1. osa: Cistanche Deserticola ekstraktid võivad kiirendada vananemisvõimelise hiire 8 (SAM-P8) hiirte immunosestsentsi antagoniseerida ja pikendada eluiga

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com

Ke Zhang, 1 Xu Ma, 1 Wenjun He, 1 Haixia Li, 1 Shuyan Han, 1 Yong Jiang, 1

Hounan Wu, 2 Li Han, 3 Tomohiro Ohno, 3 Nobuo Uotsu, 3 Kohji Yamaguchi, 3 Zhizhong Ma, 1, 4 ja Pengfei Tu1

1 Looduslike ravimite osakond, Farmaatsiateaduste kool, Pekingi Ülikool, No. 38 Xueyuan Road, Peking 100191, Hiina

2 Medical and Healthy Analytical Center, Pekingi ülikool, nr 38 Xueyuan Road, Peking 100191, Hiina

3 Fundamentaaluuringute teaduskond, Fancl Research Institute, FANCL Corporation, 12-13 Kamishinano, Totsuka-ku, Yokohama, Kanagawa 244-0806, Jaapan

4 Traditsioonilise hiina ja lääne meditsiini integratsiooni osakond, meditsiini põhiteaduste kool, Pekingi ülikool, nr 38 Xueyuan Road, Peking 100191, Hiina

Kirjavahetus tuleks adresseerida Zhizhong Ma-le; zhma@bjmu.edu.cn ja Pengfei Tu; pengfeitu@bjmu.edu.cn Saabunud 19. juulil 2013; Muudetud 23. oktoober 2013; Vastu võetud 11. novembril 2013; Avaldatud 9. jaanuar 2014; Akadeemiline toimetaja: Adair Santos

1. Sissejuhatus

Cistanche deserticola, mis on üks populaarsemaid traditsioonilisi Hiina taimseid ravimeid/tervisetooteid, on paljudes ajaloolistes Hiina ravimtaimede farmakopöades kirjeldatud kui vananemisvastaseid omadusi. Sellest tulenevalt on seda Hiinas laialdaselt kasutatud mitmesuguste vanusega seotud häirete, sealhulgas seniilse dementsuse, impotentsuse, viljatuse, krooniliste infektsioonide ja eakate vereloomehäirete raviks [1]. Kaasaegsed keemilised lähenemisviisid on võimaldanud eraldada kahte peamist tüüpi ühendeid, fenüületanoidglükosiide ja oligosahhariide, kui Cistanche deserticola peamisi toimeaineid [1]. Viimasel kümnendil on Cistanche deserticola't ja selle ekstrakte intensiivselt uuritud ning on näidatud, et need on võimelised kaitsma neuroneid neurotoksiinide põhjustatud vigastuste eest[2], inhibeerima süsiniktetrakloriidist põhjustatud hepatotoksilisust [2] ja soodustama luuüdirakkude taastumist. Kaasindutseeritud kiirguskahjustus [3]. Samuti on näidatud, et sellel on põletikuvastane, antioksüdant ja vananemisvastane toime [4]. Siiski, kas Cistanche deserticola võib pikendada eluiga ja millised on selle aluseks olevad molekulaarsed mehhanismid [3]Vananemisvastaneomadusi ei ole rangelt testitud.

