1. osa: Akteosiidi mõju raku kaitsjana kloonitud koera loomiseks

Ji Hye Lee1☯, Ju Lan Chun1☯, Keun Jung Kim1, Eun Young Kim1, Dong-hee Kim1, Bo Myeong Lee1, Kil Woo Han1, Kang-Sun Park1, Kyung-Bon Lee2, Min Kyu Kim1*

1 Looma- ja piimandusteaduse osakond, põllumajandus- ja bioteaduste kolledž, Chungnami riiklik ülikool, Daejeon, Korea Vabariik,

2 Hariduskolleegiumi bioloogiaõpetuse osakond,Chonnam National University, Gwangju, Korea Vabariik

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com

Palun klõpsake siin 2. osa juurde

Abstraktne

Somaatiliste rakkude tuumaülekanne (SCNT) on hästi tuntud laboritehnika. SCNT põhimõte hõlmab somaatilise tuuma ümberprogrammeerimist, süstides somaatilise raku retsipient munarakku, mille tuum on eemaldatud. Seetõttu peetakse tuuma doonorrakke SCNT-s oluliseks teguriks. Tuuma doonorrakkude rakutsükli sünkroniseerimist G0/G1 staadiumis saab indutseerida kontakti inhibeerimise või seerumi nälgimisega. Selles uuringusakteosiid, fenüülpropanoidglükosiidi ühendit, uuriti, et teha kindlaks, kas see on rakendatav rakutsükli sünkroniseerimise, tsütokaitse esilekutsumiseks ja SCNT efektiivsuse parandamiseks koerte loote fibroblastides. Primaarseid koerte loote fibroblaste ravitiakteosiid(10, 30, 50 μM) erinevatel ajaperioodidel (24, 48 ja 72 tundi). Rakutsükli sünkroonimine G0 / G1 etapis ei erinenud oluliselt induktsioonimeetodiga:akteosiidravi, kontakti pärssimine või seerumi nälgimine. Kuid nendest kolmest ravist põhjustas seerumi nälgimine oluliselt suurenenud reaktiivsete hapnikuliikide (ROS) taseme (99,5 ± 0,3 protsenti) ja apoptoosi. Tulemused näitasid ka sedaakteosiidvähendas ROS-i ja apoptoosi protsesse, sealhulgas nekroos koerte loote fibroblastides, ja parandas rakkude ellujäämist. Koerte loote fibroblastid, mida on töödeldudakteosiidarreteeriti edukalt G{0}}/G1 etapis. Veelgi enam, akteosiidiga töödeldud tuumadoonorrakke kasutanud rekonstrueeritud embrüod andsid terve kloonitud koera, kuid mitte embrüoid, mis toodeti tuuma doonorrakkudest, mida allutati kontakti inhibeerimisele. Kokkuvõtteks,akteosiidTuuma doonorrakkude indutseeritud rakutsükli sünkroniseerimine oleks alternatiivne meetod koerte SCNT efektiivsuse parandamiseks selle tsütoprotektiivse toime tõttu.

Cistanche akteosiid võib tugevdada immuunsust

Sissejuhatus

SCNT tehnikat on kasutatud geneetiliselt paremate või manipuleeritud loomade tootmiseks põllumajanduslikel eesmärkidel ja biomeditsiiniliste ressurssidena. Seoses kasvava vajadusega haiguste loommudelite, väljasuremisohus loomade päästmise, regeneratiivse meditsiini tüvirakkude, elundite siirdamise jms järele on huvi loomade kloonimise vastu SCNT abil viimasel ajal kasvanud [1–5]. Kuigi kloonitud loomade tootmine on olnud edukas, on SCNT efektiivsus endiselt väga madal [6]. Madala SCNT embrüo arengupädevuse põhjused hõlmavad paljusid tegureid, mis on seotud retsipientide munarakkude kvaliteediga, tuuma doonorrakkude kvaliteediga ja surrogaatema seisundiga [7–10].

