1. osa|Herba Cistanche ekstrakt suurendab mitokondriaalset ATP teket roti südametes ja H9c2 rakkudes

Kontakt: emily.li@wecistanche.com

Hoi Yan Leung ja Kam Ming Ko

Hongkongi teadus- ja tehnoloogiaülikooli biokeemia osakond, Clear Water Bay, Hongkongi erihalduspiirkond, Hiina

Märksõnad: ATP,Cistanche deserticola, H9c2 rakud, süda, mitokondrid

Abstraktne

Et uurida ravimi farmakoloogilist alust.Yang - kosutavHerbal Cistanche [kuivatatud terve taimCistanche deserticolaYC Ma (Orobanchaceae)] uuriti Hiina meditsiinis Herba Cistanche metanooliekstrakti mõju mitokondriaalse ATP genereerimise võimele, kasutades ex vivo roti südamemudelit ja in situ H9c2 rakuanalüüsi. Ravi Herba Cistanche ekstraktiga suurendas müokardi mitokondriaalset ATP genereerimisvõimet annusest sõltuval viisil rottidel, mida hinnati in vitro mõõtmisega. ATP genereerimisvõime stimuleerimine oli seotud mitokondriaalse elektronide transpordi paralleelse suurenemisega, mida toetas püruvaat, kuid mitte suktsinaat. Ravi Herba Cistanche'iga suurendas ka müokardi mitokondriaalse kompleksi I ja kompleksi III aktiivsust, kusjuures kompleksi I aktiivsuse stimuleerimise ulatus oli suurem. Herba Cistanche ravi põhjustas annusest ja ajast sõltuva mitokondriaalse ATP genereerimisvõime suurenemise H9c2 rakkudes. Tulemused näitavad, et Herba Cistanche ravi võibsuurendab mitokondriaalset ATP teketroti südametes ex vivo ja H9c2 rakkudes in situ, võib-olla läbioksüdatiivse fosforüülimise suurendamine.

Tistanche võib parandada südame tööd, alandada vererõhku ja alandada vere lipiide

Sissejuhatus

"Yangi elavdamine", mis kehastab keha funktsioonide üldist tõhustamist Hiina meditsiinis, hõlmab energia kasutamist erinevate biokeemiliste protsesside juhtimisel.

Sellega seoses tekib ATP, mis on universaalne energiavaluuta rakufunktsiooni toitmisel, peamiselt mitokondrites oksüdatiivse fosforüülimise kaudu. Oleme oletanud, et "Yang kosutavad" maitsetaimedneil on võime suurendada mitokondriaalset ATP tootmisvõimet(Ko et al., 2004). Seda toetab meie hiljutine avastus, et "Yangi turgutavad", kuid mitte "Yin-toitvad" Hiina toniseerivad ürdid võivad suurendada müokardi ATP genereerimise võimet hiire südametes ex vivo (Ko et al., 2006). Herba Cistanche, Cistanche deserticola YC Ma (Orobanchaceae) kuivatatud terve parasiitaim (v.a õis), on klassifitseeritud kui.'Yangi ergutav" toniseeriv ravimtaim traditsioonilises hiina meditsiinis (Chen, 1998) ja see näib olevat kõige populaarsem koostisosa paljudes Hiina patendipreparaatides, mida kasutatakse Yangi turgutamiseks. Hiinas ja Jaapanis kasutatakse Herba Cistanche'i laialdaselt paljude Yangi puudulikkuse sümptomite raviks. Farmakoloogilised uuringud näitasid, et Herba Cistanche võikspühkida vabu radikaale(Xiong et al., 1996),toota rahustit(Lu, 1998),Vananemisvastane(Lee et al., 1990),antinotsitseptiivne ja põletikuvastane toime(Lin et al., 2002) jatugevdada immuunfunktsiooni(Wu et al., 2005). Herba Cistanche peamine toimeaine onfenüületanoidglükosiidid(Ouyang et al., 2003), millel on leitudantibakteriaalne, stressivastane ja antioksüdantomadused (Xiong et al., 1998), samuti anti-apoptootiline toime kultiveeritud neuronitele (Tian & Pu, 2005). Käesolevas uuringus uuriti Herba Cistanche Yangi ergutava toime farmakoloogilise aluse uurimiseks Herba Cistanche ravi mõju ATP genereerimise võimele mitokondrites, mis on eraldatud roti südametest ex vivo ja kultiveeritud H9c2 kardiomüotsüütidest in situ. ATP teket suurendava toime aluseks oleva biokeemilise mehhanismi uurimiseks uuriti ka Herba Cistanche'i ravi mõju mitokondriaalsele elektronide transpordile ja komplekssetele I–IV aktiivsustele roti südametes.

