1. osa: Osteoporoosi ja Alzheimeri tõve samaaegse eksperimentaalse mudeli loomine rottidel ning ehhinakosiidi ja akteosiidi kahekordne toime Cistanche Tubulosast

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Yi Chen, Ying-Qi Li, Jia-Yi Fang, Ping Li, Fei Li

ABSTRAKTNE

Etnofarmakoloogiline tähtsus: Cistanche tubulosaon hinnaline traditsiooniline Hiina meditsiin, mida on laialdaselt kasutatud osteoporoosi jaAlzheimeri tõbi. ehhinakosiidja akteosiid on Cistanche tubulosa peamised aktiivsed komponendid, millel on teadusliku väärtusega farmakoloogiline toime. On teatatud, et ehhinakosiid jaakteosiidvõib parandada õppimis- ja mäluvõimet, soodustada osteoblastide vohamist ja diferentseerumist. Uuringu eesmärk: ehhinakosiid ja akteosiid alatesCistanche tubulosaon näidanud märkimisväärset osteoporoosi ja Alzheimeri tõve vastast toimet, samas kui neid toimeid ei ole rotimudelis samaaegselt uuritud. Selle uuringu eesmärk oli luua ja kontrollida osteoporoosi mudelit koosAlzheimeri tõbirottidel ja uurida kahekordset mõjuehhinakosiidja akteosiid sellel samaaegsel mudelil.

Materjalid ja meetodid:Samaaegselt määrati kolm ovariektoomia (OVX), näidisoperatsiooni D-galaktoosi ja AlCl3 (D), munasarjade eemaldamise D-galaktoosi ja AlCl3 (OVX pluss D) mudelrühma. Ravirühmades olevatel rottidel eemaldati munasarjad. D-galaktoosi intraperitoneaalse süstimise ja AlCl3 intragastraalse manustamise ajal ravimiravi rühmade rottidele manustati rottidele suukaudseltehhinakosiid(90 mg/kg/päevas),akteosiid(90 mg/kg/päevas) ja positiivsed kontrollravimid östradioolvaleraat (0.6 mg/kg/d), donepesiil HCl (0,8 mg/kg/päevas). Pärast 8-nädalast ravimiravi viidi esmalt läbi 6-päevane Morris Water Maze'i (MWM) test. Seejärel ohverdati rotid vere, emaka, reieluu, sääreluu ja ajukude kogumiseks. Seerumit kasutati biokeemilisteks testideks. Emakaid kasutati histomorfomeetria jaoks. Parempoolset reieluu kasutati mikro-CTja histomorfomeetria vastavalt. Biomehaanilises testis kasutati paremat sääreluu. Jääkastile kogutud hipokampust kasutati biokeemilisteks katseteks. Histomorfomeetria jaoks kasutati perfusiooni teel kogutud aju 41.

Tulemused:Võrreldes Shami rühmaga võib OVX pluss D rühm märkimisväärselt vähendada õppimis- ja mäluvõimet, põhjustades oksüdatiivseid kahjustusi, kahjustades hipokampuse neuroneid ning mõjutades atsetüülkoliini hüdrolüüsi ja sünteesi. Vahepeal suurenes BALP ja TRAP aktiivsus OVX pluss D rühmas oluliselt (P<0.001) as="" compared="" to="" the="" sham="" group.="" in="" addition,="" compared="" with="" the="" sham="" group,="" the="" mean="" bone="" mineral="" density="" obviously="" decreased=""><0.05), the="" trabecular="" bone="" mass="" and="" microarchitecture="" were="" also="" destroyed="" significantly="" in="" the="" ovx+d="" group.="" furthermore,="" the="" maximum="" load="" and="" maximum="" stress="" significantly="" reduced=""><0.01) and="" the="" energy="" 50="" absorption="" also="" decreased="" greatly="" as="" compared="" to="" the="" sham="" group.="" after="" being="" administrated="" with="">ehhinakosiidjaakteosiid, osteoporoosi tüüpilised patoloogilised tunnused jaAlzheimeri tõbiparanesid.

