1. osa: Cistanche Tubulosa vesiekstrakti mõju soolehaigustega hiirte soolestiku mikrobiootale

Palun võtke ühendustoscar.xiao@wecistanche.comrohkem informatsiooni

Soolestiku mikrobiota häired on seotud paljude haigustega. *e vesiekstrakt alatesCistanche tubulosa (CT), traditsiooniline Hiina taimne valem, on väidetavalt mänginud rollikaitstes inimese soolestikku. Selle mõjust soolestiku mikrobiootale on aga vähe teada. *Käesolev uuring viidi läbi selleks, et teha kindlaks, kas CT vesiekstrakt võib moduleerida soolestiku mikrobioomi soolehäiretega hiirtel. Leidsime, et kahjustatudsoolestiku morfoloogiatsefiksiimiga töötlemisest tekkinud kahjustusi saab päästa CT vesiekstrakti abil. * CT-ekstraktiga ravitud hiirte ja kontrollhiirte mikroobide mitmekesisuse võrdlus näitas ka, et mudelrühmade mikrobioomikoosluse häiret saab taastada, kui ravida vesiekstrakti kõrge ja keskmise kontsentratsiooniga. Ravi tsefiksiimiga tõi kaasa piimhappebakterite arvu olulise vähenemise; CT vesiekstrakti lisamine taastas aga nende piimhappebakterite kasvu. Lisaks suutis CT vesiekstrakt leevendada dramaatilisi muutusi soolestiku mikrobiomi metaboolsetes radades, mis on põhjustatud tsefiksiimist. *Need leiud andsid ülevaate CT vesiekstrakti kasulikust mõjust soolestiku mikrobiootale ja andsid ka olulise viite sarnaste ravimite väljatöötamiseks tulevikus.

Cistanche soolte lõõgastamiseks, klõpsakesiinrohkem teada saada

Sissejuhatus

on näidanud, et C.deserticola polüsahhariididindutseerida melanogeneesimelanotsüüdid, vähendab oksüdatiivset stressi[15], leevendab kognitiivset düsfunktsiooni, reguleerides antioksüdantseid ja põletikuvastaseid protsesse rottidel [16], kaitseb PC12 rakke OGD/RP-indutseeritud vigastuste eest [17], suurendab ehhinakosiidide imendumist in vivo ja mõjutab soolestiku mikrobiotat [16]. 18]. Probiootikumid on elusad mittepatogeensed mikroorganismid, millel on piisavas koguses manustamisel kasu tervisele ja mis tagavad mikroobide tasakaalu seedetraktis [19]. *ey võib tugevdada mittespetsiifilisi rakulisi immuunvastuseid, mida iseloomustab makrofaagide, looduslike tapjarakkude (NK) ja antigeenispetsiifiliste tsütotoksiliste T-lümfotsüütide aktiveerimine ning erinevate tsütokiinide vabanemine tüvespetsiifilisel ja annusest sõltuval viisil [20]. Probiootilised tüved parandavad sooleepiteeli omadusi TJ modulatsiooni kaudu ning on näidatud, et spetsiifilised probiootilised tüved reguleerivad mutsiini ekspressiooni, mõjutades seeläbi limakihi omadusi ja reguleerides kaudselt soolestiku immuunsüsteemi [21]. Piimhappebakterite (LAB) ja Bifidobacterium tüved on peamised probiootikumid, mida on kasutatud paljudes valdkondades [22–26]. *Nende tervisega seotud eelised on arvukad, kuna nende antioksüdantne võime on nende tervisega seotud funktsioonide oluline tegur[27]. Probiootikumid võivad kelaatida metalliioone, et vältida nende oksüdatsiooni katalüüsimist [28, 29]; Samuti võivad nad suurendada antioksüdantsete ensüümide ekspressiooni [30, 31], toota erinevaid antioksüdantse aktiivsusega metaboliite [32, 33], vahendada antioksüdantide signaaliülekandeteid [34–36] ning reguleerida ensüüme, mis toodavad reaktiivseid hapnikuliike (ROS) ja soolestiku reaktsioone. mikroorganismid oksüdatiivsele stressile[37]. Hiljutine uuring näitas, et CD polüsahhariidid võivad stimuleerida mõnede piimhappebakterite kasvu, mis võib olla kasulik inimeste tervisele [38]. Siiski on polüsahhariidide sisaldus CD-s erinev CT omast [7, 39] ja see erinevus võib põhjustada soolestiku mikroorganismides erinevaid mõjusid. Veelgi enam, kuigi CD polüsahhariidid võivad vähendada oksüdatiivset stressi, aktiveerides NRF2/HO-1 rada [15], võib üksikute polüsahhariidide toime erineda mitme kompositsiooni üldmõjust CT-s. *meie jaoks on vaja täpselt määratleda CT vesiekstraktide mõju soolestiku mikroorganismidele. Lisaks suudavad fännid seista vastu ka oksüdatiivsele stressile [40] ja pärssida lipolüsahha põhjustatud põletikulisi reaktsioone, aktiveerides Keap1/Nrf2/HO-1 raja [41]. *enne on CT vesiekstrakti toime määramine väga väärtuslik. Lisaks viitab CD vesiekstrakti teatud koostisosade mõju oksüdatiivsele stressile ja soolefloorale sellele, et resistentsus oksüdatiivse stressi suhtes võib olla korrelatsioonis soolefloora muutustega. Selleks, et täita lüngad teadmistes ülalmainitud teemade kohta, uurisime CTaqueous ekstrakti mõju soolestiku mikrobiootale sooleflloora häiretega hiirtel. *Need tulemused annavad väärtuslikku teavet võimalike mehhanismide kohta, mille kaudu soolestiku mikrofloorat muudetakse ja soolte resistentsus oksüdatiivse stressi suhtes tekib.

