1. osa: ehhinakosiid kutsub esile apoptootilise vähirakkude surma, inhibeerides nukleotiidide kogumit desinfitseeriva ensüümi MTh1

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com

Abstraktne:Nukleotiidide kogumit desinfitseeriva ensüümi MTH1 inhibeerimine põhjustab ulatuslikke oksüdatiivseid DNA kahjustusi ja apoptoosi vähirakkudes ning seetõttu võib seda kasutada vähivastase strateegiana. Kuna looduslikud tooted on olnud rikkalikult meditsiiniliste kemikaalide allikaks, kasutasime käesolevas uuringus MTH1-katalüüsitud ensümaatilist reaktsiooni suure jõudlusega vitro sõeluuringus, et otsida looduslikke ühendeid, mis on võimelised MTH1 inhibeerima.ehhinakosiid, ravimtaimedest saadud ühendCistancheja Echinacea inhibeeris in vitro testis tõhusalt MTH1 katalüütilist aktiivsust. Erinevate inimese vähirakuliinide raviehhinakosiidpõhjustas oksüdeeritud guaniini (8-oksoguaniini) taseme olulise tõusu rakus, samas kui raku reaktiivsete hapnikuliikide tase jäi muutumatuks, mis näitab, etehhinakosiidinhibeeris ka rakulise MTH1 aktiivsust. Järelikult kutsus ehhinakosiidiga ravi esile DNA kahjustuse markerite kohese ja dramaatilise suurenemise ja G1 / S-CDK inhibiitori p21 ülesreguleerimise, millele järgnes märkimisväärne apoptootiline rakusurm ja rakutsükli seiskumine vähi korral, kuid mitte vähirakkudes. Kokkuvõttes tuvastasid need uuringud loodusliku ühendi MTH1 inhibiitorina ja viitavad sellele, et looduslikud tooted võivad olla oluliseks vähivastaste ainete allikaks.

Märksõnad: ehhinakosiid, MTH1, 8-oksoG, DNA kahjustus, apoptoos, rakutsükli seiskumine

Cistancheekstraktil onvähivastanekasu tervisele

2. osa vaatamiseks klõpsake siin

Sissejuhatus

Tsellulaarne ja mitokondriaalne nukleosiidtrifosfaat (NTP) ja desoksünukleosiidtrifosfaat (dNTP) on erinevate reaktiivsete hapnikuliikide (ROS) märkimisväärne sihtmärk.1–3 Kuna DNA polümeraaside spetsiifilisus ei ole täiuslik, saab 4,5 oksüdeeritud dNTP-sid liidetakse äsja sünteesitud DNA-sse, et põhjustada geneetilisi aberratsioone, kui seda ei fikseerita.6 Näiteks nukleotiidide kogumi peamine oksüdeeritud alus 8-oksoguaniin (8-oksoG) võib aluspaari luua tsütosiini ja adeniiniga. DNA replikatsiooni ajal vastassuunas asuvasse adeniini sisestatuna võib see potentsiaalselt põhjustada T:A=G:C transversiooni,7 mis on üks levinumaid inimese vähkkasvajates leitud mutatsioone.8,9 Kuigi enamik oksüdeerunud vabadest dNTP-dest eemaldatakse nukleotiidide kogumit desinfitseerivate ensüümide abil, on minevikus tehtud uuringud näidanud, et nukleotiidide kogum on endiselt oluline oksüdeeritud aluste allikas DNA molekulides ja oluline oksüdatiivse DNA kahjustuse põhjustaja.3,10 kõige olulisem ensüüm nukleotiidide desinfitseerimiseks Sellegipoolest, isegi nukleotiidide kogumi desinfitseerivate ensüümide järelevalve all, liidetakse märkimisväärne osa oksüdeeritud dNTP-sid DNA-sse ja DNA molekulide aluseid saab oksüdeerida ka otse ROS-iga.6 Seejärel tuginevad rakud keerukamatele strateegiatele, mis hõlmavad erinevaid DNA glükosülaasid, nagu OGG1 ja MUTYH, ja DNA parandamise protsessid, sealhulgas aluse ekstsisiooni parandamine (BER) ja sobimatuse parandamine (MMR), et fikseerida DNA molekulides probleemsed alused.10,16,17 BER a. nd MMR parandab tavaliselt DNA-s palju oksüdeeritud aluseid päevas ja mängib seega olulist rolli genoomi terviklikkuse ja stabiilsuse kaitsmisel.

