1. osa: Dopamiinergiliste neuronite tuvastamine, mis võivad luua assotsiatiivse mälu ja järsult lõpetada selle käitumusliku väljenduse
Mar 19, 2022
Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Michael Schleyer, 1* Alice Weiglein, 1 Juliane Thoener, 1 Martin Strauch, 2 Volker Hartenstein, 3
Melisa Kantar Weigelt, 1 Sarah Schuller, 1 Timo Saumweber, 1 Katharina Eichler, 4, 5, 6 Astrid Rohwedder, 4, 7 Dorit Merhof, 2 Marta Zlatic, 5, 7 Andreas S. Thum, 4, 8 ja Bertram Gerber 1, 9 ,10*
1Leibnizi Neurobioloogia Instituudi õppegeneetika osakond jaMälu, 39118 Magdeburg, Saksamaa, 2RWTH Aacheni ülikooli pildi- ja arvutinägemise instituut, 52056 Aachen, Saksamaa, 3 California ülikooli molekulaar-, raku- ja arengubioloogia osakond, Los Angeles, California 90095-1606, 4Konstanzi ülikool, instituut bioloogia, 78464 Konstanz, Saksamaa, 5HHMI Janelia teaduslinnak, Ashburn, Virginia 20147, 6 Puerto Rico ülikooli meditsiiniteaduste ülikooli neurobioloogia instituut, Old San Juan, Puerto Rico 00901, 7 zooloogia osakond, Cambridge'i ülikool, CB, Cambridge {12}}EJ, Ühendkuningriik, 8Leipzigi ülikool, Bioloogiainstituut, 04103 Leipzig, Saksamaa, 9Käitumuslike ajuteaduste keskus, 39108 Magdeburg, Saksamaa ja 10 bioloogiainstituut, Otto von Guericke University Magdeburg, 39106 Magdeburg, Saksamaa
Kõigi loomade jaoks on oluline adaptiivne üleminek elutähtsate ressursside otsimisel keskkonna uurimiselt nende ressursside kasutamisele, kui otsing oli edukas. Siin uurime neuronaalset vooluringi, mis võimaldab mõlemast soost Drosophila melanogasteri vastsetel läbi rääkida selle uurimise ja ekspluateerimise ülemineku üle. Teeme seda, ühendades Pavlovi konditsioneerimise kõrge eraldusvõimega käitumise jälgimise, individuaalselt tuvastatud neuronite optogeneetilise manipuleerimise ja sünaptilise organisatsiooni EM-andmepõhise analüüsiga. Leiame, et dopamiinergilise neuroni DAN-i1 optogeneetiline aktiveerimine võib tuvastada mõlemadmälukoolituse ajal ja lõpetage õpitud otsimiskäitumine järgnevas tagasikutsumistestis. Selle aktiveerimine jätab aga kaasasündinud käitumise muutumatuks. Täpsemalt võib DAN-i1 aktiveerimine luua assotsiatiivseid mälestusi vastupidise valentsiga pärast paaris ja paaritu lõhnaga treenimist ning selle aktiveerimine tagasikutsumise testi ajal võib lõpetada mõlemast mälust tuleneva otsingukäitumise. Meie tulemused viitavad veel sellele, et oma käitumusliku tähtsusega DAN-i1 aktiveerimine sarnaneb, kuid ei võrdu suhkru tasuga. Kõigi DAN-i1 ja selle kahe peamise sihtmärgi, Kenyoni rakkude ja seenekeha väljundneuroni MBON-i1 vaheliste sünaptiliste ühenduste dendrogrammi analüüsid viitavad lisaks sellele, et DAN-i1 signaale treeningu ja tagasikutsumise testi ajal saab edastada vastavalt Kenyoni rakkudele ja MBON-i1-le varem tundmatute lokaalselt piiratud hargnevate struktuuride sees. See annaks elegantse vooluringi motiivi, mis lõpetaks otsingu pärast selle edukat lõpetamist.