Cistanche'i tõhusad koostisosad võivad eemaldada erinevaid aktiivseid hapnikuvabu radikaale

Materjalid ja meetodid

Kemikaalid, rakukultuur ja taimsed materjalid

ATP, ADP ja 3-[4,5-dimetüültiosool-2-üül]-2,5-difenüültetrasooliumbromiid (MTT) osteti ettevõttelt Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA). Lutsiferaasi lahus (ATPlite) saadi firmalt PerkinElmer (Boston, MA, USA). Dulbecco modifitseeritud Eagle'i sööde (DMEM) ja veiseloote seerum (FBS) osteti ettevõttelt GIBCO BRL Life Technologies (Grand Island, NY, USA). H9c2 rakuliin osteti ettevõttest ATTC (Rockville, MD, USA). Herba Cistanche tarnis kohalik ravimtaimemüüja (Lee Hoong Kee). Tarnija kinnitas ravimtaime autentsuse ja kviitungi näidis (HKUSTY00301) deponeeriti Hongkongi teadus- ja tehnoloogiaülikooli (HKUST) biokeemia osakonda.

Maitsetaimede ekstraheerimine

Herba Cistanche (100g) lõigati väikesteks tükkideks ja ekstraheeriti, kuumutades tagasijooksul 300 ml metanoolis temperatuuril 65 °C 2 tundi. Protseduuri korrati kaks korda. Ühendatud ekstrakt kuivatati, aurustades lahusti alandatud rõhul ja saadi Herba Cistanche metanooliekstrakt saagisega 39 protsenti (mass/mass). Keemiline analüüs näitas, et Herba Cistanche metanooliekstrakt sisaldas saponiine, flavonoide, lignaane ja polüsahhariide vastavalt kontsentratsioonides vastavalt 1,62% (w/w), 0,08%, 0,15% ja 75,6%.

Loomade eest hoolitsemine

Täiskasvanud isaseid Sprague-Dawley rotte (8–10 nädalat; 250–300 g) hoiti 12--tunnise pimeduse/valguse tsükli all õhu/niiskuse reguleeritavas ruumis temperatuuril umbes 22 °C ning neile lubati süüa ja vett ad libitum. HKUSTi loomahooldusasutustes. Katseprotokollid kiitis heaks HKUSTi uurimispraktika komitee.

Narkootikumide ravi

Loomad jagati juhuslikult rühmadesse, igaühes viis kuni kuus looma. Ravirühmades manustati rottidele 3 päeva jooksul intragastraalselt Herba Cistanche metanooliekstrakti (lahustatuna/suspendeerituna vees) päevaannustes ({{0}},031–0,5 g/kg). Kontrollloomad said ainult vett. Kakskümmend neli tundi pärast viimast annust võeti fenobarbitaaliga tuimestatud loomadelt süda ja viidi läbi biokeemiline analüüs.

Mitokondriaalsete fraktsioonide valmistamine ja ATP genereerimisvõime (ATP-GC) mõõtmine ex vivo

Südame vasaku vatsakese koeproovid lõigati välja ja loputati jääkülma isotoonilise puhvriga (0,32 M sahharoosi, 1 mM EDTA, 50 mM Tris/HCl, pH 7,4). Südame mitokondriaalsed fraktsioonid valmistati diferentsiaalse tsentrifuugimisega isotoonilises puhvris temperatuuril 4 °C. 10-protsendiline (mass/maht) südamehomogenaat valmistati hakitud ventrikulaarse koe homogeniseerimisel teflonklaasist homogenisaatoriga kiirusel 4000 p/min 20–30 täieliku löögi jooksul. Homogenaati tsentrifuugiti 600 x g juures 10 minutit, et eemaldada tuumad ja rakujäägid. Seejärel tsentrifuugiti supernatanti 8000 x g juures 30 minutit, et settida mitokondrid (Evan, 1992). Pelletid resuspendeeriti 1 ml isotoonilises puhvris ja taastati mitokondriaalsed fraktsioonid. Ravimata loomade mitokondriaalset ATP-GC-d mõõdeti Leung et al. (2005)

Cistanche polüsahhariidid võivad aeglustada elundite füsioloogilist degeneratsiooni ja raku morfoloogia degeneratsiooni

