päeval ja püsisid 20. ja 30. päeval tõusnud (täiendav joonis S2H). Luuüdi ja põrna histoloogilistes analüüsides suurenes erütroidi prekursorrakkude arv võrreldes müeloidsete prekursoritega 30. päeval (joonis 2d – g), mis viitab stimuleeritud erütropoeesile DIN-iga aneemilistel 129S1 / SvImJ hiirtel.

RBC eluea lühenemine on eksperimentaalse proteinuurse neeruhaiguse aneemia peamine põhjus

PS-i eksternaliseerimine RBC plasmamembraani välimisel lehel on rakusurma indikaator ja erütrofagotsütoosi promootor.14 RBC rakusurma kvantifitseeriti, kasutades fluorestseeruva anneksiin V-ga seotud pinna-PS fluorestsents-aktiveeritud rakusorteerimise analüüse.¹⁴ In freshly drawn blood, the percentage of PS-exposing cells was >{{0}} korda kõrgem 2. päeval0 DIN-iga hiirtel (4,16 protsenti T 0.86 protsenti ) võrreldes tervete hiirtega (1.{{7} }} protsenti 0,11 protsenti ) (joonis 3a). Sarnaselt näitasid Nphs2Dipodi hiirtel 30. päeval PS-i ekspositsioon ligikaudu 2- korda (1,27 protsenti T 0,20 protsenti) võrreldes tervete hiirtega (0,58 protsenti 0,05 protsenti) (täiendav joonis S3A). On teada, et RBC-d eemaldatakse vereringest põrnas asuvate makrofaagide poolt.¹⁷ Seetõttu võib see tähelepanek selgitada Nphs2Dipodi hiirte suuremat põrna ja kehamassi suhet (täiendav joonis S2G), kus tervete C57BL/6 hiirtega võrreldes laguneb kaks korda rohkem RBC-sid.

Kuna nefrootilise ulatuse proteinuuria põhjustab düsproteineemiat,²⁹ Lisaks uurisime, kas DIN-iga hiirte plasmas sisalduv komponent võib stimuleerida RBC-rakkude suurenenud surma. Nagu on kujutatud joonisel 3b, oli PS ekspositsioon päeval 10 ja 20 kaks korda kõrgem pärast tervete punaste vereliblede inkubeerimist (30 minutit temperatuuril 37 °C) doksorubitsiini süstitud 129S1/SvImJ hiirte plasmas võrreldes tervete hiirte plasmas inkubeerimisega. Ca2 sissevool RBC-desse, mida vahendavad pingest sõltuvad ja pingest sõltumatud mitteselektiivsed katioonikanalid, 30, 31 on RBC rakusurma üks peamisi regulaatoreid. DIN-iga 129S1/SvImJ hiirtelt 20. ja 30. päeval kogutud erütrotsüütides suurenesid rakusisesed Ca2þ kontsentratsioonid (joonis 3c); see

nähtus võeti uuesti kokku Nphs2Dipodi hiirtel päeval 20 (täiendav joonis S3B).

Mõlemas hiiremudelis oli PS-positiivsete punaste vereliblede protsendi vahel märkimisväärne negatiivne korrelatsioon aneemia raskusega, mida peegeldas hemoglobiini tase (joonis 3d ja täiendav joonis S3D). Lisaks ilmnes märkimisväärne korrelatsioon neerukahjustusega, mida peegeldas plasma uurea kontsentratsioon (joonis 3e ja täiendav joonis S3E) ja vähemal määral proteinuuriaga (joonis 3f ja täiendav joonis S3F). Aneemia erütrotsüütide kaotuse kompenseerimiseks stimuleeriti mõlemal hiirel uute RBC-de moodustumist, nagu näitas ringlevate retikulotsüütide suurenenud protsent, ja see oli märkimisväärselt korrelatsioonis PS-i eksponeerivate RBC-de suurusega (joonis 3g ja täiendav joonis S3G).

^{KlõpsakeSIIN2. osa jaoks.}