Vananemisvastased Cistanche deserticola ekstraktid

Immuunsus, st immuunsüsteemi muutused koos vanusega, on taustaks, mille taustal on täheldatud eakate suurenenud vastuvõtlikkust infektsioonidele, vähile, neurodegeneratiivsetele haigustele ja autoimmuunhaigustele [5]. On teatatud, et terapeutilised sekkumised, nagu kalorite piiramine [6] ja E-vitamiini lisamine, on tõhusad immunosestsentsi progresseerumise edasilükkamisel ja seega mõnede vanusega seotud haiguste haigestumuse vähendamisel ning nii inimeste kui ka näriliste eluea pikendamisel. [7, 8]. Selle valdkonna uuringuid teeb aga keeruliseks asjaolu, et vananemist seostatakse samaaegse immuunpuudulikkuse ja kroonilise põletiku paradoksiga [9]. See tähendab, et lümfotsüütide vabanemise või põletikuvastase toime lihtne stimuleerimine ei kujuta endast ideaalset terapeutilist sekkumist vananemise ja vanusega seotud seisunditega tegelemiseks [10]. Järelikult peab selliste meditsiiniliste sekkumiste otsimisel, mis suudaksid ennetada või leevendada vanusega seotud haigusi, sealhulgas infektsioone, vähki, autoimmuunhaigusi, ateroskleroosi ja neurodegeneratiivseid haigusi, mis on peamised surma- ja puude põhjused, ning immuunsüsteemi defektide parandamisega kaasneda põletikulised reaktsioonid.

Vananemisega kiirendatud hiir [11] on AKR/J tüvest tuletatud inbred hiiremudel, mida kasutatakse laialdaselt vananemisuuringutes. Nende hiirte P8 alamtüvel (SAM-P8) on märkimisväärselt lühenenud eluiga võrreldes R1 alamtüvega (SAM-R1), millel on samuti aeglasem vananemisprotsess [12]. Paralleelselt enneaegse vananemisega ilmnevad SAM-P8 hiirtel ka suurenenud neuroloogiline vananemine, immunosestsents ja vanusega seotud vereloome defitsiit, mis jäljendavad täpselt inimese tüüpilisi vananemisomadusi [13, 14]. Kiirenenud vananemisprotsessi ja vanusega seotud häirete eest vastutavate mehhanismide analüüs näitab, et sellega on seotud mitokondriaalne düsfunktsioon [15], oksüdatiivne stress ja somaatilise DNA mutatsioonikiiruse suurenemine [16, 17]. See homogeense geneetilise taustaga hiiresüsteem on seega suurepärane eksperimentaalne mudel vananemise ja vananemisvastaste ravimite uurimiseks [12], mis on hoiustatud Hiinas Pekingi ülikooli farmaatsiateaduste kooli herbaariumis.

cistanche võib vananemisvastane

2. Materjalid ja meetodid

2.1. Materjalid.

VärskeCistanche deserticola YC MAkoguti Loode-Hiina erinevatest piirkondadest, sealhulgas Xinjiangi, Neimenggu ja Ningxia autonoomsed piirkonnad. Ekstraktide valmistamiseks kasutatud proovid kinnitas Pekingi ülikooli farmaatsiateaduste kooli loodusravimite osakonna farmakognoosia spetsialist professor Pengfei Tu. Kasutatud Cistanche deserticola (number CD-2007-03-08) vautšeri näidis oli Science Centeris (Peking, Hiina). Selle uuringu kiitis heaks Pekingi ülikooli loomade uurimiskomisjon ja see viidi läbi vastavalt Pekingi ülikooli laboriloomade hooldamise ja kasutamise juhistele. Nende hiirte sertifitseerimisnumber oli SCXK2001-2008. Hiiri hoiti keskkonnas standardsetes metaboolsetes puurides

C, 45–60 protsenti niiskust ja 12-tunnist valguse/pimeduse tsüklit) ning võimaldas vaba juurdepääsu toidule ja veele. Pärast 2-nädalast aklimatiseerumist jagati loomad viide rühma: 3 ECD-ga ravirühma, SAM-R1 kontrollrühm ja mitteravitud SAM-P8 kontrollrühm. Kolme ravirühma dieeti täiendati erineva kontsentratsiooniga ECD-ga segatud dieediga: madala (50 mg/kg), keskmise (150 mg/kg) ja kõrge (450 mg/kg) keskmise ECD doosiga päevas. . SAM-R1 ja SAM-P8 ravita kontrollrühmi toideti sama dieediga ilma ECDta. Kõikide loomade toidutarbimist mõõdeti kogu katse jooksul iga kolme päeva järel. Hiirte tervisliku seisundi määramiseks katse ajaks vererõhk ja südamekuud. Iga hiire eluiga oli elujõulised apoptootilised ja nekrootilised lümfotsüüdid kvantifitseeriti, kasutades anneksiin V-FITC komplekti (Beijing Biosea Biotechnology Co., Ltd., Peking, Hiina). Lümfotsüüdid värviti topelt fluorestseiini isotiotsüanaadiga konjugeeritud märgistatud anneksiin V-ga (Aneksiin V-FITC) ja suspendeeriti propiidiga 200 ui sidumispuhvris (10 mM HEPES/NaOH,