2. Materjalid ja meetodid

manustati iga päev kell 12:00 h ja teisi aineid iga päev kell 15:00 h. Katsete ajal hoiti C-, D-, E- ja F-rühmi soolehäirete mudelseisundis. *väljaheited koguti iga seitsme päeva järel steriilsele operatsioonilauale ja säilitati temperatuuril –20 kraadi .2.4. Hiirte käärsoole histopatoloogiline vaatlus. Katse lõpus tapeti hiired emakakaela dislokatsiooniga ja nende käärsoole sisu koguti steriilsele opereeritavale lauale ja säilitati temperatuuril -80 kraadi; samal ajal fikseeriti käärsoolekoe proovid 10-protsendilises neutraalses formaliinis.*en, proovid dehüdreeriti gradiendikontsentratsiooniga etanooliga, hüaliniseeriti ksüleeniga, sisestati parafiini, lõigati sektsioonideks ja värviti hematoksüliin-eosiiniga. Käärsoole limaskesta morfoloogilisi muutusi vaadeldi ja võrreldi optilise mikroskoobi abil. Mõõdeti villuse pikkus ja krüpti sügavus käärsooles ning arvutati villuse pikkuse ja krüpti sügavuse suhe (V/C väärtus) (51).2.5. DNA ekstraheerimine ja raamatukogu ehitamine. DNA ekstraheeriti väljaheitest, kasutades EZNA®Soil DNA komplekti (Omega Bio-Tek, Norcross, GA, USA) vastavalt tootja protokollile. DNA kvaliteet määrati fluoromeetriga (QuantiFluor™-ST, Promega Corporation, USA). 16s rDNA V3-V4 piirkonna paarispraimerid kavandati piirkonna võimendamiseks ja 466 bp DNA fragmentide tootmiseks. *eespidine praimer oli 341F (-5-CCTACGGGNGGCWGCAG-3-) ja vastupidine praimer oli 806R (-5-GGACTACHVGGGTATCTAAT-3-). Iga PCR-i maht oli 25 μL, mis sisaldas 2,5 μL 10 × PCR-puhvrit, 2 μL dNTP-sid, 1 μL iga praimerit ja 20–30 ng matriitsi DNA-d. *et, järjestusraamatukogude loomiseks kinnitati indekseeritud adapterid amplikonide otstesse. *raamatukogud valideeriti QuantiFluor™ fluoromeetriga ja kvantifitseeriti 10 nmol-ni.2.6. 16s rRNA geenide järjestamine ja mikroobide kogukonna analüüs. *e Illumina platvormi (Illumina MiSeq) kasutati 2 × 250 bp paarisotsa andmete saamiseks. Operatiivsed taksonoomilised üksused (OTU-d) saadi Uparse'i tarkvara abil standardse klastrite abil 97-protsendilise sarnasusega. *OTUde joondamiseks Greengene'i andmebaasi versiooniga 13.5 ja liikide annotatsiooni tegemiseks kasutati RDP klassifikaatori naiivset Bayesi määramisalgoritmi. * Soolestiku mikrobiota alfa mitmekesisus arvutati Shannoni ja Simpsoni indeksite abil ning rühmadevahelisi erinevusi analüüsiti lineaarse diskriminantanalüüsi efekti suuruse (LEfSe) abil. * beeta mitmekesisust analüüsiti Brady-Curtise erinevuste põhikoordinaatide analüüsi (PCoA) abil. Soolestiku mikrobioomi mikroobse metaboolse võimekuse hindamiseks kasutati PICRUSt2 [42].2.7. Statistiliste andmete analüüs. Ühesuunalise ANOVA jaoks kasutati SPSS 20 ja katseandmed väljendati kui X ± S; X näitab keskmist väärtust ja S tähistab standardhälvet.

