Cistanche Deserticola ekstrakt suurendab luu moodustumist osteoblastides{0}}I osa

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Te-Mao Li^aet a

Abstraktne
Eesmärgid Uurisime mõjuCistanchedeserticolaMa. (CD) seesluumoodustaminekultiveeritud osteoblastide poolt. Meetodid CD in vitro mõjude uurimiseks kasutati mineraliseeritud sõlmede moodustumise testi(Cistanchedeserticola)pealluumoodustamine. Aluselise fosfataasi (ALP), luu morfogeneetilisi valke (BMP)-2 ja osteopontiini (OPN) mRNA ekspressiooni analüüsiti kvantitatiivse reaalajas polümeraasi ahelreaktsiooni abil. CD toimemehhanism(Cistanchedeserticola)ekstrakti uuriti Western blot meetodil. CD in vivo osteoporoosivastane toime(Cistanchedeserticola)ekstrakti hinnati hiirtel, kellel oli eemaldatud munasarjad.
Peamised leiud

CD(Cistanchedeserticola)ekstrakt ei mõjutanud kultiveeritud osteoblastide proliferatsiooni, migratsiooni ega haavade paranemist, kuid suurendas ALP, BMP-2 ja OPN mRNA ja luu mineralisatsiooni. Mitogeen-aktiveeritud proteiinkinaasi (MAPK) või tuumafaktori (NF)-KB inhibiitorid vähendasid CD-d(Cistanchedeserticola)ekstraktist põhjustatudluu moodustumineja ALP, BMP-2 ja OPN avaldis. Samas CD(Cistanchedeserticola)ekstrakt ei mõjutanud osteoklastogeneesi. Lisaks CD(Cistanchedeserticola)ekstrakt takistas in vivo munasarjaektoomiast põhjustatud luukadu.
Järeldused

CD(Cistanchedeserticola)võib olla romaanluu moodustumineaine osteoporoosi raviks.

Märksõnadluu moodustumine; Cistanchedeserticola; Hiina rohi; osteoblastid

Cistanche deserticolaon hea jaoksluu moodustumine

Sissejuhatus

Luu on keeruline kude, mis koosneb mitmest rakutüübist, mis läbivad pideva uuenemis- ja paranemisprotsessi, mida nimetatakse luu ümberkujundamiseks. Kaks peamist luude remodelleerumise eest vastutavat rakutüüpi on osteoklastid, mis resorbeerivad luud, ja osteoblastid, mis moodustavad uue luu. Luude ümberkujunemist reguleerivad mitmed süsteemsed hormoonid (nt paratüreoidhormoon, 1, 25-dihüdroksüvitamiin D3, suguhormoonid ja kaltsitoniin) ja lokaalsed tegurid (nt lämmastikoksiid, prostaglandiinid, kasvufaktorid ja tsütokiinid).[1] Osteoporoos tekib siis, kui luu resorptsioon ja moodustumine on koordineerimata ning luude liigne lagunemine ületab luude ehituse.[2] Praegused osteoporoosi ravimeetodid hõlmavad bisfosfonaate, kaltsitoniini ja östrogeeni, mis on luu resorptsiooni inhibiitorid, mis säilitavad luumassi, pärssides osteoklastide aktiivsust.[3] Nende ravimite mõju luumassi suurendamisel või taastumisel on aga suhteliselt väike, kindlasti mitte rohkem kui 2 protsenti aastas.[3] Seetõttu on vaja luukoe tugevdavaid aineid, nagu teriparatiid, mis stimuleeriksid uutluumoodustamineja korrigeerida väljakujunenud osteoporoosile iseloomulikku muutust trabekulaarses mikroarhitektuuris.[4,5] Kuna uusluumoodustamineon peamiselt osteoblastide funktsioon, luude moodustumist võivad soodustada ained, mis suurendavad osteoblastide liini rakkude proliferatsiooni või kutsuvad esile osteoblastide diferentseerumise.[5,6]
Kuigi osteoporoosi mehhanismid jäävad ebaselgeks, on need tõenäoliselt seotud luu kasvufaktorite, näiteks luu morfogeneetiliste valkude (BMP) vähenenud kättesaadavuse või mõjuga.[7] BMP-d, mis on struktuurselt seotud transformeeriva kasvufaktor-b superperekonnaga, tuvastati algselt nende võime järgi indutseerida emakavälist haigust.luu moodustaminenärilistel.[8] BMP-d mängivad olulist rolliluumoodustamineja luurakkude diferentseerumine, stimuleerides aluselise fosfataasi (ALP) aktiivsust ning proteoglükaani, kollageeni ja osteopontiini (OPN) sünteesi.[9] Hiljutine uuring leidis seose osteoporoosi ja spetsiifiliste polümorfismide vahel BMP-2, ALP ja OPN geenides, mis viitab sellele, et need on seotud osteoporoosi tekkega.[10]