Märksõnad: dopamiin; uurimine-ekspluateerimine; seene keha; optogeneetika; tugevdamine; otsing
Olulisuse avaldus
Olelusvõitluses peavad loomad toidu otsimisel oma keskkonda uurima. Kui toit on leitud, on aga kohanemisvõimeline eelistada selle ärakasutamist otsingu jätkamisele, mis oleks nüüd sama mõttetu kui kantavate prillide otsimine. See uurimise ja kasutamise kompromiss on oluline loomade ja inimeste ning tehniliste otsinguseadmete jaoks. Uurime, millised ainsast äädikakärbse vastse 10 neuronist suudavad selles kompromissis tasakaalu kallutada, ja tuvastame ühe dopamiini neuroni nimega DAN-i1, mis suudab seda teha. Arvestades dopamiini neuronite funktsiooni sarnasusi kogu loomakuninga vahel,
dom, võib see kajastada üldist põhimõtet, kuidas otsing lõpetatakse, kui see õnnestub.
Sissejuhatus
Oma keskkonda uuriv loom võib toiduotsingu suunamiseks kasutada varasemaid kogemusi. Toidu leidmisel on aga kohanemisvõimeline otsing lõpetada ja selle asemel toiduallikat ära kasutada. Siin uurime ahelaid, mis võimaldavad vastsel Drosophila melanogaster selle uurimise ja kasutamise ülemineku läbirääkimistel. Vastse aju numbriline lihtsus koos rakuspetsiifilise transgeeni ekspressiooni ja teadmisega selle sünaptilisest ühenduvusest (Pfeiffer et al., 2010; Li et al., 2014; Eichler et al., 2017; Saumweber et al., 2018; Eschbach et al., 2020), võimaldab seda uurida individuaalselt tuvastatud neuronite tasemel.
D. melanogasteri vastsed seostavad lõhnu kergesti toidutasuga (Scherer jt, 2003; Gerber ja Hendel, 2006; Schipanski jt, 2008; Rohwedder jt, 2012; Apostolopoulou jt, 2014; Kudow et al. , 2017, 2019). Kriitiline on see, et nendel lõhna-toidu seostel põhinev õpitud käitumine lakkab, kui tagasikutsumise testi ajal on tasu olemas (joonis 1A). Õpitud käitumist võib seetõttu vaadelda kui otsingut, mille kohanduvalt lõpetab soovitud tulemus (st tasu) (Schleyer et al., 2011, 2013, 2015a). Kaasasündinud haistmiskäitumine ei ole samuti mõjutatud (joonis 1B), mis viitab sellele, et selline kaasasündinud käitumine on korraldatud refleksitaoliselt (Schleyer et al., 2011, 2013, 2015a, b). Seega võivad loomulikud hüved esile kutsuda kaks mõju: koolituse ajal annavad nad tasu signaali, mida saab seostada vihjetega, mis hiljem preemiaotsingut suunavad; ja tagasikutsumise testi ajal saavad nad selle õpitud otsingu ägedalt lõpetada, vältides loomade leidmist ressursist eemale triivimast. See üleminek peegeldab seega muutust tasu saamise strateegias, mitte motivatsiooni muutust (st mitte huvi kaotust tasu vastu).
