1. osa: Inimpiima oligosahhariid 2/-fukosülaktoos indutseerib neuroprotektsiooni intratserebraalsest verejooksust

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com

Tsai-Wei Hung 1, Kuo-Jen Wu 1, Yu-Syuan Wang 1, Eun-Kyung Bae 1, YoungHa Song 2 , JongWon Yoon 2 ja Seong-Jin Yu1,*

1 Neuropsühhiaatriliste uuringute keskus, riiklikud terviseuuringute instituudid, Zhunan 35053, Taiwan;

pilypily@nhri.edu.tw (T.-W.H.); kjwu@nhri.edu.tw (K.-J.W.); yswang@nhri.edu.tw (Y.-S.W.);

baee@nhri.edu.tw (E.-K.B.)

2Lisatud valgutehnoloogiate korporatsioon, Suwon-si 16229, Korea; yhsong@aptech.biz (Y.S.);

jongwon.yoon91@gmail.com (J.Y.)

Kirjavahetus: b7508@nhri.edu.tw; Tel: +886-37206166 (endine 36710)

Abstraktne:

Intratserebraalne verejooks (ICH) tekib aju veresoonte purunemisel, põhjustades põletikku ja rakusurma. 2-Fucosyllactose (2FL), inimese piima oligosahhariid, omab tugevat antiapoptootilist ja põletikuvastast toimet. Selle uuringu eesmärk oli uurida 2FL-i kaitsvat toimet ICH raku- ja näriliste mudelites. Hemin lisati esmasele roti kortikaalseleneuronaalneja BV2 microglia coculture simuleerida ICH in vitro. Põletiku janeuronaalneellujäämine. Hemin suurendas oluliselt IBA1, samas kui see vähendas MAP2 immunoreaktiivsust. 2FL vastandas mõlemad vastused märkimisväärselt. 2FL-i kaitsvat toimet uuriti järgmisena roti ICH mudelis. VII tüüpi kollageenaasi intratserebraal manustamine vähendas avatud väli liikumisaktiivsust. Varajane ravijärgne ravi 2FL-iga parandas oluliselt liikumisaktiivsust. Ajukudesid koguti immunohistokeemia ja qRT-PCR analüüsi jaoks. 2FL vähendas IBA1 ja CD4 immunoreaktiivsust kahjustatud striatumis. 2FL vähendas ER stressimarkerite (PERK ja CHOP) ekspressiooni, samal ajal kui see reguleeris M2 makrofaagi markereid (CD206 ja TGFβ) kahjustatud ajus. Kokkuvõttes toetavad meie andmed, et 2FL-il onneuroprotektiivnemõju ICH vastu inhibeerimise kauduneuroinflammatsioonja ER stress. 2FL-il võib olla kliiniline mõju ICH ravile.

Märksõnad: 2-fukosüüllaktoos; tserebraalne verejooks; põletik; endoplasmaatiline retiikulum

tsistanche ekstrakti mõju: ravige neurohaigusi

Pls kliki siia kuni 2. osani

1. Sissejuhatus

Intratserebraalne verejooks (ICH) on suurNeuroloogilisedkõrge surmaohuga seotud häire täiskasvanutel [1,2]. ICH moodustab 10–15% kõigist ägeda insuldi juhtudest [3]. Mõned epidemioloogilised uuringud on toetanud soolist ebavõrdsust ICH [4] või tserebrovaskulaarsete haigustega patsientidel [5]. Väikesel osal ICH patsientidest tekib hemorraagiline lakunar sündroom [6]. ICH praegune ravi keskendub verejooksu kontrollimisele, verehüüvete eemaldamisele ja verejooksu põhjustatud koljusisese rõhu leevendamisele. ICH jaoks ei ole tõhusat farmakoloogilist ravi.

Põletikul on ICH-indutseeritud indutseeritud oluline rollneurodegeneratsioon. Pärast ICH algust sisenevad vererakud aju parenhhüümi, aktiveerivad mikroglia ja alustavad proinflammatiivsete tsütokiinide tootmist [7,8]. Hemin, hemoglobiini kõrvalsaadus, põhjustabneuronaalnesurma ja indutseerib apoptoosi ja põletikku [9,10]. Mitmed uuringud on toetanud põletikuvastase ravi efektiivsust ICH loommudelites [11,12]. Hiljuti näitasime, et varajane ravijärgne ravi CXCR4 antagonisti CX807-ga pärssis põletikku ja parandas käitumisfunktsiooni eksperimentaalsetel ICH rottidel [13]. Need andmed viitavad sellele, et põletikuvastane ravi võib vähendada ajukahjustusi

Pärast ICH-d.