On teada, et reaktiivsed hapniku liigid (ROS) ja apoptoos on seotud naiste paljunemisprotsessidega, sealhulgas munarakkude arenguga in vivo ja in vitro [11–14]. ROS katkestab embrüo arengu, indutseerides embrüote tsütoplasmaatilist kondenseerumist, DNA kahjustusi ja apoptoosi. Toetavad uuringud on teatanud, et ROS-i vähendamine parandab SCNT embrüo arengu pädevust in vitro kultiveerimise ajal [15–17]. Apoptoos on füsioloogiline protsess, mis toimub spontaanselt normaalse implantatsioonieelse embrüo arengu käigus, et säilitada raku homöostaas, eemaldades DNA kahjustatud/rikkeid rakke. ROS põhjustab DNA fragmenteerumist ja suurendab apoptootilisi blastomeere, mis häirivad embrüo arengut. ROS-i ja apoptoosi sündmust täheldatakse sagedamini pärast SCNT-d kui pärast in vitro viljastamist [18, 19]. Paljud uuringud teatasid, et SCNT embrüo arengu pädevust päästetakse ROS-i ja apoptoosi taseme vähendamisega, kasutades antioksüdante, nagu seleen [20], insuliin-transferriin-seleen [17, 21], melatoniin [22] ja glutatioon [23].

Varasemad uuringud teatasid, et G{{0}}/G1 staadiumis peatatud doonorrakkude kasutamine parandas SCNT efektiivsust [7, 9, 24–28]. G0/G1 staadiumis doonorrakkudes sisalduvat kromatiini on peetud SCNT embrüo arengu pädevuse seisukohalt kõige tõhusamaks. Doonorrakutsükli sünkroniseerimiseks on sageli kasutatud kontakti inhibeerimist, seerumi nälgimist ja keemilisi töötlusi [7, 25, 29, 30]. Seerumi nälgimine vähendas aga rakkude ellujäämist ja suurendab DNA fragmenteerumist, mis põhjustab apoptoosi [31]. Keemiline inhibeerimine on veel üks strateegia rakutsükli peatamiseks G0/G1 staadiumis, kasutades selliseid inhibiitoreid nagu roskovitiin [29, 32], dimetüülsulfoksiid (DMSO) [33] ja tsükloheksimiid (CHX) [34]. Sünkroniseerimiseks kasutatava meetodi tõhusust mõjutavad doonorrakkude tüübid ja liigid. Doonorrakkude optimaalseks sünkroniseerimiseks tuleb kasutatud meetodite erinevaid aspekte hoolikalt hinnata.

Akteosiid(tuntud ka kui verbaskosiid) [{{0}}(3, 4-dihüdroksüfenüületüül)-1-OaL-ramnopüranosüül-(1/3)-bD-({{13} }O-kofeoüül)-glükopüranosiid] isoleeritakse Syringa vulgaris'e violetsetest õitest. Akteosiidi sisaldavatel taimedel on teadaolevalt antimikroobne ja seenevastane toime [35–37] ning need takistavad põletikku. Tõepoolest, akteosiidil on erinevad bioloogilised toimed in vitro ja in vivo, näiteks antioksüdatiivne toime, antiapoptootiline toime, tsütotoksilisus erinevate kasvajarakkude suhtes ja rakutsükli sünkroniseerimine G0/G1 staadiumis tsükliinist sõltuvana. kinaasi (CDK) inhibiitor [38]. Näiteks Lee jt.[38] teatas, et ravi akteosiidiga võib pärssida inimese promüelotsüütiliste HL-60 leukeemiarakkude proliferatsiooni, kutsudes esile rakutsükli seiskumise G0/G1 staadiumis. Kuid akteosiidiga töödeldud doonorrakkude mõju koerte SCNT efektiivsusele tuleb veel uurida.