Järeldused:Osteoporoosi mudel kombineeritunaAlzheimeri tõbirottidel oli teostatav ja edukalt kindlaks tehtud.ehhinakosiidja akteosiidil oli sellele samaaegsele mudelile ka mõningaid olulisi mõjusid ning need võivad olla potentsiaalsed 56 kandidaatiCistanche tubulosakahekordse mõjuga edasiseks uurimiseks.

Märksõnad:osteoporoos; Alzheimeri tõbi; kahekordne toime; ehhinakosiid; akteosiid; Cistanche tubulosa

CIstanche kaotatud impeeriumi ravimtaimed leevendavad Alzheimeri tõbe

1. Sissejuhatus

Osteoporoos on degeneratiivne luuhaigus, mida iseloomustab luumassi progresseeruv kadu ja mikroarhitektuuri hävimine, mis võib suurendada haprusmurdude riski (Rachner et al., 2011).Alzheimeri tõbi(AD) on eakate tavaline neurodegeneratiivne haigus, mida iseloomustab pidev vaimne allakäik, kognitiivsed häired ja iseseisva eluvõime kaotus kliiniliselt (Reitz 76 et al., 2011). Amüloidi ladestumisest põhjustatud seniilse naastu moodustumine, tau hüperfosforüülimisest põhjustatud neurofibrillaarsed puntrad ja neuronite degeneratsioon ajus on AD tüüpilised patoloogilised tunnused (Serrano-Pozo et al., 2011). Pealiskaudselt on OP ja AD täiesti iseseisvad haigused, millel on erinev patoloogia ja kliinilised tunnused. Siiski täheldatakse kliinilises praktikas sageli OP ja AD koos esinemist (Zhang et al., 2001; Lui et al., 2003; Luckhaus jt, 2009). Mõlema haiguse levimus suurenes vanuse kasvades, eriti postmenopausis naistel (Li et al., 2017; Stern, 2012). Üha rohkem tõendeid näitas, et inimestel, kellel on diagnoositud AD, on suurenenud OP risk (Zhou et al., 2014).

On vaja uurida ja selgitada seoseid osteoporoosi jaAlzheimeri tõbiin vitro ja in vivo. Enne in vivo uuringute läbiviimist on oluline valida sobivad osteoporoosi või Alzheimeri tõve loommudelid. Osteoporoosi mudelit saab luua mitut tüüpi meetoditega, nagu retinoehappe intragastriline manustamine, munasarjade eemaldamise operatsioon ja glükokortikoidide intramuskulaarne süstimine (Wei et al., 2007; Komori, 2015). Eelkõige oli rottidel munasarjade eemaldamisega indutseeritud menopausijärgne osteoporoosi mudel klassikaline jaon laialdaselt kasutatud enamikes uuringutes (Miao et al., 2012; Liu et al., 2017).Sporaadiline Alzheimeri tõbi on Alzheimeri tõve peamine tüüp. Loommudelid sporaadilisedAlzheimeri tõbivõib esile kutsuda erinevate meetoditega, näitekssüsti D-galaktoosi või -amüloid, AlCl intragastriline manustamine3,ja nii edasi(Bagheri et al., 2011; Gao jt, 2015; Justin Thenmozhi jt, 2017). Lisaks onPikaajalise intraperitoneaalse indutseeritud Alzheimeri tõve konjunktsioonimudelSamuti on palju uuritud D-galaktoosi süstimist koos munasarjade eemaldamisega (Liuet al., 2010; Zhao jt, 2012). Selleks, et paljastada osteoporoosi jaAlzheimeri tõve korral on vaja luua kombineeritud osteoporoosi mudelAlzheimeri tõvega, et uurida ravimite levinumaid mehhanismeosteoporoos jaAlzheimeri tõbiase.