Inimese rinnapiim sisaldab toitumist ja mitmeid kriitilisi bioaktiivseid koostisosi, [14] nt inimese piima oligosahhariide [15]. 2′-Fucosyllactose (2FL) on inimpiima peamine oligosahhariid. 2FL-i suuline kohaletoimetamine paranesmäluja õppimine rottidel [16,17]. Lisaks pärssis 2FL lipopolüsahhariidi indutseeritud CD14 ekspressiooni ja põletikku inimese enterotsüütides [18]. Hiljuti teatati, et 2FL leevendasneuroinflammatsioonajus kannatavas isheemilises insuldis [19]. Need andmed näitavad, et 2FL on tugev põletikuvastane aine ja võib seega olla kasulik ICH raviks.

Selle uuringu eesmärk oli uurida 2FL-i närvikaitsevahendeid ICH raku- ja loomamudelites. Heminit kasutati ICH simuleerimiseks rakukultuuris [20]. Näitasime, et 2FL antagoniseeritud hemini vahendatud mikroglia aktiveerimine. VII tüüpi kollageenaasi kasutati fokaalse ICH loomiseks täiskasvanud rottidel [13]. Leidsime, et 2FL leevendas oluliselt ICH-indutseeritud mikroglia aktiveerimist, CD4 + lümfotsüütide infiltratsiooni ja ER stressi kahjustatud ajus ja paranenud käitumisfunktsiooni. Meie andmed toetavad seda, et 2FL-il onneuroprotektiivnemõju ICH vastu.

cistanche ekstrakti mõju

2. Tulemused

2.1. 2FL vähendatud hemini vahendatud neurodegeneratsioon primaarsetes kortikaalsetes neuronites ja BV2 Microglia Coculture'is

2FL-i kaitsvat toimet uuriti esmakordselt ajuverejooksu rakumudelis. Esmane kortikaalneneuronaalneja BV2 mikroglia cocultures töödeldi heminiga (10 uM) 48 h (vt joonis 1E ajakava). Hemin nõrgestatudneuronaalnemarker MAP2 (joonis 1A), samas kui see suurendas mikroglia markerit IBA1 (joonis1B). Mõlemad vastused olid vastuolus 2FL-iga (1 uM, joonis 1A, B). MAP2 ja IBA1 immunoreaktivaarsust analüüsiti edasi, mõõtes konkreetsete markerite pikslite tihedust. Nagu joonisel 1C,D näha, vähendas hemin oluliselt MAP2 immunoreaktiivsust (Map2-ir) ja suurendas IBA1-ir (p< 0.001,="" one-way="" anova,="" n="6" in="" each="" group).="" these="" responses="" were="" significantly="" antagonized="" by="" 2fl="" (map2:="" p="">< 0.001,="" f2,14="115.863;" iba1:="" p="">< 0.001,="" f2,15="134.644," one-way="">

F

Joonis 1. neuroprotektiivne2FL-i mõju esmases kortikaalsesNeuronja BV2 microglia coculture. (A) Representatiivsed fotomikrograafid näitavad, et hemin vähendas MAP2 immunoreaktiivsust (-ir). Coadministration koos 2FL antagonized hemin vahendatud kaotus MAP-ir. (B) Hemin suurendas IBA1-i. Coadministration koos 2FL vähendatud IBA1-ir. (C,D) MAP2-ir või IBA1-ir pikslite tihedust analüüsiti NIS Elements AR 5.11 tarkvara abil. (C) 2FL oluliselt antagoniseeritud hemini vahendatud kaotus MAP2-ir. (D) 2FL vähendas oluliselt heminist põhjustatud IBA1 aktiivsust. E) eksperimendi ajakava. * p< 0.05.="" scale="" bar="100">