Selles uuringus on mõjudakteosiidrakutsükli sünkroniseerimisel, ROS-il jaapoptooskoerte loote fibroblastide kohta. Rakutsükli sünkroniseerimise, ROS-i ja apoptoosi analüüs viidi läbi fluorestsents-aktiveeritud rakkude sorteerimise (FACS) abil. Akteosiidiga töödeldud doonorrakkude efektiivsuse demonstreerimiseks kultiveeriti SCNT embrüoid ja viidi need retsipientkoerasse ning saadi edukalt terve kloonitud koer.

cistanchesaab ravidaneerudhaigus paranebneeru-funktsiooni

Materjalid ja meetodid

Eetikaavaldus

Selles uuringus kasutati munarakkude doonori ja embrüo siirdamise surrogaatidena 44 emast segakoera (vanuses 1–6 aastat) ning loote fibroblastide rakuliinide loomiseks emast beagle'i (vanuses 2 aastat). Kõik loomkatsed kiitis heaks Chungnami riikliku ülikooli institutsionaalne loomade hooldamise ja kasutamise komitee (IACUC) (kinnitusnumber: CNU-00487) ja need viidi läbi vastavalt IACUC avaldatud "Laboratoorsete loomade hooldamise ja kasutamise juhendile". Chungnami riiklikust ülikoolist. Koeri kasvatati siseruumides eraldi puurides, kus oli temperatuuri ja ventilatsiooni kontrollsüsteem. Koertele toideti üks kord päevas kaubanduslikku dieeti ja neile anti vett ad libitum. Kõigis loomkatsetes anesteseeriti koerad algselt 6 mg/kg ketamiini ja ksülasiiniga ning neid hoiti tuimastatud seisundis 2-protsendilise isofluraaniga. Operatsiooni lõpus manustati infektsioonide vältimiseks antibiootikume (prokaiinpenitsilliin G, bensatiinpenitsilliin G ja dihüdrostreptomütsiinsulfaat). Pärast operatsiooni viidi koerad oma individuaalsetesse puuridesse koos mageveega, jälgiti ja osutati vastutava veterinaararsti erihooldust, et loomad saaksid vajadusel ravida.

Kemikaalid

Kõik kemikaalid osteti ettevõttelt Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO, USA), kui pole öeldud teisiti. Akteosiid saadi Hiinast Chengdu Biopurify Phytochemicals Ltd.-st.

Koerte loote fibroblastide eraldamine

Koerte loote fibroblastid saadi {{0}}päevastelt loodetelt. Lühidalt, emane beagle viljastati kunstlikult isase beagle spermaga. 28 päeva pärast kinnitati emase beagle tiinus ja tseliohüsterektoomiaga saadi 5 loodet. Looteid pesti kolm korda fosfaatpuhverdatud soolalahuses (PBS; Gibco, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, Massachusetts, USA). Loote pea, siseorganid ja jäsemed eemaldati kirurgilise teraga ning ülejäänud kehaosad hakiti PBS-is. Lootetükke pesti kaks korda tsentrifuugimisega 400 × 5 minutit ja kultiveeriti Dulbecco modifitseeritud kotkasöötmes (DMEM; Gibco), millele oli lisatud 1 protsenti penitsilliini-streptomütsiini (toote nr P4458) ja 20 protsenti veise loote seerumit (FBS; Gibco). temperatuuril 39 kraadi niisutatud atmosfääris, mis sisaldab 5 protsenti CO2 ja 95 protsenti õhku. Kui rakud jõudsid 5–7 päeva pärast ühinemist, töödeldi neid 2 minutit 0,25-protsendilise trüpsiin-EDTA-ga (Gibco) ja koguti. Kahest individuaalsest lootest loodi kaks koerte loote fibroblasti rakuliini. Rakud külmutati 10-protsendilises DMSO-s FBS-is ja säilitati vedelas lämmastikus temperatuuril -196 kuni kasutamiseni.

Raku ravi

Külmutatud koerte fibroblastid sulatati ja kultiveeriti kuni 80 protsendilise konfluentsuseni. Rakud koguti ja passeeriti 4–7 korda järgnevateks katseteks. Rakud külvati kontsentratsiooniga 106/ml 60 mm kultiveerimisnõudesse. Rakke kultiveeriti (1) DMEM-is, millele oli lisatud 10 protsenti FBS-i ja 1 protsenti penitsilliini-streptomütsiini, viis päeva (kontaktinhibeerimine), (2) DMEM-is, millele oli lisatud 0,5 protsenti FBS-i ja 1 protsenti penitsilliini-streptomütsiini, viis päeva (seerumi nälg). või (3) DMEM, millele on lisatud 10 protsenti FBS-i ja 1 protsenti penitsilliini-streptomütsiini, mis sisaldab akteosiidi kontsentratsioonis 10 µM, 30 µM või 50 µM 24 h, 48 h ja 72 h (ravi akteosiidiga).