Cistanche tubulosa(Schenk) Wight on parasiitaim, mis on levinud peamiselt Loode-Hiina kõrbetes. Kuivatatud mahlakad varredCistanche tubulosa(CT) kasutatakse kuulsa toonikuravimina Cistanches Herba ja Hiina farmakopöas (2015) selle hiina nimega Roucongrong. Seda on tunnustatud kui "kõrbete ženšenni" ning seda kasutatakse traditsioonilises hiina meditsiinis laialdaselt talje- ja põlvevalude, naiste steriilsuse ja kõhukinnisuse raviks (Jiang ja Tu, 2009). CT peamised aktiivsed komponendid on fenüületanoidglükosiidid (PhG), ehhinakosiid (ECH) jaakteosiid(ACT) on PhG-de tüüpilised ühendid (Morikawa et al., 2014). Eelkõige valitakse ECH ja ACT tavaliselt CT kvaliteedikontrolli markeriteks nende suure sisalduse ja mitmesuguste farmakoloogiliste toimete tõttu, nagu neuroprotektsioon, luu kaitse,

antioksüdandid, vananemisvastased ning õppimis- ja mäluvõime parandajad (Wang et al.,2012; Li et al., 2016). Kuid ECH ja ACT mõju osteoporoosilekoosAlzheimeri tõbiei olnud veel koos rotimudelis uuritud.Seega oli selle uuringu eesmärk luua kombineeritud osteoporoosi roti mudelAlzheimeri tõvega ja uurige selle mõjuehhinakosiidja selle kohta akteosiidisamaaegne mudel, et pakkuda eksperimentaalseid tõendeid selle edasiseks uurimiseksehhinakosiidi või akteosiidi molekulaarset mehhanismi järgmistes uuringutes.

cistanche pharma erilinejaoksAD

2. Materjalid ja meetodid

2.1. Loomad

Kaheksakümmend 8-nädalast emast Wistari rotti (sertifikaadi number: SCXK 2018-0006), kaaluga 180–200 g, saadi Sino-British SIPPR/BK Labist. Animal Ltd (Shanghai, Hiina) ja üles kasvanud Hiina farmaatsiaülikooli farmaatsialoomade katsekeskuses.

2.2. Kemikaalid ja reaktiivid

Kloraalhüdraat, penitsilliin G naatrium, D-galaktoos, alumiiniumkloriid heksahüdraat, östradioolvaleraat, donepesiil HCl osteti ettevõttelt Aladdin Industrial Corporation (Shanghai, Hiina).ehhinakosiid(HPLC 94 protsenti) saadi firmalt Chengdu Wecistanche Bio-Technology Co., Ltd. (Chengdu, Hiina).Akteosiid(HPLC 98 protsenti) osteti ettevõttelt Baoji Herbest Bio-Tech Co., Ltd. (Baoji, Hiina). Luuspetsiifilise aluselise fosfataasi (BALP), tartraadiresistentse happelise fosfataasi (TRAP), superoksiiddismutaasi (SOD), malonaldehüüdi (MDA), atsetüülkoliinesteraasi (AChE) ja koliinatsetüültransferaasi (ChAT) ensüümiga seotud immunosorbentanalüüsi (ELISA) komplektid olid ostetud ettevõttelt Shanghai Enzyme-linked Biotechnology Co., Ltd. (Shanghai, Hiina). Universaalne koefiksaator saadi ettevõttestChengdu Wecistanche Bio-Technology Co., Ltd. (Chengdu, Hiina).

ehhinakosiid

2.3. Loomade mudelid ja ravi

Kõiki loomkatseid lubas ja kontrollis Hiina Farmaatsiaülikooli loomaeetika komitee. Rotte hoiti 12-tunnise valguse/pimeduse tsükliga kontrollitud temperatuuriga ruumis (22 ± 2 kraadi) ja neid toideti standardse granuleeritud sööda ja kraaniveega.