2.2 Cistanche deserticola (ECD) ekstraktide valmistamine ja HPLC analüüs.

Õhukuivatatud ja viilutatud Cistanche deserticola(2{1}} kg) pulbristati ja ekstraheeriti kaks korda 70% etanooliga 1 tund. Kasutatud taime/etanooli suhe oli esimesel ekstraheerimisel 1/6 (mass/mass) ja teisel ekstraheerimisel 1/4 (mass/mass). Kaks ekstrakti ühendati ja filtreeriti enne kontsentreerimist suhtelise tiheduseni 1,10–1,15 alandatud rõhul temperatuuril 60 °C. Seejärel kontsentraati vaakumis ja kuivatati ning saadud pulber oli Cistanche deserticola (ECD) ekstrakt, mida kasutati kogu selles uuringus. .

ECD komponente analüüsiti HPLC abil, nagu eelnevalt kirjeldatud [1]. Lühidalt, 100 mg ECD pulbrit lahustati 10.0 ml HO-s ja pärast filtreerimist süstiti HPLC-sse. HPLC analüüs viidi läbi vedelikkromatograafiasüsteemiga Agilent 1100 (Agilent Co., USA). Liikuv faas koosnes metanooli (A) ja 0,10% metanhappe (B) segust. Kasutati gradientkromatograafia programmi; see oli 26,5 protsenti (A) ja 73,5 protsenti (B) 0–7 minutiga, 26,5–29,5 protsenti (A) ja 73,5–70,5 (B) 8–10 minutiga ning 29,5 protsenti (A) ja 70,5 protsenti (B). ) 20–27 minutiga. Voolukiirust hoiti konstantsena 1,0 ml/min, süstimismaht oli 10 ml ja kolonni temperatuur hoiti 25 °C juures. Kolonni väljavoolu jälgimiseks ja kromatogrammide loomiseks kasutati UV-detektorit, mis oli seatud 330 nm peale.

Kuivatatud ja viilutatud Cistanche deserticola

Fenüületanoidglükosiidid ja cistanche oligosahhariidididentifitseeriti nende retentsiooniaegade ja neeldumisspektrite järgi. Kvantifitseerimine viidi läbi väliste standardsete kalibreerimiskõverate abil. SaagisCistanche deserticola ekstraktid(ECD) oli umbes 3,33 protsenti ja fenüületanoidide sisaldus oli 17,94 protsenti. Akteosiid ja ehhinakosiid olid selles fraktsioonis kaks peamist koostisosa, nende sisaldus oli vastavalt 3,80 protsenti ja 8,25 protsenti. Oligosahhariidid moodustavad 82 protsenti kogu ECD-st. ECD peamiste aktiivsete komponentide kontsentratsioonid on näidatud tabelis 1.

2.3 Loomade eluea analüüs.

See uuring on keskendunud selle uurimisele, kasCistanche deserticola ekstraktidon võimelised pikendama SAM-R1 hiirte eluiga, osteti Pekingi ülikooli tervishoiu laboratoorsest loomakasvatus- ja uurimiskeskusest SAM-P8 hiired ja muutsid nende immunosenstsentsi staatuse.