Rakutsükli analüüs voolutsütomeetria abil

Rakutsükli etappide analüüsimiseks koguti rakud, kasutades {{0}},25% trüpsiin-EDTA-d ja pesti 3 korda PBS-ga tsentrifuugimise teel. Pärast viimast pesu supernatandid visati ära ja rakud resuspendeeriti 0,3 ml PBS-is. Fikseerimiseks lisati rakususpensioonile tilkhaaval {{10}},7 ml külma absoluutset etanooli, segati õrnalt vorteksiga ja hoiti üleöö 4 kraadi juures. Fikseeritud rakke tsentrifuugiti ja pesti kaks korda külma PBS-ga. Rakud resuspendeeriti 0,25 ml PBS-is, millele oli lisatud 5 µl 10 mg/ml RNaasi, ja inkubeeriti 1 tund 37 kraadi juures. Seejärel lisati 10 µl 1 mg/ml propiidiumjodiidi (PI). Rakutsüklit analüüsiti DNA sisalduse kvantifitseerimisega rakupopulatsioonides G0/G1 (2n), S (vahemikus 2n ja 4n) ja G2/M (4n) faasides, kasutades FACS Calibur voolutsütomeetrit (Becton Dickinson, San Jose, CA). , USA).

ROS-i tuvastamine voolutsütomeetria abil

ROS-i elusrakkudes hinnati Image-iT™ Live Green Reactive Oxygen Species Detection Kit (Molecular Probes, Eugene, OR, USA) abil. Lühidalt, rakke pesti pärast söötme eemaldamist PBS-is ja lisati 2 ml 100 µM tert-butüülhüdroperoksiidi (TBHP) töölahust. Pärast 1-tunnist inkubeerimist 37 kraadi juures eemaldati TBHP töölahus ja rakke pesti õrnalt 3 korda soojas Dulbecco fosfaatpuhverdatud soolalahuses (DPBS; Gibco). Seejärel inkubeeriti rakke 25 μM 5-(ja-6)-karboksü-2,7-diklorodihüdrofluorestseiindiatsetaadi (karboksü-H2DCFDA) töölahuses 37 kraadi juures 30 minutit pimedas. . Oksüdeerituna kiirgab karboksü-H2DCFDA rohelist fluorestsentsi, mis hõlbustab ROS-i hindamist voolutsütomeetria abil. Positiivse kontrollina kasutati TBHP-d, mis on ROS-i tootmise indutseerija. Rakkude tuumad värviti Hoechst 33342-ga. Pärast 3-kordset pesemist PBS-iga koguti rakud trüpsiniseerimisega, suspendeeriti PBS-is ja kasutati ROS-i tuvastamiseks FACS Calibur voolutsütomeetriga (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA). ). ROS-i moodustumise kiirus arvutati, jagades ROS-positiivsete rakkude arvu rakkude koguarvuga ja teisendades väärtused protsentideks.