cistanche ekstrakti kasu

2.2. Järelravi 2FL-iga paranenud liikumisaktiivsus ICH rottidel

2FL-i kaitsvat toimet uuriti järgmisena ICH loomamudelis. Kokku manustati 14 täiskasvanud isasele rotile stereotaktiliselt väikest annust (0,5 ühikut/uL × 1 uL), et indutseerida ajuverejooks õiges striatumis. 2FL (400 mg/kg/d, st p., n = 7) või sõidukit (soolalahus, st p., n = 7) manustati iga päev 5 päeva jooksul, alustades 1 päev pärast insulti (vt ajakava joonisel 2G). Siis, 2 tundi pärast viimast 2FL-i või sõiduki süstimist 5. päeval, paigutati loomad individuaalselt infrapuna aktiivsuskambritesse 30 minutiks. Avatud välja liikumise käitumist uuriti 30 minutit. Leidsime, et 2FL suurendas oluliselt vertikaalset aktiivsust (VACTV, joonis 2A), läbitud vahemaad kokku (TOTDIST, joonis 2B), vertikaalset aega (VTIME, joonis 2C), horisontaalset aktiivsust (HACTV, joonis 2D), liikumisaega (MOVTME, joonis 2E) ja liikumisnumbrit (MOVNO, joonis 2F). Üksikasjalik statistika (kahesuunalised ANOVA + post hoc Newman–Keulsi (NK) testid) on loetletud tabelis 1.

Joonis 2. Järeltöötlus 2FL-iga parandab ICH rottide närvifunktsioone. Täiskasvanud rotte raviti VII tüüpi kollageenaasiga D0-l (G, ajaskaala). 2FL või sõidukit manustati süsteemselt iga päev 5 päeva jooksul. Liikumisharjumusi uuriti D5-l. 2FL parandas oluliselt (A) vertikaalset aktiivsust, (B) kogu läbitud vahemaad, (C) vertikaalset aega, (D) horisontaalset aktiivsust, (E) liikumisaega ja (F) liikumist

arv. n = 7 igas rühmas. * p< 0.05,="" two-way="" anova;="" #="" p="">< 0.05,="" post="" hoc="" nk="">

Tabel 1. Olulised erinevused ICH +veh ja ICH +2FL liikumise käitumises.

2.3. Varajane ravijärgne ravi 2FL-iga vähendas mikrogliia aktiveerimist Peri-kahjustatud piirkonnas

Kaheksa ICH rotti (2FL, n = 4; Veh, n = 4) eutaniseeriti ja perfundeeriti IBA1 immunohistochemistry jaoks pärast käitumistesti 5. päeval. Tüüpiline IBA1-ir on näidatud joonisel 3. IBA1-ir paranes peri-kahjustatud piirkonnas striatumis (joonis 3B), võrreldes vastavate kohtadega kontralateraalses kahjustusteta striatumis (Joonis3A) insuldi rottidel, kes said veh. Kõrge suurenduse korral leiti kahjustatud alalt de-ramifitseeritud või ameboidseid mikrogliiarakke (joonis 3B, sisetükk), samas kui kahjustatud morfoloogiaga mikrogliat leiti kahjustusteta striatumist (joonis3A, sisestage). 2FL ravi vähendas IBA1-ir-i ja osaliselt taastas mikroglia morfoloogilist mõju (joonis3C, sisestage). IBA1-ir kvantifitseeriti ja keskmistati kolmes järjestikuses ajuosas visualiseeritud eesmise komissariga kõigil loomadel. 2FL vähendas oluliselt IBA1-i või ICH ajus (joonis 3D, p< 0.001,="" f2,12="50.357," one-way="">

Joonis 3. Varajane ravijärgne 2FL vähendas mikrogliia aktivatsiooni kahjustatud striatumis. Loomad said sõiduki või 2FL pärast kollageenaasi süstimist 1.–5. päeval. Loomad ohverdati viiendal päeval. Kahjustatud striatumist (B vs. A) leiti täiustatud IBA1 immunoreaktiivsus koos ramifitseeritud morfoloogiaga. Ravi 2FL-iga vähendas IBA immunoreaktiivsust (C vs B). (D) 2FL vähendas oluliselt IBA1 immunoreaktiivsust kahjustatud ajus. * p< 0.05,="" one-way="" anova="" +="" nk="">