Nii selgrootute kui ka selgrootute puhul annavad dopamiinergilised neuronid (DAN) assotsiatiivse õppimise jaoks tugevdavaid signaale (Waddell, 2013; Schultz, 2015; Kaun ja Rothenfluh, 2017). D. melanogasteri puhul annavad erinevad DAN-ide komplektid vastavalt isuäratavat ja aversiivset tugevdamist (vastsed: Schroll et al., 2006; Rohwedder jt, 2016; Saumweber et al., 2018; Eschbach et al., 2020; täiskasvanud kärbsed: Schwaerzel jt, 2003; Claridge-Chang jt, 2009; Liu jt, 2012) (sarnane stsenaarium võib olla ka tärkavate selgrootute puhul: Lammel et al., 2012; Groessl jt, 2018; Menegas et al. al., 2018). Sektsioonilise struktuuri loomisel ristuvad need DAN-id Kenyoni rakkude (KC) paralleelsete kiududega, putukate kõrgeima järgu haistmiskeskuse, mida nimetatakse seenekehaks, sisemiste neuronite vahel. Austades seda sama sektsioonilist struktuuri, koguvad seene keha väljundneuronid (MBON) teavet KC-de kaudu ja saadavad selle eferentse vooluringi suunas (vt joonised 2A–D) (vastsed: Selcho et al., 2009; Pauls et al., 2010 Eichler jt, 2017; Saumweber et al., 2018; Eschbach jt, 2020; täiskasvanud: Sejourne jt, 2011; Places jt, 2013; Aso jt, 2014a,b; Oswald ja Waddell , 2015; Takemura et al., 2017). Nimelt näitas hiljutine elektronmikroskoobi rekonstrueerimine, et DAN-idel on kaks peamist sihtmärki: KC-d ja MBON-id (vt joonis 2B) (vastsed: Eichler et al., 2017; täiskasvanud: Takemura jt, 2017).
Vastse D. melanogaster puhul võib pPAM-klastri DAN-ide aktiveerimine avaldada treeningu ajal rahuldust (Rohwedder et al., 2016). Selle klastri neljast päevast võivad kaks üksikult anda sellise rahuldust pakkuva efekti (DAN-h1 ja DAN-i1) (Saumweber et al., 2018). Siin otsustasime keskenduda
Joonis 1. Suhkur võib anda tasu ja otsingu lõpetamise signaale. Vastseid õpetati nii, et lõhn oli suhkruga paaris või paarita. Järgmises tagasikutsumise testis analüüsiti nende lõhnaeelistust kas suhkru puudumisel või selle juuresolekul (joonis ülaosa poole). Testimine suhkru puudumisel näitas assotsiatiivset haistmistmälu, kvantifitseeritud positiivse PI-na. Selle käitumuslik väljendusmälulõpetati suhkru juuresolekul. Seega võib suhkur anda kahte tüüpi signaale: koolituse ajal annab see lõhnaga seostatava tunnustussignaali, et juhendada loomi hiljem preemiaotsingutel; ja tagasikutsumise testi ajal annab suhkur kui otsitav tasu signaali selle õpitud otsingu lõpetamiseks. Näidiste suurused: N=29, N =28. B, vastseid testiti kaasasündinud lõhnaeelistuse suhtes kas suhkru puudumisel või juuresolekul (joonis ülaosa poole). Suhkur ei mõjutanud kaasasündinud haistmiskäitumist, mis viitab selle refleksitaolisele korraldusele. Näidiste suurused: iga N=20. Erinevad tähed kastigraafikute kohal näitavad paaripõhist olulisust (Mann-Whitney U test, p, 0.05, parandatud vastavalt Bonferroni-Holmile). *Olulisus nullist (ühe valimi märgi test, p, 0,05, korrigeeritud Bonferroni-Holmi järgi). ns, ei ole oluline. Kõik statistilised testid ja nende tulemused on koos lähteandmetega esitatud laiendatud andmete joonisel 1-1. Selle katse PI-skooride aluseks olevate lõhnaeelistuste väärtuste kohta vaadake joonist 9A.
