1. osa: Echinacoside kaitseb MPP + indutseeritud neuronaalse apoptoosi eest ROS / ATF3 / CHOP raja reguleerimise kaudu

Qing Zhao1 • Xiaoyan Yang2 • Dingfang Cai3,4 • Ling Ye5,6 • Yuqing Hou1 •

Lijun Zhang1 • Jiwei Cheng1 • Yuan Shen1 • Kaizhe Wang5 • Yu Bai1

Pls kliki siia kuni 2. osani

liigid (ROS) aitavad kaasa ka selle arengule [3]. PD-ga sarnaseid omadusi võivad esile kutsuda mitmed keskkonnamürgid, sealhulgas 1-metüül-4-fenüül- 1,2,3,6-tetrahüdroksüridiin (MPTP), tsüaniid, süsiniku disulfiid ja tolueen. MPTP-d kasutatakse laialdaselt PD loommudelite esilekutsumiseks ja selle aktiivset metaboliiti, 1-metüül-4- fenüülpüridiniumiooni (MPP?), kasutatakse PD rakumudelites [4, 5]. MPP? pärsib valikuliselt elektronide transpordiahelat ja põhjustab liigset ROS-i tootmist, põhjustades seeläbi neuronaalset surma ja PD-d meenutavat sündroomi [6]. Hiljutised uuringud on näidanud, et MPP? indutseerib in vitro PD mudelis mitmeid radu, sealhulgas suurenenud GSK3B fosforüülimine (pY206) ja a-sünukleiini kogunemine[5], heme oxygenase-1/ni- ni- nikotiinamiidi adeniindometiidi dinukleotiidfosfaatoksüdaas/ROS telg [7, 8], aktiivse transkriptsioonifaktori 3 (ATF3) suurenenud ekspressioon ja kasvuaresti DNA kahjustusega indutseeritava 153 (GADD153)/C/EBP-homoloogne valk (CHOP) [9]. Kliinilises ravis on ROS-toodete pärssimine üks tähtsamaid strateegiaid neuronite ellujäämiseks ja PD raviks [1].

Echinacoside(ECH, joonis 1A), looduslikfenüületanoidileidub paljudes ravimtaimedes, on peamine koostisosafenüületanoidiGlükosiidideraldatud traditsioonilisest Hiina ürdist,Cistanchesalsa [10]. Huvitav on see, et hiljutised uuringud on näidanud, etECHomab mptp poolt indutseeritud PD hiiremudelis kaitsvat toimet [10, 11].ECHsamuti attenuates neuroblastoomi raku apoptoosi indutseeritud kasvaja nekroosi tegur-a või 6-hüdroksüdopamiin in vitro [12, 13]. Kuid mehhanismid, mille abilECHsoodustab neuronite ellujäämist MPP-s ?-indutseeritud PD-rakkude mudel jääb ebaselgeks.

Me näitasime, etECHvähendas märkimisväärselt MPP poolt indutseeritud ros-tooteid? SH-SY5Y rakkudes.ECHinhibeeris ka ATF3, CHOP ja a-sünukleiini MPP poolt indutseeritud ekspressiooni, samuti pärssis pro-apoptoosi valkude kaspaas-3 ja polü (ADP-riboosi) polümeraasi (PARP) aktiveerimist.

CistancheechinacosideOnneuroprotektiivneMõju

Materjalid ja meetodid

Reaktiivid

Dulbecco minimaalne oluline keskkond (DMEM), loote veiste seerum, 0,25% trüpsiin, 1% penitsilliin / streptomütsiin ja TRIzoli reaktiiv olid Life Technologiesist (Grand Island, NY). Kromatiini värv bisbenzimiid (Hoechst 33342), polü-L-lüsiin, MPP? jodiidid ja MPTP olid pärit Sigmast (St. Louis, MO). Lipiidide peroksüdatsiooni malondialdehüüd (MDA) analüüsikomplekt ja diklorofluoresetseiini diatsetaat (DCFH-DA) olid pärit Beyotime Biotechist (Haimen, Hiina). C98% puhtuse ECH pärineb Push Biotechnology'st (Chengdu, Hiina).

Loomad ja ravi

Loomade hooldus ja ravi olid nagu varem kirjeldatud [14]. Me kasutasime isaseid C57BL/6 hiiri (Shanghai Laboratory Animal Co., Shanghai, Hiina), kaaluga 24–26 g 10 nädala vanuselt. Loomi hoiti standardtingimustes (12:12 h valgust: tume tsükkel, 21 ± 2C ja suhteline õhuniiskus 40%) ning neil oli juurdepääs toidule ja veele ad libitum. Kõik protseduurid kiitis heaks Fudani ülikooli Zhongshani haigla loomaeetika komitee ja see viidi läbi vastavalt riiklikele tervishoiuinstituutide juhendile hoolduse ja kasutamise kohta.

Laboriloomad.