CistanchedeserticolaMa. (Orobanchaceae; lühendatult CD)(Cistanchedeserticola)on Hiinas levinud ravimtaim ja seda kasutatakse laialdaselt traditsioonilises meditsiinis terapeutilise ainena tänu oma rahustavatele, valuvaigistavatele ja immunostimuleerivatele omadustele.[11] Kaasaegsed farmakoloogilised uuringud on näidanud, et CD(Cistanchedeserticola)ekstraktid võivad stimuleerida immuunsust,[12] eemaldada vabu radikaale[13] ja suurendada superoksiiddismutaasi aktiivsust[14]. Põletikuvastased ja antioksüdandid võivad osteoporoosi ravida, suurendadesluu moodustamineja/või luu resorptsiooni pärssimine.[15,16] Kuid CD mõju(Cistanchedeserticola)luurakkude funktsiooni ei ole veel kindlaks tehtud. Siin teatame sellest CD-st(Cistanchedeserticola)ekstrakt ei mõjutanud kultiveeritud osteoblastide proliferatsiooni, migratsiooni ega haavade paranemise aktiivsust, kuid suurendas ALP, BMP-2 ja OPN ekspressiooni ning luu mineralisatsiooni. Lisaks näitame, et mitogeen-aktiveeritud proteiinkinaasi (MAPK) ja tuumafaktori (NF)-KB signaaliülekandeteed võivad olla seotud CD-vahendatud geeniekspressiooni ja luu mineralisatsiooni suurenemisega. Seevastu CD(Cistanchedeserticola)ekstrakt ei pärssinud osteoklastogeneesi in vitro. Eelkõige hiirte ravi CD-ga(Cistanchedeserticola)ekstrakt hoidis ära munasarjade eemaldamise in vivo põhjustatud luukadu. Seetõttu näitavad meie andmed, et CD(Cistanchedeserticola)võib kasutada stimuleerimiseksluumoodustamineosteoporoosi raviks.

Cistanche deserticolatõsta immuunsust

Materjalid ja meetodid

Cistanche deserticola ekstrakt ja materjalid

CD(Cistanchedeserticola)ekstrakt osteti firmalt Chuang Song-Zong Pharmaceutical Company (Kaohsiung, Taiwan). CD ekstraheerimine ja isoleerimine(Cistanchedeserticola)järgiti nagu eelnevalt kirjeldatud (spektriandmete põhjal on nad tuvastanud keemilise koostise, sealhulgas beeta-sitosterool, daukosterool, merevaikhape, triakontanool, akteosiidid, betaiin ja polüsahhariid).[17] Küüliku polüklonaalsed antikehad, mis on spetsiifilised p-ekstratsellulaarse signaaliga reguleeritud kinaaside (ERK), ERK, p-p38, p38, pc-Jun N-terminaalsete kinaaside (JNK), JNK, p-p65 ja p65 suhtes, osteti ettevõttest Santa Cruz Biotechnology ( Santa Cruz, USA). Osteokaltsiini ELISA komplekt osteti ettevõttest Biosource Technology (Nivelles, Belgia). I tüüpi kollageeni ELISA komplekti C-terminaalsed telopeptiidid saadi ettevõttest Cross Laps (Herlev, Taani). Dominant-negatiivse p38 mutandi andis dr J. Han (South-Western Medical Center, Dallas, USA). JNK dominant-negatiivse mutandi andis dr M. Karin (California Ülikool, San Diego, USA). ERK2 dominant-negatiivse mutandi andis dr M. Cobb (South-Western Medical Center). Kõik muud reagendid saadi firmalt Sigma-Aldrich (St Louis, USA).