Pärast ühenädalast kohanemist saavutati osteoporoosi mudel munasarjade eemaldamise operatsiooniga (French et al., 2008). Pärast operatsiooni lõppu piserdati infektsiooni vältimiseks haavaõmblusele üks kord naatriumpenitsilliin G. Seejärel toideti rotte kolm nädalat normaalselt. Viite kohaselt (Hua et al., 2007; Alawdi et al., 2017) on mudelAlzheimeri tõbivõib indutseerida D-galaktoosi pikaajalise intraperitoneaalse süstimisega koos munasarjade eemaldamisega või AlCl3 pikaajalise intragastraalse manustamisega. Alzheimeri tõvega kombineeritud osteoporoosi mudeli teostatavuse uurimiseks kasutati kolme ovariektoomia (OVX rühm), näidiskirurgia intraperitoneaalse süstiga 150 mg/kg/päevas D-galaktoosi ja 30 mg/kg/päevas AlCl3 intragastraalset manustamist. Selles uuringus määrati ovariektoomia intraperitoneaalse süstimisega 150 mg/kg/päevas D-galaktoosi ja 30 mg/kg/päevas AlCl3 intragastraalse manustamisega (OVX pluss D rühm).

Seetõttu jagati rotid 3 nädala pärast juhuslikult kaheksasse rühma (n{{0}} iga rühma kohta) ja neile manustati suukaudselt ravimeid 8 nädala jooksul: võltsrühm; OVX rühm; D rühm; OVX pluss D rühm; östradioolvaleraatravi rühm (EV rühm, OVX pluss D pluss 0,6 mg/kg/d östradioolvaleraat); donepesiil HCl ravirühm (DPZ rühm, OVX pluss D pluss 0,8 mg/kg/päevas donepesiil HCl);ehhinakosiidravirühm (ECH rühm, OVX pluss D pluss 90 mg/kg/päevas ehhinakosiid);akteosiidravirühm (ACT rühm, OVX pluss D pluss 90 mg/kg/päevas akteosiid). Vastavalt inimese ja roti ekvivalentdoosi teisendamise põhimõttele ja sellega seotud võrdlusdokumendile (Li et al., 2013; Gao et al., 2014) võeti selle uuringu uimastiravirühmade annused vastu.

Iga roti kehakaalu mõõdeti igal nädalal. Pärast kogu 8 nädalat kestnud ravi ravimitega viidi esmalt läbi 6-päevane Morris Water Maze (MWM) test. Pärast seda ohverdati materjalide kogumiseks igast rühmast 6 rotti. Rotid anesteseeriti intraperitoneaalse süstiga 3.0 ml/kg 10% kloraalhüdraati ja veri koguti kõhuaordist. Veri pandi toatemperatuurile hüübima ja tsentrifuugiti kiirusel 3500 p/min 10 minutit. Seerum koguti 1,5 ml tsentrifuugituubi (NEST Biotechnology) ja säilitati -80 kraadi juures, kuni seda kasutati biokeemilistes testides. Seejärel koguti emakas, reieluu, sääreluud ja ajukude. Emakaid kasutati histomorfomeetria jaoks. Parempoolset reieluu kasutati vastavalt mikro-CT ja histomorfomeetria jaoks. Biomehaanilises testis kasutati paremat sääreluu. Jääkastile kogutud hipokampust kasutati biokeemilisteks katseteks. Pärast seda perfundeeriti iga rühma ülejäänud kolm rotti südamest soolalahuse ja universaalse koefiksaatoriga, et koguda aju histomorfomeetria jaoks.