2.4. Statistiline analüüs.

Andmed on näidatud keskmiste väärtustena SD Erinevate rühmade võrdlus viidi läbi ühesuunalise ANOVA abil koos post hoc testiga. Eluea uuringus läbisid andmed Kaplan-Meieri ellujäämisanalüüsi, mis hõlmas nii Log-rank (Mantel-Cox) kui ka Gehan-Breslow-Wilcoxoni testide kasutamist. Statistiline analüüs viidi läbi, kasutades Windowsi sotsiaalteaduste statistilist paketti (SPSS, fosfaatpuhverdatud soolalahus (PBS, pH 7,4), mis sisaldas 0,01 protsenti naatriumasiidi ja allutati FCM analüüsile. Lümfotsüütide alampopulatsioone analüüsiti voolu järgi tsütomeetria, kasutades FACS Calibur voolutsütomeetrit (BD Biosciences, San Diego, CA, USA) ja BD CellQuest analüüsitarkvara. Chicago, IL) ning a on oluline.

Fenüületanoidglükosiidid ja cistanche oligosahhariidid

3. Tulemused

Arvestati väärtust, mis on väiksem kui 0,05.Perifeersete T-lümfotsüütide rakulise elujõulisuse hindamine anneksiin V-FITC ja PI topeltvärvimise ja FACS analüüsi abil. Pärast SAM-P8 hiirte toidulisandit kolme ECD annusega 4 nädala jooksul kinnitati loomad 12 tunniks ja seejärel tuimastati ning veri koguti ja analüüsiti.

3.1. Cistanche deserticola (ECD) ekstraktide potentsiaalsete aktiivsete komponentide analüüs. Nagu on näidatud tabelis 1, koosneb ECD peamiselt kahte tüüpi ühenditest, fenüületanoidglükosiididest ja oligosahhariididest. Fenüületanoidglükosiidides on tuvastatud ehhinakosiid, akteosiid ja 8-epilogaanhape, samas kui oligosahhariidides tuvastati ainult galaktitool.

3.2.CistanchedeserticolakbdO4ct mõju SAM-P8 hiirte keskmisele elueale. Selle ja järgnevate uuringute jaoks jagati kaheksakuused isased SAM-P8 hiired 4 rühma. Nende hulgas toideti ühte hiirte rühma normaalset dieeti ilma ECD-ta, ülejäänud 3 rühma on söönud eraldi toitu, mis sisaldas erinevas vahekorras ECD-d. Kõigis katsetes kasutati kontrollrühmana SAM-R1 alamtüve hiiri, kellel on ebanormaalne vananemisprotsess ja eluiga.

Võrreldes kontrollrühmaga SAM-R1, lühenes SAM-P8 hiirte keskmine eluiga oluliselt (joonis 1 (a);<0.001). although="" supplementation="" of="" diet="" with="" the="" low="" dose(50mg/kg)of="" ecd="" failed="" to="" produce="" a="" significant="" increase="" in="" life="" spanofsam-p8mice,="" at="" the="" medium="" (150="" mg/kg)and="" high(450="" mg/ml)="" supplementary="" doses="" there="" was="" a="" dose-dependent="" increase="" in="" life="" span="" (figures="" 1(a)and=""><0.05 0.0thatwasconfirmedby="" kaplan-meier="" survival="" analysis,="" which="" included="" use="" of="" both="" the="" log-rank="" (mantel-cox)="" and="" gehan-breslow-wilcoxon="">