Hiired jagati juhuslikult nelja rühma (10 hiirt/rühm): A-rühm, sõiduki kontrollrühm, kellele anti võrdne kogus (500 lL) normaalset soolalahust (NS); B-rühm, ECH kontrollrühm, antud 20 mg/kg ECH; rühm C, MPTP mudelirühm, eeltöödeldud võrdse NS-mahuga; ja D-rühm, ECH-ga ravitud rühm, eelnevalt töödeldud 20 mg/kg-gaECH.ECHlahustati NS-is ja tarniti maosisese manustamise teel iga 24 tunni järel 15 järjestikuse päeva jooksul. C- ja D-rühma hiire PD mudel loodi viie järjestikuse intraperitoneaalse süstiga 30 mg/kg MPTP iga 24 tunni järel alates 11. päevast kuni 15. päevani. Hiired surid emakakaela nihestuse või perfusiooni tõttu, mida 10% kloroalhüdraat (3,6 mg/kg) intraperitoneerumine 24 h pärast lõplikku ravi narkootiliselt 10% kloroalhüdraat (3,6 mg/kg) narkootiliselt.

Perfusiooni ja kudede töötlemist kirjeldati eelnevalt [14]. Pärast intrakardialist perfusiooni koguti ajuproovid ja fikseeriti 4% paraformaldehüüdis 24 tunniks 4C juures, mis oli manustatud parafiini, ja krooniosad, mis hõlmasid kogu SNc-d (stereotaksilised koordinaadid anteroposterior -3,64 kuni -2,92 mm bregma suhtes) lõigati 5 lm juures.

Veel 5 looma igast rühmast tapeti emakakaela nihestuse tagajärjel ja ventraalne kesknärvisüsteem lüüsiti kiiresti 1% SDS-lüüsi puhvris jääl. CHOP ja ATF3 valgu taset lüsaadis analüüsiti lääne blot.

kidney injury and disease

Cistancheechinacosideergutabneer

Roti Ventral Midbraini kultuur (VM)

Dopaminergilised neuronid

Rasedad Wistar rotid osteti Shanghai Laboratory Animal Co., (Shanghai, Hiina). VM-i DA neuronid isoleeriti embrüonaalsel päeval 14. VM-i tükeldati ja töödeldi primaarsete VM DA neuronite kultuuride loomiseks, nagu varem kirjeldatud [15, 16]. Lühidalt öeldes koguti koetükid jääkülma Hanksi tasakaalustatud soolalahusesse (HBSS) ja tsentrifuugeeriti 1000 pööret minutis 4C juures 5 minutiks. Koegraanule inkubeeriti 750 lL-s 0,1% trüpsiini-HBSS-i 15 minutiks 37C juures 5% CO2-ga. Loote vasika seerumit (FCS; 750 lL) kasutati trüpsiini inaktiveerimiseks ja koed lahutati õrna trituratsiooniga

kasutades steriliseeritud Pasteuri pipetti. Rakkude suspensioonid tsentrifuugeeriti 1000 p/min juures 4C juures ja peatati uuesti diferentseerunud keskkonnas (Dulbecco modifitseeritud Eagle'i keskkond/F12, 33 mmol/L D-glükoos, 1% L-glutamiin ja 1% FCS, millele lisandus 2% B27). Rakud külvati polü-D-lüsiiniga (Sigma) kaetud 24-kaevuliste koekultuuriplaatidega 5 9 104 raku/ kaevu 500 lL diferentseerumise keskkonnas 37C juures 5% CO2-ga 10 päeva jooksul, et areneda

küpsed DA neuronid. VM DA neuroneid iseloomustas immunofluorestsents b-tubuliini isotüübi III antikeha ja türosiini hüdroksülaasi (TH) antikehaga (joonis. S1). Rakke töödeldi 1 mmol/L MPP-ga?, 40 LG/ ml ECH-ga, MPP kombinatsiooniga? ja ECH või ainult PBS kui kontroll. Rakkude elujõulisust analüüsiti CCK-8 reaktiiviga pärast 96 tunni pikkust ravi.

ja on esitatud keskmise ± SD (n = 6; **P \0,01 vs kontroll, #P \ 0,05, ##P \0,01 vs MPP? ravi). C Kerged mikroskoopilised pildid MPP poolt põhjustatud morfoloogilistest muutustest? või MPP? ja ECH. a, PBS kontroll; b, 40 lg/ml ECH; c, 1 mmol/ L MPP?; d, 1 mmol/L MPP? ja 10 lg/ml ECH; e, 1 mmol/L MPP? ja 20 lg/ml ECH; f, 1 mmol/L MPP? ja 40 lg/ml ECH (skaalariba, 200 lm).