Joonis 2. DAN-KC-MBON maatriksi skeem. Mediaalne lobe chiasm. Lõhnateavet töödeldakse nii loomupärase lähenemise esilekutsumiseks kui ka seenekeha KC-de tupplehe piirkonna suunas (lilla; kuvatakse täielikult, üks näide KC paremal küljel). Maitsetasu teavet töödeldakse samuti kaasasündinud käitumise suunamiseks, samuti peamiselt aminergiliste moduleerivate neuronite kaudu (kuvatakse DAN-i1, türkiissinine / must) seene kehasagarate üksikute sektsioonide suunas (vasakul küljel on sektsioonid näidatud). Kõik mediaalsagara (hk) neljast sektsioonist saavad sisendi ühest DAN-ist, mis innerveerib ka sama sektsiooni kontralateraalses poolkeras. Mediaalse sagara MBON-id pärinevad üksikutest sektsioonidest, tavaliselt mõlemast poolkerast (kuvatakse MBON-i1, magenta/kollane) ja edastavad oma väljundi poolkera lõhe ulatuses erinevates konfiguratsioonides. Kollektiivselt vastutavad MBON-idmälu-põhine otsingukäitumine. Andmed põhinevad Eichleri jt. (2017) ja Saumweber et al. (2018). B, DAN-KC-MBON maatriks i-kambris. DAN-i1 ja enamik KC-sid loovad vastastikused keemilised sünapsid ning nii DAN-i1 kui ka KC annavad väljundi MBON-i1-le. Lihtsuse huvides on üksikasjalikult näidatud ainult vasakpoolsete DAN-i1 ja MBON-i1 neuronitega sünapsid. Sama ühenduvus on enamikus, kui mitte kõigis teistes sektsioonides (Eichler et al., 2017; Saumweber et al., 2018). C, DAN-i1 (türkiissinine) saab sisendi väljastpoolt seenekeha (tumehall), mis on ipsilateraalne selle rakukehaga (piirkond märgistatud 1) ja seejärel innerveerib i-sektsiooni mõlemas poolkeras (märgistatud 2 ja 3). MBON-i1 (magenta) ületab keskjoone kaks korda; see saab sisendit mõlema poolkera i-kambris ja annab väljundi mõlema poolkera seenekehaga külgnevates piirkondades. D, sama mis C-s, kuid veidi kallutatud vaates, mis näitab vasakpoolsete DAN-i1 ja MBON-i1 neuronite skeleti rekonstruktsioone ja ühte näidet KC (must). Andmed põhinevad Eichleri jt. (2017). E, vasaku DAN-i1 neuroni dendrogramm. Värvilised punktid tähistavad DAN-i1 väljundi sünapse. Kolmnurgad tähistavad DAN-i1 sisendsünapsi. Värvid tähistavad vastava sünapsi partnerneuronit. Kõik muud sünapsid seene kehas on märgistatud "Muu". Ei kuvata sünapsid, mida DAN-i1 moodustab neuronitega väljaspool seene keha, eriti piirkonnas 1 (Eschbach et al., 2020). Punktilised jooned näitavad piirkondi, kus neuron ületab aju keskjoone. F, sama mis E-s, kuid vasakpoolse MBON-i1 neuroni jaoks. Ei kuvata sünapsid, mille MBON-i1 moodustab seenekehast väljapoole jäävate neuronitega. Mõlema poolkera DAN-i1 ja MBON-i1 neuronite kõrge eraldusvõimega versioonide ning kõigi küpsete KC-de kohta vaadake vastavalt laiendatud andmete jooniseid 2-1, 2-2 ja 2-3 .
DAN-i1-l, kuna seda on varem üksikasjalikumalt analüüsitud (Saumweber et al., 2018) ja kuna see annab tugevama tasuva efekti kui DAN-h1 (Saumweber et al., 2018; avaldamata andmed). Esmalt anname üksikasjaliku ülevaate kõigi sünapside ruumilisest paigutusest DAN-i1 ja selle mõlema peamise väljundpartneri MBON-i1 ja KC-de vahel. Seejärel küsime, kas DAN-i1 optogeneetiline aktiveerimine võib vahendada mitte ainult preemiasignaali treeningu ajal, vaid ka signaali, et akuutselt lõpetada õpitud tasu otsimine tagasikutsumise testi ajal.
cistanche kulturism
Materjalid ja meetodid
Eksperimentaalne mudel ja teema üksikasjad. Läbivalt kasutati mõlemast soost (D. melanogaster) kolmandas järgus toitumisfaasis vastseid, kes olid pärast munemist 5 päeva vanused. Kärbseid hoiti standardsöötmel massikultuuris 25 kraadi juures, suhtelise õhuniiskuse juures 60 protsenti -70 protsenti ja valguse/pimeduse tsüklis 12/12 tundi. Võtsime toiduviaalist lusikatäie toidusöödet, valisime juhuslikult soovitud arvu vastseid, loputasime neid korraks kraanivees ja alustasime katsega.