Apoptoosi analüüs voolutsütomeetria abil

Apoptoosianalüüs viidi läbi Vybran1 Apoptosis Assay Kit #2 abil (Molecular Probes, Eugene, OR, USA). Lühidalt, rakud koguti trüpsiniseerimisega ja pesti 2 korda külma PBS-ga. Seejärel lisati rakkudele 100 μL 1 × anneksiini siduvat puhvrit, 5 μL Alexa Fluor 488 anneksiin V ja 1 μL PI. Pärast 15-minutilist inkubeerimist toatemperatuuril lisati 400 µl 1 × anneksiini siduvat puhvrit ja rakususpensiooni segati õrnalt. Anneksiin V, mis on Ca2 pluss-sõltuv fosfolipiidi siduv valk, omab kõrget afiinsust fosfatidüülseriini (PS) suhtes. Elusrakkudes paikneb PS sisemisel tsütoplasmaatilisel membraanil ja translokeerub apoptootilistes rakkudes välisele tsütoplasmaatilisele membraanile. Apoptootilisi rakke eristab anneksiin V, mis on märgistatud Alexa Fluor 488-ga, mis seondub välismembraanil PS-ga. Lisaks sellele värvib PI, mis on nukleiinhappeid siduv värv, nekrootilisi rakke punase fluorestsentsiga. Seetõttu analüüsiti rohelise fluorestsentsiga apoptootilisi rakke, punase fluorestsentsiga nekrootilisi rakke ja rakkudes vähese fluorestsentsiga elusrakke, kasutades FACS Calibur voolutsütomeetrit (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA). Määrad arvutati, jagades elusate, nekrootiliste või apoptootiliste rakkude arvu rakkude koguarvuga ja teisendades arvutatud väärtused protsentideks.

In vivo küpsenud munarakkude kogumine

Ovulatsiooni tuvastamiseks igal koeral mõõdeti seerumi progesterooni (P4) kontsentratsiooni DSL-3900ACTIVE progesteroon Coated-tube Radioimmunoassay Kit (Diagnostic Systems Laboratories, Inc., TX, USA) abil. Nagu eelnevalt kirjeldatud [39, 40], peeti ovulatsiooni päevaks päeva, mil P4 kontsentratsioon ületas 4 ng/ml. 72 tundi pärast ovulatsiooni saadi munarakud laparotoomiaga, kasutades aseptilisi kirurgilisi protseduure. Munajuha fimbriale läheneti läbi hambumispilu ja kanüüliti, kasutades ümberpööratud äärikuga pirniga terasnõela (18, 7,5 cm). 24-gabariidiline intravenoosne (IV) kateeter (Angiocath™ Plus, Becton Dickison Korea Inc., Seoul, Korea) sisestati munajuha õõnsusse emaka munajuha ristmiku lähedale ja söödet 199 (Gibco), millele oli lisatud 1 protsenti penitsilliini-streptomütsiini ja streptomütsiini. 5% FBS viidi munajuhasse läbi IV kateetri. Munarakud transporditi kohe laborisse. 31 koeralt koguti kokku 316 munarakku.

Somaatiliste rakkude tuumaülekanne ja embrüo siirdamine SCNT viidi läbi nagu eelnevalt kirjeldatud [39]. Lühidalt, kumulusrakkude eemaldamiseks in vivo küpsenud munarakkudest pipeteeriti korduvalt kummuli-ootsüüdi komplekse (COC) 0,1 protsendilise hüaluronidaasi sisse. Esimesed polaarkeha ja metafaasi II kromosoomid eemaldati aspiratsiooni teel. Enukleatsioon kinnitati värvimisega Hoechst 33342-ga (bisbensimiidiga). Koera loote fibroblaste töödeldi 30 µM akteosiidiga 48 tundi ja seejärel koguti 0,25% trüpsiini-EDTA-ga. Üks rakk, millel on sile rakumembraan, viidi iga nukleaarse munaraku perivitelliini ruumi. Paberid olid tasakaalustatud infusioonisööde, mis on 0,26 M mannitooli sööde, mis sisaldas 0,1 mM HEPES-i, 0},5 mM MgSO4 ja 0,05 protsenti BSA-d ning sulandati kahe impulsiga alalisvoolu (69–75 V 15 μs) Electro-Cell Fusion aparaadist (NEPA gene Co., Chiba, Jaapan). Neid paare inkubeeriti söötmes 199, millele oli lisatud 10 protsenti FBS-i, 1 tund 30 minutit. Liitunud SCNT embrüoid kontrolliti ja keemiline aktiveerimine kutsuti esile, inkubeerides neid 10 µM kaltsiumionofooris (toote nr C7522, Sigma) 4 minutit. SCNT embrüod pesti ja seejärel pandi 3 tunniks 30 minutiks modifitseeritud sünteetilisse munajuhavedelikku (mSOF) [41], mis sisaldas 1,9 mM 6-dimetüülaminopuriini (6-DMAP). Töötletud embrüod viidi kirurgiliselt üle innaga sünkroniseeritud surrogaatide munajuhadesse 4 tunni jooksul pärast SCNT-d. Rasedus kinnitati ultraheliuuringuga 26 päeva (kõige varem) pärast embrüo siirdamist.