Rakukultuur

Hiire osteoblasti rakuliin MC3T3-E1 osteti ettevõttest American Type Culture Collection (ATCC; Rockville, USA). Rakke kultiveeriti 95-protsendilises õhus, 5-protsendilises CO2-s a-MEM-iga, millele oli lisatud 20 mm HEPES-i ja 10-protsendilist kuumainaktiveeritud vasikaloote seerumit, 2 mm-glutamiini, penitsilliini (100 U/ml) ja streptomütsiini (100 mg). /ml).

Mineraliseeritud sõlmede moodustumise mõõtmine

Mineraliseeritud sõlmede moodustumist hinnati vastavalt kirjeldusele.[18] Lühidalt öeldes kultiveeriti osteoblaste söötmes, mis sisaldas C-vitamiini (50 mg/ml) ja b-glütserofosfaati (10 mm) kaks nädalat ning söödet vahetati iga kolme päeva järel. Pärast CD-ga inkubeerimist(Cistanchedeserticola)ekstrakti 12 päeva, rakke pesti kaks korda 20 mm Tris-puhverdatud soolalahusega, mis sisaldas 0,15 m NaCl (pH 7,4), fikseeriti jääkülmas 75-protsendilises (maht/maht) etanoolis 30 minutit ja õhuga. kuivatatud. Kaltsiumi sadestumine määrati alisariinpunase-S värvimise abil. Lühidalt, etanooliga fikseeritud rakke ja maatriksit värviti 1 tund 40 mm alisariinpuna-S-ga (pH 4, 2) ja loputati põhjalikult veega. Seotud plekki elueeriti 10% (mass/maht) tsetüülpüridiiniumkloriidiga ja proovides sisalduv alisariinpunane S kvantifitseeriti neeldumise mõõtmisega 550 nm juures ja võrreldi standardkõveraga. Üks mool alisariinpunast-S seob selektiivselt ligikaudu kaks mooli kaltsiumi.

Cistanche deserticolaon hea jaoksluu moodustumine

Kvantitatiivne reaalajas polümeraasi ahelreaktsioon

Kogu RNA ekstraheeriti osteoblastidest, kasutades TRIzol komplekti (MDBio Inc., Taipei, Taiwan). Pöördtranskriptsioon viidi läbi, kasutades 2 mg totaalset RNA-d ja oligo(dT) praimerit.[19,20] Kvantitatiivne reaalajas polümeraasi ahelreaktsioon (qPCR) viidi läbi kasutades TaqMan® üheastmelist PCR Master Mix (Applied Biosystems, Carlsbad, USA). Lisati kogu cDNA (100 ng 25- ml reaktsiooni kohta) koos järjestusspetsiifiliste praimerite ja Taqman® sondidega. Kõik sihtgeeni praimerid ja sondid osteti kaubanduslikult, sealhulgas sisekontrollina b-aktiini (Applied Biosystems). qPCR analüüsid viidi läbi kolmes eksemplaris StepOnePlus järjestuse tuvastamise süsteemis (Applied Biosystems). Tsüklitingimused olid 10-min polümeraasi aktiveerimine 95 kraadi juures, millele järgnes 40 tsüklit 95 kraadi juures 15 sekundit ja 60 kraadi 60 sekundit. Lävi määrati mittematriitsi kontrollfooni kohal ja sihtgeeni amplifikatsiooni lineaarses faasis, et arvutada transkripti tuvastamise tsükli number (tähistatakse CT-ga).

Western blot analüüs

Rakulüsaadid valmistati eelnevalt kirjeldatud viisil.[21,22] Valgud lahutati SDS-PAGE abil ja kanti üle Immobiloni polüvinüüldifluoriidmembraanidele (Millipore, Billerica, USA). Blotid blokeeriti 4% veise seerumi albumiiniga 1 tund toatemperatuuril ja seejärel sondeeriti küüliku anti-inimese antikehadega p-65 või p-p65 (1:1000) vastu 1 tund toatemperatuuril. Pärast kolme pesemist inkubeeriti blotte 1 tund toatemperatuuril peroksidaasiga konjugeeritud eesli küülikuvastase sekundaarse antikehaga (1: 1000). Blotid visualiseeriti täiustatud kemoluminestsentsi abil, kasutades X-OMAT LS-kilet (Eastman Kodak, Rochester, USA).