Kasutasime transgeenseid vastseid, et ekspresseerida ChR2-XXL valgusga seotud ioonikanalit DAN-ides. Selleks ristati efektortüvi UAS-ChR2-XXL (Dawydow et al., 2014) (lahkelt edastas R. Kittel, Leipzigi ülikool) ühega kahest juhitüvest: kas 58E{{6. }}Gal4 (Pfeiffer jt, 2008; Liu et al., 2012; Rohwedder jt, 2016) (Bloomington Stock Center nr 41347) või split-Gal4 draiveritüvi SS00864 (Eichler et al., 2017; Saumweber et al., 2018), et saada topelt-heterosügootseid järglasi. Juht kontrollib, et juhi pinged viidi üle W1118 kohalikule koopiale (Bloomington Stock Center #3605, #5905, #6326). Kuna efektor kontrollib tüve, mis kannab Gal4 (attP2) või split-Gal4 (attP40/attP2) jaoks kasutatud maandumiskohti, kuid millesse pole sisestatud Gal4 domeen ("tühi") (Pfeiffer et al., 2010), ristati tüvega. UAS- ChR2-XXL. Kinnitasime 58E02 ja SS00864 ekspressioonimustri, ristades need pJFRC-10xUAS-IVS-mCD8::GFP-ga (Pfeiffer et al., 2010) (Bloomington Stock Center #32185). Kuna ChR2-XXL on piisavalt tundlik, et seda päevavalguses aktiveerida (pole näidatud), kasvatati kärbseid viaalides, mida tumendas pidevalt must papist ümbris. Joonisel 8E kujutatud katse jaoks ristati UAS-ChR2 (Schroll et al., 2006) 58E02-Gal4-ga.
Eksperimentaalne seadistus. Käitumiskatseteks treeniti vastseid 9 cm siseläbimõõduga Petri tassides ja testiti 9 või 15 cm siseläbimõõduga Petri tassides (mõlemad Sarstedtist), nagu on mainitud joonise legendides, mis olid kõigil juhtudel täidetud 1 protsendilise agaroosiga (elektroforeesi kvaliteet). ; Roth). Nagu lõhn, kasutasime parafiinõlis (AM; CAS: 628-63-7; Merck) 1:20 lahjendatud n-amüülatsetaati ja mõnel juhul lisaks lahjendamata 1-oktanooli (OCT; CAS: {{ 9}}; Merck).
Katsed viidi läbi 43 43 73cm ümbritsevas karbis, mis oli varustatud eritellimusel valmistatud valgustuslauaga, mis sisaldas 24 12 LED-massiivi (470 nm; Solarox) ja 6- mm paksust mattpleksiklaasist difusiooniplaati peal, et tagada ChR2-XXL aktiveerimiseks ühtlane sinine valgus (120mW/cm2). Petri tassid asetati otse difusiooniplaadi peale. Petri tassid olid ümbritsetud polüetüleenist difusioonirõngaga; difusioonirõnga taha paigaldati 30 infrapuna LED-i (850 nm; Solarox), et pakkuda valgustust, mis oli vastsetele nähtamatu, kuid võimaldas salvestada ja jälgida nende käitumist võrguühenduseta analüüsi jaoks. Selleks paigutati Petri tassi kohale infrapuna läbilaskefiltriga varustatud kaamera (Basler acA204090umNIR; Basler). Eksperimentaalse seadistuse kohta lisateabe saamiseks vaadake Saumweber et al. (2018).
cistanche kulturism
Assotsiatiivne lõhna-suhkru õppimine. Õppimiskatsed järgisid kehtestatud protokolle (Michels et al., 2017). Lõhnaanumad valmistati ette, lisades 10 ml lõhnaainet eritellimusel valmistatud teflonmahutitesse (5 mm siseläbimõõt, kaanega, mis oli perforeeritud 7 auguga 0,5 mm läbimõõduga). Petri tassid kaeti aeratsiooni parandamiseks modifitseeritud kaantega, mille keskel oli 15 1 mm läbimõõduga ava.