2.4. 2FL Leevendatud CD4+ lümfotsüütide infiltratsioon kahjustatud ajudesse

Kollageenaasi manustamine suurendas CD4+ lümfotsüütide infiltratsiooni kahjustatud striatumi (joonis 4B). Kahjustusteta striatumis (joonis 4A) ei leitud peaaegu ühtegi CD4-rakku. CD4 rakkude infiltratsiooni kahjustatud striatumi leevendas 2FL-ravi (joonis 4C vs joonis 4B; lk 4B< 0.001,="" f2,6="173.485," one-way="" anova,="" figure="">

Joonis 4. Pärast ravi 2FL-iga vähendas CD4+ lümfotsüütide infiltratsiooni kahjustatud ajju. Tüüpilised fotomikrograafid näitavad CD4 immunoreaktiivsust (A) kahjustusteta striatumis ja (B) kahjustatud striatumis roti vastuvõtvast sõidukist madalal (kalibreerimine = 50 um) ja kõrge suurendusega (sisestamine, kalibreerimine = 10 um), samuti (C) kahjustatud striatum rotist, kes sai 2FL. (D) 2FL oluliselt vähendanud CD4-ir kahjustatud ajus (* p p< 0.001,="">

viis ANOVA).

2.5. 2FL muutis diferentsiaalselt M1 ja M2 põletikuliste markerite ekspressiooni ICH ajus

Striataalsed koed koguti kaheksalt rotilt (veh, n = 4; 2FL, n = 4) 5. päeval. M1/M2 põletikuliste markerite ekspressiooni uuris qRT-PCR. ICH suurendas oluliselt M1 markeri CD86 (Joonis5A, p = 0,005) ja M2 markerite CD206 ja TGFβ (joonis 5B, C, p = 0,005) ekspressiooni. 2FL ei muutnud CD86 väljendit (joonis 5A, p = 0,356, kahesuunaline ANOVA). Kuid see reguleeris oluliselt CD206 (joonis 5B) ja TGFβ ekspressiooni kahjustatud poolel (p< 0.05,="" nk="">

cistanche ekstrakti kasu

2.6. 2FL muutis ER stressi ja apoptootiliste markerite ekspressiooni ICH ajus

ER stressi ja apoptootiliste markerite ekspressiooni uuriti kaheksal rotil (veh, n = 4; 2FL, n = 4). 2FL vähendas oluliselt PERK-i (joonis6A, p = 0,016), IRE1 (joonis6B, p = 0,018), CHOP (joonis 6C, p = 0,032) ja SigmaR1 (joonis 6D, p = 0,017) ekspressiooni kahjustatud striatumis. 2FL ei muutnud BIP (joonis6E, p = 0,841) ja ATF6 (joonis 6F, p = 0,403) väljendit. Lisaks oli kaspaasi3 ekspressioon 2FL-i poolt oluliselt ümber kujundatud (joonis 6G, p = 0,029, t-test).

Joonis 5. 2FL reguleeris M2 markerite ekspressiooni ICH ajus. ICH suurendas oluliselt (A) M1 markeri CD86 ja M2 markerite (B) CD206 ja (C) TGFβ (# p = 0,005, kahesuunalise ANOVA) ekspressiooni. (A) 2FL reguleeris oluliselt (B) CD206 ja (C) TGFβ, kuid mitte (A) CD86 ekspressiooni kahjustatud striatumis (* p)< 0.05,="" nk="">

Joonis 6. 2FL pärssis ER stressi ja apoptootiliste markerite ekspressiooni. (A) PERK, (B) IRE1, (C) CHOP, (D) SigmaR1 ja (G) kaspaasi3 ekspressioon inhibeeriti hemorraagilistes ajudes märkimisväärselt 2FL võrra. (E) BIP ja (F) ATF6 ekspressiooni ei muutnud 2FL. * p< 0.05.="" er,="" endoplasmic="" reticulum;="" perk,="" protein="" kinase="" r-like="" er="" kinase;="" ire1,="" inositol-requiring="" enzyme="" 1;="" chop,="" ccaat="" enhancer-binding="" protein="" homologous="" protein;="" sigmar1,="" sigma="" 1="" receptor;="" atf6,="" activating="" transcription="" factor="">

cistanche'i lisand