aktiivne koostisosaakteosiidsissecistanche

Kloonitud embrüote in vitro kultuur

Pärast SCNT-d kultiveeriti kloonitud embrüoid 40 µl mikrotilkades modifitseeritud sünteetilises munajuhavedelikus (mSOF) (10 kloonitud embrüot mikrotilga kohta), mis oli kaetud mineraalõliga 38,5 kraadi juures 5% CO2 ja 95% õhuga. SCNT embrüo arengut täheldati päevast 2 kuni 8. päevani.

Kloonitud koera mikrosatelliidi ja mitokondriaalse DNA analüüs

Kogu DNA ekstraheeriti tuumadoonorrakkudest ning ootsüütide doonorkoerte, surrogaatkoerte ja kloonitud koera nahast G-spin™ genoomse DNA ekstraheerimiskomplektiga (iNtRON BIOTECHNOLOGY, Seongnam, Korea) vastavalt tootja juhistele. ja seejärel elueeriti 100 μL TE puhvris (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0). DNA kogust mõõdeti BioSpec-nano spektrofotomeetriga (Shimadzu Corp., Jaapan).

Mikrosatelliidi genotüpiseerimiseks valiti järgmised 7 spetsiifilist geeni: PEZ1, PEZ3, PEZ8, PEZ12, FH2010, FH2054 ja FH2079. PCR viidi läbi esialgse denatureerimisega 10 minutit 95 kraadi juures, 20 tsüklit koosnesid denaturatsioonist 30 sekundit 95 kraadi juures, 30 sekundit anniilimist 58 kraadi juures (-0.1 kraad/tsükkel), 1 min pikendamist temperatuuril 72 kraadi ja veel 15 tsüklit, mis koosnesid denaturatsioonist 30 sekundit 95 kraadi juures, 30 sekundit lõõmutamist 56 kraadi juures, 1 min pikendamist 72 kraadi juures ja lõplikku pikendamist 72 kraadi juures 10 minutit.

Mitokondriaalse DNA sekveneerimiseks, kasutades koerte mtDNA täielikke nukleotiidjärjestusi (GenBank registreerimisnumber: U96639), sünteesiti järgmised oligonukleotiidpraimerid: Tsütokroom b piirkond (L14,252 –L14,631) F: ACTCATTCCATTGACCTAGGCCATAGG,GenBank registreerimisnumber: U96639; Tsütokroom c oksüdaasi II subühik (L7,054-L7,465) F: ATGGCGTACCCATTTCAACT,R: GGATGGTTATTTCTATTGG; 16S rRNA (L2 033 – L2 472) F: GCAAAGGTAGCATAATCAT,R: AGGACTTTAATCGTTGAAC; D-silmuse piirkond (L15 622 – L16 030) F: CATAGGACATATTAACTCAATC,R: AAGTCCAGCTACAAGTTATTTG [42]. Selle analüüsi PCR-tsüklid hõlmasid järgmist: 95-kraadine algdenatureerimine 5 minuti jooksul, 5 denatureerimistsüklit 30 sekundit temperatuuril 95 kraadi, 40 sekundit lõõmutamist 60 kraadi juures (-1 kraadi/tsükkel), 1 min pikendamist 72 kraadi juures ja järgmised 30 denatureerimistsüklit 30 sekundit 95 kraadi juures, 40 sekundit lõõmutamist 55 kraadi juures, 1 min pikendamist 72 kraadi juures ja lõplikku pikendamist 72 kraadi juures 10 minutit. Erinevatest katsetest saadud PCR fragmente analüüsiti, kasutades ABI Prism 3100 Genetic Analyzerit (Applied Biosystems Inc., USA). Kontrollpiirkondade järjestuse kokkupanek, mitu joondust ja joonduse kärpimine viidi läbi BioEditi tarkvaraga (v.7.0.5.3).

akteosiidsissecistanchevõib tõsta immuunsüsteemi