3.3. Immunosenetsentsi pöördumine SAM-P8 hiirtel Cistanche deserticola (ECD) ekstraktide abil. Perifeersete naiivsete T-lümfotsüütide arvu vähenemine ja samaaegne perifeerse mälu T-lümfotsüütide arvu suurenemine on immunosestsentsi silmapaistvad tunnused, mida peetakse laialdaselt vanusega seotud immunoloogiliste kõrvalekallete peamisteks põhjusteks. See immunosentsents SAM-P8-s võrreldes SAM-R1-ga

aniftalsv0ilmselge, kui FACS-analüüs pidi loetlema (CD3 pluss CD44wCD4Bigh) lümfotsüüdid kui naiivsete T-rakkude näitaja ja (CD3 pluss CD44gh CD45 BR lümfotsüüdid on mälu T-rakkude sanindikaator. Seega perifeerses veres Joonis 2) ja põrnarakud (Joonis 3) SAM-P8 hiirtel täheldati naiivsete T-rakkude populatsiooni vähenenud taset ja suurenenud mälu T-rakkude taset Leiti, et SAM-P8 hiirte toitumise täiendamine ECD-ga suudab need immunosenstsentsi näitajad annuses ümber pöörata. sõltuv mood nii perifeerse vere (joonis 2) kui ka põrnarakkude (joonis 3) populatsioonides. Immunosetsentsi vananemise pöördumise täiendava indikaatorina ECD toidulisandite tõttu on looduslike tapjarakkude [18] tase, kaasasündinud immuunsüsteemi peamine rakuline marker See näitas, et ECD dieedi lisamine põhjustas annusest sõltuva NK (CD3 pluss CD49 plus) rakkude arvu suurenemise nii perifeerses veres (joonis 4) kui ka põrnarakkudes (joonis 5) lümfotsüütide populatsioonis.

3.4. Cistanche deserticola ekstraktid tugevdavad Sca{2}} positiivsete rakkude suhtelist fluorestsentsi intensiivsust SAM-P8 hiirtel. Tüviraku antigeen-1(Sca-1) on üks silmapaistvamaid vereloome tüvirakkude (HSC) biomarkereid luuüdi rakupopulatsioonides. Sca-1 positiivsed rakud esindavad ka lümfotsüütide eellasi, millel on äsja eksporditud luuüdist perifeersesse verre, kus need läbivad.

Joonis 2: ECD-ga toidulisandite mõju FACS-analüüs, mis puudutab naiivset ja mälu Tlümfotsüüdi perifeerset vere. Kaheksakuused isased SAM-P8 ja kontroll-SAM-RI hiired jagati 5 rühma. SAM-P8 loomade kolme ravirühma toideti nelja nädala jooksul dieediga, millele lisati ECD madalad (100 mg/kg), keskmised (500 mg/kg) ja suured (2500 mg/kg) doosid, ning kahte kontrolllooma.

CD3 pluss Tcel-ide gatingi abil. Jooned, mida ei ole näidatud ühest plokist, näitavad künniseid, mida kasutatakse CD44x* ja CD45 eristamiseks naiivsete (CD3 pluss Cp b"C4RB→) ja mälu (CD3 pluss CD4hCD 4Bl) T-rakkude täielikuks madalaks identifitseerimiseks. b) Histogrammi rühmad toideti samal dieedil ilma toidulisandita. Pärast 12-tunnist paastumist koguti anesteseeritud RB T-rakkude alamhulkade loomadelt perifeerne veri ja analüüsiti FACS-i, nagu on kirjeldatud jaotises 5. （a） Erinevate rühmade FACS-diagrammid genereerisid naiivsete T-rakkude protsendi. erinevate loomarühmade perifeerses veres. (c) Histogramm, mis näitab mälu T-rakkude protsenti erinevate loomarühmade perifeerses veres. Tulbad näitavad keskmist ± SD (igas rühmas,=10).<0.05sam-p8versus>