Mitokondriaalse elektronide transpordi mõõtmine

Elektronide transpordi mõõtmine isoleeritud mitokondrites, mis põhineb MTT redutseerimisel, nagu on kirjeldatud [1], nagu on kirjeldanud Cohen et al. (1997). Mitokondrid valmistati valgukontsentratsioonil 1 mg/ml inkubatsioonipuhvriga (250 mM sahharoosi, 50 mM HEPES, 10 mM KH2PO4, 2 mM MgCl2, 1 mM EGTA, pH 7,4). . Mitokondrite alikvoot (40 ui) segati 100 ui 15 mM püruvaadi või 0,5 mM suktsinaadi ja 0,42 mg/ml MTT-ga. Reaktsioonisegu inkubeeriti 37 °C juures 10 minutit õrnalt loksutades. Pärast inkubeerimist lõpetati reaktsioonisegu 100 ui lüüsipuhvri lisamisega (10%, w/v, naatriumdodetsüülsulfaat ja 45% dimetüülformamiid, pH reguleeriti jää-äädikhappega 4,7-ni). Pärast 5-minutilist seismist võeti reaktsioonisegu neeldumisnäidud mikrotiiterplaadi lugejaga (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) ja esitati erinevusena 570 nm ja 630 nm vahel. Andmed väljendati protsendina kontrollrühma (st Herba Cistanche-ravimata) rühma keskmisest väärtusest.

Rakukultuur

H9c2 rakke, mis on südame müoblastidest tuletatud püsiv rakuliin (Hescheler et al., 1991), kultiveeriti monokihtidena DMEM-is, millele oli lisatud 10% (maht/maht) FBS. Sööde sisaldas glükoosi (4,5 g/l) ja glutamiini (4,5 mM), millele oli lisatud NaHC03 (17 mM), penitsilliini (100 IU/ml) ja streptomütsiini (100 ug/ml). Kõiki rakke kasvatati 5% (maht/maht) CO2 atmosfääris õhus temperatuuril 37 °C. Sööde asendati värske söötmega iga 2 või 3 päeva järel. Rakkude varu kasvatati 75 cm2 kultiveerimiskolvis ja jagati enne liitumist subkultiveerimissuhtega 1:10. ATP-GC testi jaoks külvati H9c2 rakud tihedusega 2,5 × 104 rakku süvendi kohta 24-süvendiga plaadile. Pärast rakkude kinnitamist kanti söötmesse Herba Cistanche ekstrakti (lahustatuna fosfaatpuhverdatud soolalahuses; PBS) ja rakke inkubeeriti pikema aja jooksul (2–16 tundi). Kontrollrakkudele (töötlemata) anti ainult PBS-i.

ATP-GC mõõtmine in situ

Pärast näidatud inkubatsiooniperioode HerbaCistanche ekstraktiga kasvavates kontsentratsioonides (5{{10}}–300µg/mL) viidi läbi ATP-GC test. Sööde aspireeriti ja rakke töödeldi digitoniiniga (50 µg/ml) inkubatsioonipuhvris (120 mM KCl, 5 mMKH2PO4, 2 mM EGTA, 10 mM HEPES, 0,1 mM MgCl2, 0,5 protsenti BSA, pH 7,4 min 3 °C juures) ◦C. Pärast digitoniini aspireerimist lisati rakkudele mitokondriaalse ATP tekkeks glutamaat (5 mM), malaat (5 mM) ja ADP (60 uM), mida jälgiti kasvavate ajavahemike järel vahemikus 0 kuni 15 minutit. Reaktsioon lõpetati 60 µl perkloorhappe (30 massiprotsenti) lisamisega ja seejärel tsentrifuugiti reaktsioonisegusid 600 x g juures 10 minutit temperatuuril 4 °C. Supernatandi alikvoot (120 µL) segati neutraliseerimiseks 90 µL 1,4 M KHC03-ga. Segusid tsentrifuugiti uuesti 600 × g juures 4 °C juures ja supernatantides mõõdeti ATP sisaldust, nagu eelnevalt kirjeldatud. Töötlemata rakkude ATP-GC hinnati graafiku kõveraaluse pindala (AUC1) arvutamise teel, mis kujutas genereeritud ATP-d (nmol/mg valku) aja suhtes (0–15 min) ja väljendati suvalistes ühikutes. HerbaCistanche'iga töödeldud rakkude puhul normaliseeriti inkubatsiooniaja pikenemise (3, 5, 7, 10 ja 15 min) AUC1 väärtused töötlemata proovide vastava keskmise kontrollväärtuse järgi ja väljendati kontrolli protsendina. Seejärel arvutati graafiku kõveraalune pindala (AUC2), mis kujutab kontrollväärtusi protsentides inkubatsiooniaja (3–15 min) suhtes ja väljendati suvalistes ühikutes. Herba Cistanche'iga töödeldud rühmade andmed väljendati protsendina võrrandist:

[AUC2 (HerbaCistanche – töödeldud)/AUC2 (töötlemata)] × 100 protsenti

Kompleksi I–IV ja tsitraadi süntaasi aktiivsuse mõõtmine

Mitokondriaalse elektronide transpordiahela (ETC) kompleksi I–III aktiivsust mõõdeti spektrofotomeetriliste meetoditega, kasutades kompleksispetsiifilisi substraate (kompleksi I jaoks NADH, kompleksi II jaoks suktsinaat ja kompleksi III jaoks detsülubikinool), nagu on kirjeldatud (Grad & Lemire, 2004; Hsu et al. , 2005; Mark et al., 2001). Kompleksi IV aktiivsust mõõdeti Sigma tsütokroom c oksüdaasi analüüsikomplekti abil. Mitokondriaalse tsitraadi süntaasi aktiivsust mõõdeti Srere (1969) meetodil.

Valgu analüüs

Mitokondriaalsete fraktsioonide ja rakulüsaatide valgukontsentratsioonid määrati BioRad valgu analüüsikomplekti abil, kasutades standardina veise seerumi albumiini ({{0}},038–0,600 mg/ml).

Statistiline analüüs

Kõik andmed väljendati keskmisena ± teema standardviga (SEM). Neid analüüsiti ühesuunalise dispersioonanalüüsi (ANOVA) abil. LSD-ga tehti post hoc mitu võrdlust. P väärtused<0.05 were="" regarded="" as="" statistically="">

Tulemused

Herba Cistanche ravi mõju müokardi mitokondriaalsele ATP-GC-le rottidel

Nagu on näidatud joonisel 1, suurendas ravi Herba Cistanche ekstraktiga annustes kuni 0,5 g/kg müokardi mitokondriaalset ATP-GC-d annusest sõltuval viisil rottidel, kusjuures stimulatsiooni aste oli annuse juures 89%. 0,5 g/kg.

Herba Cistanche'i ravi mõju mitokondriaalsele elektronide transpordile roti südametes

Elektronide transpordi ulatust isoleeritud mitokondrites mõõdeti MTT vähenemise jälgimisega. Analüüsis kasutatud substraat oli kas püruvaat või suktsinaat.

Joonis 1. Herba Cistanche'i ravi mõju mitokondriaalsele ATP tekkevõimele roti südametes ex vivo

Iga riba tähistab teemat ± SEM, n {{0}}. Loomi raviti suu kaudu HerbaCistanche'iga näidatud päevaannustes 3 päeva jooksul. ATP tootmisvõimsust mõõdeti vastavalt jaotises "Materjalid ja meetodid" kirjeldatule. Andmed väljendati kontrollprotsentides vastava töötlemata kontrollrühma väärtuste (AUC2) suhtes. ∗Erineb oluliselt vastavast töötlemata kontrollrühmast; erineb oluliselt Herba Cistanche'iga ravitud rühmast 0,5 g/kg.

Joonis 2. Herba Cistanche ravi mõju mitokondriaalsele elektronide transpordile roti südametes

Iga riba tähistab keskmist ± SEM, n {{0}}. (a) Püruvaadiga toetatud (b) suktsinaadiga toetatud mitokondrite elektronide transporti mõõdeti MTT redutseerimisega, nagu on kirjeldatud jaotises "Materjalid ja meetodid". Andmed väljendati töötlemata kontrollväärtuste protsendina [püruvaadiga toetatud: OD570nm− OD630nm =0.0206 ± 0,0001 (SEM), n {{ 10}}; suktsinaadiga toetatud: isane, 0,255 ±0,015, n=5]. ∗Erineb oluliselt vastavast töötlemata kontrollrühmast; oluliselt erinev 0,5 g/kg rühmast.

Nagu on näidatud joonisel fig 2a, suurendas ravi Herba Cistanche'iga annusest sõltuvalt mitokondriaalset elektrontranspordi ulatust, mida toetas püruvaat roti südametes, optimaalset stimulatsiooni täheldades annustes 0,5 g/kg. Siiski ei tuvastatud Herba Cistanche'iga töödeldud roti südametes olulisi muutusi suktsinaadi toetatud mitokondriaalsete elektronide transpordi ulatuses (joonis 2b).

2. osa jaokspalun klõpsake siin.