Lõhna-suhkru koolituse jaoks asetati 20 vastset preemiaks 2 mol/l D-fruktoosi (CAS: 57-48-7; Roth) sisaldava agaroosiga (CAS: 57-48-7; Roth) täidetud Petri tassi keskele (1) ja varustatud kahe lõhnaga. konteinerid vastaskülgedel, mõlemad täidetud AM-ga (AM1). 2,5 minuti pärast viidi vastsed värskele tavalise maitsetu agaroosiga Petri tassile, mis oli varustatud kahe tühja konteineriga (EM), kus nad veetsid samuti 2,5 minutit. Viidi läbi kolm sellist "paaritud" treeningtsüklit, millest igaühel kasutati värskeid Petri tasse. Pooltel juhtudel alustati koolitust tasu sisaldavate Petri tassidega, nagu näidatud (AM1/EM), samas kui teisel poolel juhtudest oli järjestus vastupidine (EM/AM1). Iga AM1/EM-i (või EM/AM1) treenitud vastsete kohordi jaoks koolitati vastastikku teist kohorti, st lõhna ja tasu "paaritute" esitustega (vastavalt AM/EM1 või EM1/AM).
Pärast koolitust viidi vastsed katselise Petri tassi keskele ja testiti nende lõhnaeelistust. Oluline on see, et hindamiseks viidi tagasikutsumise test läbi kas tavalisel Petri tassilmälu-põhine otsingukäitumine või preemiat sisaldav Petri tass, et teha kindlaks, kas preemia olemasolu lõpetasmälu-põhine otsing. Mõlemal juhul oli testitava Petri tassi üks külg varustatud AM-mahutiga ja teine külg EM-mahutiga. Vastsete arv mõlemal küljel määrati kaamerapildi põhjal 3 minutit pärast testi algust. Nende arvude põhjal arvutati lõhnaeelistus järgmiselt:
Seega võivad PI väärtused olla vahemikus 1 kuni 1, kusjuures positiivsed väärtused näitavad, et vastsed eelistasid lõhna rohkem pärast paaristamist kui paarita treeningut. Positiivsed PI väärtused näitavad vastavalt isuäratavat assotsiatiivsustmälumida on kõige parem tõlgendada kuimälu-põhine otsingukäitumine. Negatiivsed PI väärtused näitavad seevastu aversiivset assotsiatiivsustmälu.
Assotsiatiivne õppimine optogeneetilise DAN-i aktiveerimise teel. Optogeneetiliste katsete jaoks viidi koolitus ja test läbi analoogselt. Kõik Petri tassid olid aga täidetud tavalise agaroosiga (st ei kasutatud rahuldustpakkuvaid maitseaineid). Selle asemel ühendati paarilise treeningu jaoks AM pideva sinise valguse stimulatsiooniga, et aktiveerida 2,5 minutiks kas 58E02-DAN või 864- DAN, millele järgnes 2,5 minutit ilma lõhnata pimedust (AM1/EM). Paaritu treeningu puhul toimus lõhnade esitus ja valgusstimulatsioon eraldi (AM/EM1). Joonisel 8E kujutatud katse puhul esitati lõhn ja valgus 5 minuti jooksul; see katse järgis muidu Rohwedderi et al. kirjeldatud protseduure. (2016).
Pärast kolme sellist treeningtsüklit viidi läbi tagasikutsumise test ning lõhnaeelistus ja PI arvutati kirjeldatud viisil. Kriitiline on see, et tagasikutsumise test viidi läbi ilma sinise valguse aktiveerimiseta, et teha kindlaks, kas DAN-id vahendavad treeningu ajal tasusignaali, või sinise valguse aktiveerimisega, et teha kindlaks, kas DAN-id võivad lisaks vahendada signaali otsingu lõpetamiseks.