Joonis 3: ECD-ga toidulisandi lisamise mõju ja mälu FACS-analüüs Tlümfotsüüdid põrnas. Kaheksakuused isased SAM-P8 ja kontroll-SAM-RI hiired jagati 5 rühma. SAM-P8 loomade kolme ravirühma toideti nelja nädala jooksul toidulisanditega. väikeste (100 mg/kg), keskmiste (500 mg/kg) ja suurte (2500 mg/kg) ECD annustega ja kahe kontrollrühmaga CD3 pluss T-rakkudega. Igal graafikul näidatud jooned näitavad, et neid tuleks kasutada CD44zh ja CD45 bw eristamiseks, mida kasutatakse naiivsete (CD3 pluss CD "CsRB动") ja mälu (CD3 pluss CD42CD I'm) Tcelide tuvastamiseks. (b) Histogrammi näitamine toideti Pärast 12-tunnist paastumist koguti põrna lümfotsüüdid tuimestatud RB T-rakkude alamhulkade loomadelt ja neile viidi läbi FACS-analüüs, mida on kirjeldatud jaotises 5. (a) Loodi erinevate mikrofonide rühmade tüüpilised FACS-diagrammid.

Joonis 4: ECD-toidulisandite mõju looduslikele tapjarakkudele (NK-rakud, CD3 pluss CD49 pluss T-rakud) SAM-P8 hiirte perifeerse vere lümfotsüütide populatsioonides. Kaheksakuused isased SAM-P8 ja kontroll SAM-RI hiired jagati 5 rühma. SAM-P8 loomade kolme ravirühma toideti nelja nädala jooksul dieediga, millele lisati ECD väikesed (100 mg/kg), keskmised (500 mg/kg) ja suured (2500 mg/kg) doosid ning kaks kontrollrühma olid sama dieet ilma toidulisandita. Pärast 12-tunnist paastumist koguti anesteseeritud loomadelt perifeerne veri ja viidi läbi FACS-analüüs, nagu on kirjeldatud jaotises 5. (a) Erinevate hiirerühmade esinduslikud FACS-diagrammid, mis saadi CD3 pluss CD49 pluss T-rakkude väravaga. (b) Histogramm, mis näitab erinevate loomarühmade loomuliku tapja T-rakkude protsenti perifeerses veres. Tulbad tähistavad keskmist ± SD (iga rühm, =10).=<0.01><0.01 each="" treatedgroup="" versussam-p8group="" (byone="" way="" anovawith="" post="" hoc="">

Joonis 5: ECD toidulisandite mõju looduslikele tapjarakkudele (NK-rakud, CD3 pluss CD49 pluss T-rakud) SAM-P8 hiirte põrna lümfotsüütides. Kaheksakuused isased SAM-P8 ja kontroll SAM-RI hiired jagati 5 rühma. SAM-P8 loomade 3 ravirühma toideti nelja nädala jooksul dieediga, millele lisati ECD väikesed (100 mg/kg), keskmised (500 mg/kg) ja suured (2500 mg/kg) doosid ning kahte kontrollrühma looma. toidetakse sama dieediga ilma lisatoiduta. Pärast 12-tunnist paastumist koguti tuimestatud loomadelt põrna lümfotsüüdid ja viidi läbi FACS-analüüs, mida on kirjeldatud jaotises 5.(a) Erinevate hiirte rühmade esinduslik FACS-plokid, mis saadi CD3 pluss CD494 T-rakkude väravaga.(b) Histogramm, mis näitab loomuliku tapja T protsenti. rakud erinevate loomarühmade põrna lümfotsüütides. Tulbad näitavad keskmist SD (igas rühmas,=10), # < 0,01="" sam-p8="" yersus=""><0.01 eachtreatedgroup="" versussam-p8group(by="" oneway="">

Edasine diferentseerimine erinevat tüüpi küpseteks lümfotsüütideks. Järelikult on need Sca{0}}-positiivsed rakud perifeerses veres naiivsete T-lümfotsüütide peamist allikat. Joonis 6 näitab, et võrreldes SAM-R1 kontrollhiirtega oli Sca-1 positiivsete rakkude suhteline fluorestsentsi intensiivsus SAM-P8 hiirtel oluliselt madalam. Näidati, et SAM-P8 hiirte dieedi lisamine kolme erineva ECD annusega suurendab oluliselt Sca-1 positiivsete rakkude suhtelist fluorestsentsi intensiivsust (joonis 6).

Tistanche ürdi eelised: vananemisvastane