Munasarjade eemaldamisest põhjustatud osteoporoos

Selles uuringus kasutati nelja nädala vanuseid emaseid ICR-hiiri, kaaluga 22–28 g. Hiirtel eemaldati munasarjad kahepoolselt trikloroatsetaldehüüdi (100 mg/kg) anesteesia all ja kontrollhiirtele tehti võrdluseks võltsoperatsioon (Sham). Luu mineraalset tihedust ja luu mineraalisisaldust mõõdeti pärast CD erinevate kontsentratsioonide suukaudset manustamist(Cistanchedeserticola)ekstrakti iga kahe päeva järel nelja nädala jooksul. Kogu keha luutihedus ja luu mineraalide sisaldus määrati kahe energiaga röntgenikiirguse absorptomeetriga (DEXA; XR-26; Norland, Fort Atkinson, USA), kasutades eelnevalt kirjeldatud režiimi väikestele isikutele.[18, 23] Kõik protokollid vastasid institutsionaalsetele juhistele ja need kiitis heaks Hiina meditsiiniülikooli loomahoolduskomitee.

Statistiline analüüs

Statistiline analüüs viidi läbi tarkvara Prism 4.{4}}1 abil. (GraphPad Software Inc., San Diego, USA). Antud väärtused on keskmised SEM. Kahe proovi statistiline analüüs viidi läbi Studenti t-testi abil. Rohkem kui kahe rühma statistilised võrdlused viidi läbi, kasutades ühesuunalist dispersioonanalüüsi Bonferroni posthoc testiga. Kõigil juhtudel peeti oluliseks P <>

Cistanche deserticolaon hea jaoksluu moodustumine

Tulemused

Cistanche deserticolaekstrakt suurendab luu mineralisatsiooni osteoblastide poolt CD lisamine(Cistanchedeserticola)Ekstrakt 24 või 48 tundi ei mõjutanud hiire osteoblasti MC3T3-E1 rakkude proliferatsiooni MTT testis (andmeid pole näidatud). Kuna osteoblastide diferentseerumine on keeruline protsess, mis hõlmab rakkude proliferatsiooni ja migratsiooni, testisime ka MC3T3-E1 rakkude migratsioonivõimet pärast ravi CD-ga.(Cistanchedeserticola)väljavõte. Kasutades Transwelli ja haavade paranemise teste, leidsime selle CD(Cistanchedeserticola)ekstrakt ei mõjutanud osteoblastide migratsiooni (andmeid pole näidatud). Mineraliseeritud sõlmede moodustumine on üks osteoblastide küpsemise markereid. Alisariinpunase S värvimine näitas, et osteoblastide kasvatamisel kaks nädalat C-vitamiini (50 ug/ml) ja glütserofosfaati (10 mm) sisaldavas söötmes tekkisid mineraliseerunud sõlmed, mis sõltus kontsentratsioonist CD lisamisel.(Cistanchedeserticola)(Joonis 1a). Seetõttu CD(Cistanchedeserticola)kultiveeritud osteoblastide poolt indutseeritud luusõlmede moodustumine, kuid mitte nende proliferatsioon või migratsioon. Uurisime ka CD rolli(Cistanchedeserticola)ekstrakt RANKL-i indutseeritud osteoklastogeneesis, kuid ei leidnud mingit toimet (andmeid pole näidatud).