Cistanche immuunsuse parandamiseks

3. Tulemused

3.1. 8 CT vesiekstrakti mõju käärsoole morfoloogiale.*e tüüpilised ühendid (ehhinakosiid ja atsetoniid) ja nende CT ekstrakti kontsentratsioonid kinnitati HPLC abil (joonis S1). Vesiekstrakti soolele mõju määramiseks uurisime pärast vesiekstraktiga töötlemist käärsoole villi pikkust ja süvendite sügavust. *Käärsoole haavandid normaalses ja suure annuse rühmas (A, B ja D) olid pikemad ja sõrmetaolised, samas kui mudel- ja väikese annuse rühmas (C ja F) olid käärsoole haavad lühikesed ning käärsoole villid olid katki (joonis 1). Sellest lähtuvalt suurendas suurtes annustes CT vesiekstrakt soolehäiretega hiirtel märkimisväärselt käärsoole villi pikkust ja vähendas süvendite sügavust võrreldes mudelrühma hiirtega (P < 0.01).="" seevastu="" süvendi="" sügavus="" ei="" erinenud="" oluliselt="" suure="" annusega="" rühma="" ja="" normaalse="" rühma="" vahel="" (p=""> 0, 05) (tabel S1). *Need tulemused näitasid, et CT vesiekstrakti suur annus võib parandada soolehäiretega hiirte käärsoole morfoloogiat.3.2. 8e CT vesiekstrakti mõju soolestiku mikrobiota mitmekesisusele. Teostasime 16s rRNA geenide sekveneerimise, et uurida käärsoolesisese morfoloogiliste muutuste võimalikku põhjust ja uurida soolestiku mikrobiota muutusi pärast töötlemist CT vesiekstraktiga. Toorandmetest saadi keskmiselt 100 553 efektiivset märgist, vahemikus 77 734 kuni 125 144 (tabel S2). *Stagid koondati 4932 OTU-sse (tabel S3). Seejärel analüüsisime Theseuse põhjal soolestiku mikrobiota mitmekesisust. *e Shannoni ja Simpsoni indeksid ei näidanud erinevust A-rühma (normaalne CT vesiekstraktiga) ja B-rühma (normaalne ilma CT vesiekstraktita) vahel (joonis 2(a)). *on näidatud, et tsefiksiimravita hiirtel ei pruugi CT vesiekstraktil olla täiendavat kasulikku või kahjulikku mõju soolestiku mikrobiota mitmekesisusele. Mudelrühma (C) mitmekesisus näitas aga tavarühmadega võrreldes vähenevat trendi. * Suure ja keskmise annuse CT vesiekstraktidega töödeldud hiirtel ilmnesid mitmekesisuse taastumise tunnused, samas kui hiirtel, keda raviti väikese annusega CT vesiekstraktiga, sellist nähtust ei täheldatud (joonis 2 (a)). Samal ajal näitas PCoA, et normaalsetel rühmadel (A ja B) ja soolehäirete rühmadel, kellele manustati suures annuses (D) ja keskmise annusega (E) CTavesiekstrakte, oli proovidevahelised vahemaad tavaliselt lühemad kui mudelrühmas ja madalas annuses. -annuse CTvesiekstrakti toidulisandi rühm (F) (joonis 2(b)). *tulemused näitasid, et CT vesiekstrakt võib aidata parandada soolestiku mikrobiota mitmekesisust soolehäiretega hiirtel.