Selle protokolli variatsioonid on näidatud jooniste legendides.
Kaasasündinud haistmiskäitumine. Lõhnaanumad ja Petri tassid valmistati ülalkirjeldatud viisil. Viaalist koguti 20 vastsest koosnevad kohordid, pesti korraks kraanivees ja asetati Petri tassile, mille ühel küljel oli AM-konteiner ja teisel pool tühi anum. 3 minuti pärast määrati kaasasündinud lõhnaeelistus vastavalt võrrandile 1. See eelistuse test viidi läbi kas suhkru puudumisel või juuresolekul või sinise valguse aktiveerimise puudumisel või juuresolekul, et teha kindlaks, kas need katsetingimused muutuvad kaasasündinud haistmiskäitumine.
Käitumise modulatsioonide analüüs pärast treeningut 864-DAN-i aktiveerimisega. Vastsete käitumist jälgiti video abil ja analüüsiti, nagu on üksikasjalikult kirjeldanud Paisios et al. (2017). Lühidalt, analüüsiti vastsete kemotaksise kahte aspekti. Esiteks arvutati pea kastraadi modulatsioon (HC sekundis) (HC/s) järgmiselt:
Selles mõõdus kirjeldab suunanurk (HA) looma pea orientatsiooni lõhna suhtes, kusjuures absoluutsed suunanurgad (abs (HA)) on näiteks 0 kraadi või 180 kraadi, mis näitab, et lõhn on vastavalt vastsete ees või taga. See meede annab seega positiivse hinde külgetõmbe kohta (st kui HC suunab vastsed pigem lõhna sihtmärgi poole, mitte sellest eemale), samas kui see annab negatiivse hinde vastumeelsuse kohta.
Immunohistokeemia. Vastsete ajud lõigati lahti Ca{{0}}vabas soolalahuses ja fikseeriti 7 minutiks Bouini lahuses, mis oli lahjendatud 1:2 Ca21-vaba soolalahusega. Kolmele pesemisetapile (igaüks 10 minutit) PBST-s (0,3% Triton-X 100 PBS-s) järgnes inkubeerimine primaarsete antikehadega üleöö temperatuuril 4 °C. Pärast kolme pesemist (igaüks 10 minutit) PBS-s inkubeeriti kudet sekundaarsete antikehadega 1 tund toatemperatuuril. Pärast kolme viimast pesemisetappi PBS-s (igaüks 10 minutit) paigaldati proovid Vectashieldi (Vector Laboratories). Preparaate uuriti DM 6000 CS konfokaalse mikroskoobi all (Leica Microsystems).
cistanche kulturism
Antikehadena kasutasime kas monoklonaalset anti-FASII hiire antikeha (DSHB, lahjendatud 1:50 blokeerivas lahuses, mis sisaldas 4 protsenti normaalset kitse seerumit) ja anti-GFP küüliku antikeha (A11122, Invitrogen, lahjendatud 1:1{ {28}}00 blokeerivas lahuses, mis sisaldab 4 protsenti normaalset kitse seerumit) primaarsete antikehadena ja Cy3 hiirevastase antikehana (715-165-150, Jackson ImmunoResearch Laboratories) ja Alexa-488 küülikuvastasena antikeha (A11034, Invitrogen), mõlemad lahjendatud 1:200 PBS-is, sekundaarsete antikehadena; või kasutasime primaarse antikehana monoklonaalset ChR2-vastast hiire antikeha (ProGen Biotechnik), mis oli lahjendatud 1:100 0,3-protsendilises PBST-s, hiirevastast antikeha Cy3 (715-165-150, Jackson ImmunoResearch Laboratories), lahjendatud 1:300 0,3-protsendilises PBST-s. , sekundaarse antikehana, ja Alexa-488 anti-HRP (Jackson ImmunoResearch Laboratories), mis on lahjendatud 1:300 0,3% PBST-ga, vastuvärvimiseks.