Cistanche deserticola ekstrakt suurendab aluselise fosfataasi, luu morfogeneetilist valku-2 ja osteopontiini ekspressiooni kultiveeritud osteoblastides

Diferentseeritud osteoblastidel on kõrgenenud ALP aktiivsus, mis on korrelatsioonis ensüümi ekspressiooni kõrge tasemega.[18] Leidsime selle ravi CD-ga(Cistanchedeserticola)ekstrakt 72 tundi suurendas oluliselt osteoblastide ALP aktiivsust (joonis 1b). Arvestades BMP-2, ALP ja OPN olulist rolli osteoblastide diferentseerumisel, testisime, kas CD(Cistanchedeserticola)ekstrakt avaldab oma mõju osteoblastide diferentseerumisele, reguleerides BMP{0}}, ALP ja OPN ekspressiooni. Rakkude ravi CD-ga(Cistanchedeserticola)ekstraktid suurendasid ALP, BMP{0}} ja OPN mRNA ekspressiooni kontsentratsioonist sõltuval viisil (joonis 1c), mis näitab, et CD(Cistanchedeserticola)ekstrakt kutsus esile osteoblastide diferentseerumise ALP, BMP-2 ja OPN ekspressiooni ülesreguleerimise kaudu.

Cistanche deserticola ekstrakt suurendab luusõlmede moodustumist mitogeen-aktiveeritud proteiinkinaasi raja kaudu

On teatatud, et MAPK mängib olulist rolliluumoodustamine[24,25] seega uurisime järgmisena, kas see signaalirada on seotud CD-ga(Cistanchedeserticola)ekstrakti indutseeritud luu mineralisatsioon. Rakkude eeltöötlemine ERK inhibiitoriga U0126, p38 inhibiitoriga SB203580 või JNK inhibiitoriga SP600125 vähendas CD-d(Cistanchedeserticola)ekstraktiga suurenenud luu mineralisatsioon (joonised 2a, 3a ja 4a). Lisaks blokeerisid inhibiitorid ka CD-d(Cistanchedeserticola)ekstrakti indutseeritud ALP, BMP-2 ja OPN ekspressioon (joonised 2b–4c). Rakkude transfektsioon ERK2, p38 või JNK mutandiga vähendas CD-d(Cistanchedeserticola)ekstrakti suurenemine ALP, BMP-2 ja OPN mRNA ekspressioonis (joonised 2c, 3c ja 4c). Järgmisena uurisime vahetult ERK, p38 ja JNK aktiveerimist pärast CD-d(Cistanchedeserticola)ekstrakti ravi. Rakkude inkubeerimine CD-ga(Cistanchedeserticola)ekstrakt indutseeris ERK, p38 ja JNK fosforüülimise (joonised 2d, 3d ja 4d). Seetõttu vahendavad suurenemist ERK, p38 ja JNKluumoodustamineCD poolt indutseeritud(Cistanchedeserticola)osteoblastide ravi.

Cistanche deserticola ekstrakt suurendab luu sõlmede moodustumist tuumafaktor-kB raja kaudu

Nagu eelnevalt mainitud, on NF-kB aktiveerimine vajalikluumoodustamine[26,27] Järgmisena ravisime osteoblaste NF-kB inhibiitoritega pürrolidiinditiokarbamaadi (PDTC) ja N-tosüül-L-fenüülalaniini klorometüülketooniga (TPCK), mis osteti ettevõttest Calbiochem (Darmstadt, Saksamaa), et teha kindlaks, kas NF-kB aktiveeritakse. CD-ga seotud(Cistanchedeserticola)ekstrakti indutseeritud luu mineralisatsioon. Joonis 5a näitab, et osteoblastide eeltöötlus PDTC või TPCK-ga inhibeeris CD-d(Cistanchedeserticola)ekstraktist indutseeritud luusõlmede moodustumist ning vähendas ka ALP, BMP-2 ja OPN ekspressiooni suurenemist (joonis 5b ja 5c). NF-kB p65 subühiku fosforüülimine on NF-kB aktivatsiooni indikaator;[28] sellega kooskõlas leidsime, et CD(Cistanchedeserticola)ekstrakt suurendas p65 fosforüülimist osteoblastides (joonis 5d). Need tulemused näitasid, et NF-kB aktiveerimine on oluline CD ekstrakti indutseeritud ALP, BMP-2 ja OPN ekspressiooni ning luusõlmede moodustumise jaoks.