3.3. Muutused CT vesiekstraktiga töödeldud soolestiku mikrobiota koostises. *Erinevate rühmade vahel võrreldi mikrobiota koostise profiile. Varjupaiga tasandil oli proteobakterite suhteline arvukus mudelrühmas suurem kui teistes rühmades.

Joonis 1: *e Cistanche tubulosa (CT) vesiekstrakti mõju käärsoole morfoloogiale: A, normaalne rühm, millele on lisatud keskmise annusega vesilahuse Cistanche tubulosa (CT) ekstrakti; B, tavarühm; C, mudelirühm; D, mudelrühm, millele on lisatud suure annusega CT vesiekstrakti; E, mudelrühm, millele on lisatud keskmise annusega CT vesiekstrakti; F, mudelrühm, millele on lisatud väikeses annuses CT vesiekstrakti. a) Rühm A. (b) Rühm B. (c) Rühm C. (d) Rühm D. (e) Rühm E. (f ) Rühm F.

(Joonis 3(a)). * Proteobakterite arvu suurenemine viitas sellele, et tsefiksiim muutis mudelhiirte mikrobioomi ja et CT vesiekstrakt võib soolestiku mikrobiootale kasu tuua, kuna proteobakterite suurenenud levimus on korrastamata soolefloora sõlmmarker [43–45]. Lisaks vähenes perekonna tasandil Lactobacillus'e suhteline arvukus mudelrühmas võrreldes normaalsete ja suurte annustega rühmadega; see aga suurenes võrreldes keskmise ja väikese annuse rühmaga (joonis 3 (b)). *Need tulemused näitasid, et suures annuses CTaqueous ekstrakt võib soodustada mõnede bakterite kasvu perekonnast Lactobacillus. Uuritud rühmade vaheline mikrobioot määrati vastavalt LEfSe analüüsile. *analüüs näitas, et pärast ravi tsefiksiimiga suurenes märkimisväärselt Turicibacter, Alphaproteobacteria, Acidobacteria, Betaproteobacteriales ja Chloroflflexi suhteline arvukus, samas kui laktobatsillide, Eubacterium{8}}nodatum, Pseudonogroup_ suhteline arvukus suurenes oluliselt. cardiales ja Christensenellaceae_R-7_rühm vähenes oluliselt võrreldes normaalse rühmaga (joonis 4(a)). Hämmastav on see, et kui mudelrühma täiendati suure annusega CT vesiekstraktiga, suurenes Muribaculaceae, Lactobacilluse, Kin eosporiaceae, Eubacterium no datum rühma ja Pedobacter'i suhteline arvukus võrreldes mudelrühma omadega märkimisväärselt. Samal ajal vähenes Rhodobacter, Ruminococcaceae UCG_013, Roseburia, Ruminiclostri dium_9 ja Candidatus Stoquefifichus suhteline arvukus märkimisväärselt võrreldes mudelrühma kuuluvatega (joonis 4(b)).

Joonis 2: Hiirte väljaheidete soolestiku mikrobiota mitmekesisuse analüüs. (a) - Bakterikoosluste mitmekesisus, mõõdetuna Shannoni indeksi (A) ja Simpsoni indeksi (B) järgi; (b) peakoordinaatide analüüsi (PCoA) graafik, mis visualiseerib Bray-Curtise erinevustel põhinevaid andmeid. A, normaalne rühm, millele on lisatud keskmise annusega Cistanche tubulosa (CT) vesilahust; B, tavarühm; C, mudelirühm; D, mudelrühm, millele on lisatud suure annusega CT vesiekstrakti; E, mudelrühm, millele on lisatud keskmise annusega CT vesiekstrakti; F, mudelrühm, millele on lisatud väikeses annuses CT vesiekstrakti.