2.4. Morrise veelabürindi (MWM) test

Rottidele viidi pärast 8-nädalast sekkumist MWM testis läbi ruumiline võrdlusõpe ja mälu testimine. MWM-test viidi läbi, järgides varem kirjeldatud meetodeid (Morris, 1984; Gao et al., 2016). Lühidalt, 5 järjestikust päeva nelja katsega päevas treeniti rotte kasutama mitmesuguseid basseini seinal asuvaid visuaalseid näpunäiteid, et leida ringikujulisest basseinist (läbimõõt 130 cm) peidetud sukelplatvorm (läbimõõt 11 cm, kõrgus 29 cm, kõrgus 50 cm) täidetud mittetoksilise süsiniktindiga toonitud veega. Bassein oli mõtteliselt jagatud neljaks kvadrandiks ja neli stardikohta asusid kvadrantide ristumiskohtades. Platvorm asus ühe kvadrandi keskel ja asend oli katsete ajal konstantne. Igas katses paigutati rotid juhuslikult valitud kohtadesse, näoga basseini seina poole. Iga katse lõpetati, kui rott jõudis platvormile või 60 sekundi pärast, ja kulunud aeg registreeriti põgenemislatentsina. Rotid, kes ei jõudnud platvormile, juhatati sellele. Pärast iga varjatud platvormi katset jäi rott platvormile 10 sekundiks. Treeningutulemustena arvutati nelja katse keskmine latentsusaeg päevas. 6. päeval tehti kõigi rottidega sondikatse, mille käigus nad ujusid 60 sekundit ilma platvormita basseinis. Lõpptulemustena registreeriti platvormi asukoha ületamise ajad ja sihtkvadrandis reisimise aeg. Rotte jälgiti otse basseini kohale lakke paigaldatud kaameraga ning kõik katsed salvestati ja analüüsiti programmi MORRIS MAZE abil, mida tarnib Beijing zhongshidichuang science and Technology Development Co., Ltd. (Peking, Hiina)

2.5. Biokeemiline test ELISA abil

Vastavalt ELISA komplektide tootja juhistele testiti BioTek Synergy abil luu-spetsiifilise aluselise fosfataasi (BALP) aktiivsust, tartraadiresistentset happefosfataasi (TRAP), superoksiiddismutaasi (SOD) aktiivsust ja malondialdehüüdi (MDA) sisaldust seerumis. 2 mitmerežiimilist mikroplaadi lugejat (BioTek, USA). Iga rühma hipokampuse kudesid pesti PBS-iga (0,01 M, pH 7,4), et eemaldada koe pinnale jäänud veri või lisandid. Ühe külje hipokampuse kuded kaaluti ja lõigati seejärel võimalikult väikesteks tükkideks. Hipokampuse kuded homogeniseeriti vastavalt suhtele 1:9 (koe mass: PBS maht). Homogenaati tsentrifuugiti 4 kraadi juures 3000 p/min 15 minutit. Supernatant koguti ja lahjendati, et mõõta valgu kontsentratsiooni BCA meetodil. Seejärel testiti atsetüülkoliinesteraasi (AChE) aktiivsust, koliinatsetüültransferaasi (ChAT) aktiivsust, superoksiidi dismutaasi (SOD) aktiivsust ja malondialdehüüdi (MDA) sisaldust hipokampuse koes ELISA meetoditega.

2.6. Hipokampuse histomorfomeetria

Ajukoed (n=3/rühm) fikseeriti universaalses koefiksaatoris. Seejärel pesti ajukoe proove, dehüdreeriti gradient-etanooliga, lisati parafiinvahaga ja viilutati 5 μm suurusteks koronaalsektsioonideks. Sektsioonid värviti hematoksüliini ja eosiiniga (HE). Pärast seda pildistati ajukudede koronaalseid lõike ümberpööratud fluorestsentsmikroskoobiga (Nikon, Jaapan). Eriti täheldati CA1, CA2, CA3 ja DG morfoloogilisi muutusi hipokampuses.

2.7. Emaka histomorfomeetria ja morfomeetria

Valitud emakas (n{{0}}/rühm) fikseeriti universaalses koefiksaatoris. Seejärel pesti emakakoe proove, dehüdreeriti gradiendiga etanooliga, sisestati parafiinvahaga ja viilutati 5 μm ristlõikega. Sektsioonid värviti hematoksüliini ja eosiiniga (HE). Vaadeldi ja pildistati emaka põikilõike. Juhuslikult valiti viis vaatevälja, seejärel mõõdeti Image-Pro Plus 6.0 tarkvara abil emaka põikilõike läbimõõt ja emaka limaskesta epiteeli paksus. Samuti loendati emaka näärmete arv lamina proprias.