11-

Cistanche echinacoside pärsib apoptoosi

SH-SY5Y rakukultuur

SH-SY5Y rakud olid pärit Shanghai rakubioloogia instituudi rakupangast (Hiina Teaduste Akadeemia, Shanghai, Hiina) ja neid kasvatati DMEMis, mida täiendati 10% loote veiste seerumi, 100 U / ml penitsilliini ja 100 U / ml streptomütsiiniga. Rakke hoiti niisutatud 37C inkubaatoris, mis oli varustatud 5% CO2-ga. MPP? lahendati steriilses vees ja kasutati kohe. ECH lahustati PBS-is. ROS-iga seotud geeniekspressiooni ja valgu taseme uurimiseks külvati rakud 6-kaevulistesse plaatidesse ja kasvatati 24 tundi. Seejärel toideti rakke värske söötmega, mis sisaldas MPP-d?, ECH, MPP kombinatsiooni? ja ECH või ainult PBS kui kontroll. Pärast 24-tunnist töötlemist lüüsiti rakke 1% SDS-lüüsipuhvriga (1% SDS,25 mmol/L EDTA, 45 mmol/L Tris–HCl, pH 6,5) lääne blot-analüüsiks ja kogu RNA isoleeriti otse TRIzoli reaktiiviga.

ATF3 ja CHOP jaotuse analüüsimiseks pärast töötlemist kasutati tuuma- ja tsütoplasmiliste ekstraheerimisreagentide komplekte (Thermo Fisher, Waltham, MA) tsütoplasmiliste ja tuumafraktsioonide eraldamiseks ravimitega töödeldud ja kontrollrakkudest.

Rakkude elujõulisuse analüüs

SH-SY5Y rakud külvati 96-kaevu plaatidesse ja inkubeeriti üleöö. Rakke toideti iga 24 tunni järel värske täieliku söötmega, mis sisaldas erinevaid ravimeid ja mida hoiti 3 päeva. Seejärel hinnati elujõulisust CCK8 rakuloenduri komplekti abil (Dojindo, Jaapan). Andmed normaliseeriti PBS-i kontrolli tulemustele ja need esitatakse keskmise ± SD-ga. ATF3-knockdown SH-SY5Y (ATF3 shRNA) ja kontrolli (GFP shRNA) rakkude elujõulisuse analüüsimiseks lisati rakud 96-kaevu plaatidele ja kasvatati 14–16 h. ATF3 shRNA või GFP shRNA plasmiidid nakatati SH-SY5Y rakkudesse Lipofektamiini 2000 (Life Technologies, Carlsbad, CA) abil. Rakke töödeldi 1 mmol/L MPP-ga? või võrdne kogus PBS-i pärast 24 h transfektsiooni ja seejärel inkubeeriti 3 päeva. Lahtrite numbreid loendati iga päev. Andmed esitatakse SD ± keskmisena.

shRNA konstruktsioonid ja oligo krundid

pGV298-ATF3 shRNA (ATF3shRNA) ja GFP kontroll shRNA konstruktsioonid olid pärit GeneChem Co-lt (Shanghai, Hiina). ATF3 sihtjada oli 50-GCAAAGT G! CCGAAACAAGA-30 varem kirjeldatud meetoditest [17, 18]. MPP poolt indutseeritud geeniekspressiooni avastamiseks valiti qRT-PCR-i jaoks ROS-stressiga ja PD-ga seotud geenid ning kontrollina kasutati GAPDH-d. Kõik praimerid sünteesis Sangon Biotech Co. (Shanghai, Hiina) ja kruntide järjestused on loetletud tabelis 1.

Reaalajas PCR

Kogu RNA ekstraheeriti TRIzoli reaktiiviga vastavalt tootja juhistele. Pöördtranskriptsioon ja kvantitatiivne reaalajas PCR (qRT-PCR) viidi läbi nagu eelnevalt kirjeldatud. Pöördtranskriptsioonireaktsioon viidi läbi RevertAid First Strand cDNA synthesis kiti (Thermo Scientific, Waltham, MA) abil vastavalt tootja juhistele. QRT-PCR-i jaoks kasutati SYB Premix Ex Taq II komplekti (TaKaRa, Dalian, Hiina): ABI-ga kasutati 20-lL reaktsioonisüsteeme (Life Technologies, Carlsbad, CA). PCR-parameetrid koosnesid järgmistest sammudest: 95C 3 minutiks, 1 tsükkel; 95C 5 s ja 60C jaoks 40 s, 40 tsüklit. Lõplikud andmed olid ega...

moraliseeritud GAPDH-ga ja neid esitatakse suhtena kontrolli suhtes. Võimenduseks kasutatavad praimerid on loetletud tabelis 1.

Western Blotting

Lääne blot analüüs viidi läbi nagu varem kirjeldatud [19]. Peamised antikehad olid lõhustatud kaspaas 3 ja p53 (cell signaling technology, Danvers, MA), anti-GAPDH (Proteintech Group, Chicago, IL), anti-GADD153/CHOP (Wanlei Bio, Shenyang, Hiina) ja anti-ATF3, anti-PARP, anti-PUMA ja anti-histon 3 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Mädarõika peroksüdaasiga märgistatud sekundaarsed antikehad pärinesid Jack-son Immune Research Laboratories'ist (Western Grove, PA). PVDF-membraanid olid EMD Millipore'ist (Billerica, MA) ja ECL-i substraat CWBio-st (Suzhou, Hiina). Pildi hallil tasemel põhinevat suhtelist valgusisaldust analüüsiti Tanon GIS tarkvaraga (Tanon Biotech, Shanghai, Hiina) ja andmed esitatakse sihtvalgu ja GAPDH suhtena.