Joonis 4 c-Jun N-terminaalsete kinaaside (JNK) osalemineCistanchedeserticola(CD) ekstrakti poolt indutseeritud luu mineralisatsioon osteoblastides. (a) Rakud plaaditi 24-süvendiga plaatidele ja kultiveeriti söötmes, mis sisaldas C-vitamiini (50 mg/ml) ja b-glütserofosfaati (10 mM) kaks nädalat. Rakke töödeldi samaaegselt CD-ga(Cistanchedeserticola)ekstrakt (26 mg/ml) pluss SP600125 (3 mM). Mineraliseeritud sõlmede moodustumist hinnati alisariinpunase-S värvimisega (n=5). (b, c) Rakke töödeldi eelnevalt SP600125-ga 30 minutit või transfekteeriti JNK mutandiga või 24 tundi, millele järgnes stimuleerimine CD ekstraktiga ja aluselise fosfataasi (ALP) aktiivsuse ja ALP, luu morfogeneetilise valgu (BMP) -2 ja osteopontiini (OPN) mRNA ekspressiooni mõõdeti ALP komplekti ja kvantitatiivse reaalajas polümeraasi ahelreaktsiooni abil. ( d ) Rakke töödeldi CD ekstraktiga näidatud ajavahemike jooksul ja p-JNK ekspressiooni uuriti Western blot analüüsiga. *P< 0.05,="" compared="" with="" control="" group;="">< 0.05,="" compared="" with="" cd="">(Cistanchedeserticola)ekstraktiga töödeldud rühm.

Luuhõrenemise pärssimine Cistanche deserticola ekstraktiga munasarjade eemaldamisega hiirtel

CD mõju uurimiseks(Cistanchedeserticola)luuhõrenemise ekstrakti puhul kutsuti emastel hiirtel munasarjade eemaldamise teel esile osteoporoos. Nagu oodatud, vähenes munasarjade eemaldamisega hiirtel kogu keha luude mineraaltihedus ja luu mineraalide sisaldus (joonis 6a ja 6b). Ravi CD-ga(Cistanchedeserticola)ekstrakt nelja nädala jooksul pärssis luu mineraalse tiheduse ja luu mineraalide sisalduse vähenemist annusest sõltuval viisil (joonis 6a ja 6b). ALP kontsentratsioon veres võib peegeldada osteoblastide aktiivsust.[29] Nagu on näidatud joonisel 6c, CD(Cistanchedeserticola)ekstrakt pärssis seerumi ALP aktiivsuse vähenemist, mis oli põhjustatud munasarjade eemaldamisest. Lisaks CD(Cistanchedeserticola)ekstrakt suurendas ka osteokaltsiini taset, markeritluumoodustamineja vähendas luu resorptsiooni markeri I tüüpi kollageeni C-otsa telopeptiidide taset (joonis 6d ja 6e). Need leiud toetavad seega CD tugevust ja efektiivsust(Cistanchedeserticola)ekstrakt in vivo luuhõrenemise ennetamiseks.

Joonis 6 Munasarjade eemaldamisest tingitud luu mineraalse tiheduse ja luu mineraalainete sisalduse vähenemise pärssimineCistanchedeserticola(CD) väljavõte. Emastele ICR-hiirtele tehti võltsoperatsioon või eemaldati munasarjad. Munasarjade eemaldatud hiiri raviti näidatud kontsentratsiooniga CD-ga(Cistanchedeserticola)ekstrakt suukaudse söötmise teel. Keha luu mineraalne kogutihedus (a), luu mineraalide sisaldus (b), seerumi aluselise fosfataasi (ALP) aktiivsus (c), seerumi osteokaltsiini (d) ja seerumi I tüüpi kollageeni (e) C-otsa telopeptiidid määrati neli. nädalat pärast operatsiooni. Andmed on esitatud keskmisena SE, n=8–10 hiirt rühma kohta. *P < 0,05,="" võrreldes="" võltsiga;="" #p=""><0,05, võrreldes="" munasarjade="" eemaldamise="">

ARUTELU

Selle artikli II osa (Arutelu ja järeldused) kohta teabe saamiseks klõpsake siin.

Saatja: 'Cistanchedeserticolaekstrakt suurenebluumoodustamineosteoblastides' pooltTe-Mao Li^aet al

---© 2012 Autorid. JPP © 2012 Royal Pharmaceutical Society 2012Farmaatsia ja farmakoloogia ajakiri, 64, lk 897–907