2.8. Mikro-CT

Valitud parempoolne reieluu (n=3/rühm) skaneeriti SkyScan 1176 micro X- abil kohas, kus objekti kaugus allikast oli 121 mm ja kaamera kaugus allikast 171 mm. kiirkompuutertomograafia (mikro-CT) skanner (Bruker, Saksamaa). Võrdluspinnaks valiti distaalne kasvuplaat. 1 mm kaugusel võrdluspinnast valiti huvipakkuvaks mahuks 1, 8 mm paksune piirkond (VOI, 100 kihti). Saadud halltoonides kujutiste pikslite suurus luu rekonstrueerimisest oli 17, 76 μm (65 kV, 385 μA). Trabeekulite valimiseks kortikaalsest luust kasutati poolautomaatset kontuurimismeetodit. Otseseid 3D-mõõtmismeetodeid kasutati luumahu (BV/TV), luu pinnatiheduse (BS/TV), trabekulaarse eraldumise (Tb. Sp), trabekulaararvu (Tb. N), trabekulaarse paksuse (Tb. Th) protsendi hindamiseks. , struktuurimudeli indeks (SMI), trabekulaarse mustri faktor (Tb. Pd) ja keskmine luu mineraalne tihedus (keskmine BMD) sama VOI puhul, kasutadesCTAnalüsaatoriprogramm (Bruker, Saksamaa). VOI 3D visualiseerimine adaptiivse renderdusalgoritmi abil viidi läbi tarkvaraga CTvol (Bruker, Saksamaa).

cistanche taimeekstrakt

2.9. Luu histomorfomeetria

Valitud parempoolne reieluu (n=3/rühm) fikseeriti universaalses koefiksaatoris ja seejärel dekaltsifitseeriti 10% EDTA-2Na lahuses 3 nädala jooksul. Katlakivi eemaldatud proovid pesti, dehüdreeriti gradiendiga etanooliga, sisestati parafiinvahaga ja viilutati 5 μm pikisuunalisteks osadeks. Sektsioonid värviti hematoksüliini ja eosiiniga (HE). Reieluu pikilõiked pildistati. Täheldati iga rühma luukoe struktuure, eriti trabekulaarseid luustruktuure.

2.10. Biomehaaniline test

Juhuslikult valitud parempoolseid sääreluu (n=4/rühm) hinnati kolmepunktilise painutuskatse jaoks, kasutades universaalset testimismasinat (SHIMADZU, Jaapan). Nende proovide läbimõõdud mõõdeti noonuse nihikuga vahemikus 2.16-2.38 mm (d). Seejärel asetati proov kahele toetavale risttalale, mille kahe siini vaheline kaugus oli 25 mm (L), ja proovi füsioloogiline kumerus oli ülespoole. Koorma laadimisvarras asus proovi keskel ja langes konstantse kiirusega 1,5 mm/min, kuni proov purunes. Jõu (F) ja nihke andmed salvestati automaatselt arvutisse, mis liideti testimismasinaga, ja koormuse-deformatsiooni kõver joonistati samaaegselt. Maksimaalse koormuse (N) ja energia neeldumise (mJ) väärtused registreeriti materjalide testimise tarkvaraga TRAPEZIUM X samaaegselt. Maksimaalse pinge (MPa) väärtused arvutati järgmise valemi järgi: pinge (σ)=paindemoment (M) / lõiketegur (Z)=(8×L×F) / ( π × d3 )

2.11. Statistiline analüüs

Mudelrühmade tulemusi võrreldi võltsrühmaga ja ravimitega ravitud rühmade tulemusi OVX pluss D rühmaga. Andmeid analüüsiti ühesuunalise ANOVA abil, millele järgnes Bonferroni mitmekordne võrdlustest, kasutades Graph Pad Prism 5.{3}} tarkvara. Andmed väljendati kui keskmine ± SD ja P väärtused alla 0,05 loeti statistiliselt oluliseks.

müritsetiinjacistanche

KLIKI SIIA, ET 2. OSA