Kõrgendatud oksüdatiivse stressi all kannatavates rakkudes võib oksüdeeritud nukleotiidide suurenenud liitumine DNA-ga ületada raku paranemisvõime ja vallandada DNA kahjustusreaktsiooni (DDR).18 Püsiv DDR-i signaalimine põhjustab rakutsükli seiskumise, raku enneaegse vananemise võiapoptoos19, mis takistab kasvaja teket.19 Kuigi vähirakkudel on väga kõrge oksüdatiivne pinge ja need tekitavad potentsiaalselt surmava oksüdeeritud nukleotiidide koormuse20, võivad nad ellu jääda DDR-iga seotud vananemise võiapoptoos.21 Suur hulk uuringuid on näidanud, et MTH1 mängib vähi arengus võtmerolli, eemaldades tõhusalt kasvajarakkudes ohtlikult rohkesti 8-oksodGTP ja 2-OH-dATP.22 MTH1 oli leiti olevat üleekspresseeritud erinevat tüüpi vähi korral,23–25 ja 8-oksoG tasemed ning oksüdatiivsete DNA kahjustuste ulatus oli kasvajates väiksem kui ümbritsevates normaalsetes kudedes.26–28 Funktsionaalselt vähenes MTH1 üleekspressioon oluliselt MMR-puudulikkusega hiire embrüonaalsetes fibroblastides10 täheldatud DNA mutatsioonide arv, mis võimaldas rakkudel ületada onkogeense Ras-indutseeritud raku enneaegset vananemist ja apoptoosi;29 samas kui MTH1 allasurumine takistas vähi teket OGG1-puudulikes hiirtes30 ja soodustas ROS-indutseeritud DDR ja raku vananemine Ras-transformeeritud rakkudes.3,29,31 Seega, kuigi MTH1 mängib kaitsvat rolli, vältides ROS-indutseeritud mutatsioone tervetes rakkudes, leiti nendes uuringutes, et MTH1 on eriti vajalik tekkeks ja ellujäämiseks. vähirakkudest. Hiljutised uuringud on andnud rohkem tõendeid MTH1 rolli toetamiseks vähi arengus.31–34 MTH1 pärssimine RNAi või väikesemolekuliliste inhibiitorite poolt erinevates vähirakuliinides suurendas märkimisväärselt 8-okso d G inkorporeerimist genoomsesse DNA-sse. , mis põhjustab ulatuslikke DNA kahjustusi, apoptootilise rakusurma ja vähirakkude elulemuse vähenemist.32,33 Hiirte ksenotransplantaadi uuringutes pärssis MTH1 inhibeerimine tõhusalt vähieksplantaatide kasvu. Oluline on see, et MTH1 allasurumine ei mõjutanud normaalsete rakkude kasvu ja ellujäämist, tõenäoliselt seetõttu, et normaalsetel rakkudel on madalam ROS ja seega on nende ellujäämine vähem sõltuv MTH1-st.32,33 Need leiud viitavad sellele, et MTH1 pärssimine on paljulubav uudne strateegia vähi vastu võitlemisel.

Looduslikud tooted on olnud rikas ravimühendite allikas.35 Paljud kaasaegsed ravimid, sealhulgas vähivastased ravimid, on saadud taimsetest või botaanilistest preparaatidest.36–39 Siiski on suur hulk traditsioonilisi ravimtaimi pakutud, et neil on säilinud erinevad raviomadused. iseloomustada, peamiselt raskuste tõttu nende koostiste kontrollimisel, et üheselt määratleda nende tõhusus ja toimemehhanismid.40 Vaja on uusi lähenemisviise, mis võimaldavad tuvastada aktiivseid ühendeid ja analüüsida molekulaarseid mehhanisme. Sellega seoses võib sihtmärgipõhine suure läbilaskevõimega in vitro sõelumine olla abiks loodusvaradest mehaaniliselt määratletud ravimühendite leidmisel. Käesolevas uuringus kasutasime MTH1-katalüüsitud ensümaatilist reaktsiooni suure läbilaskevõimega in vitro testina, et otsida looduslikke ühendeid, mis võivad inhibeerida MTH1. Üllataval kombel selgus see sõeluuringulehhinakosiid, looduslik toode, mis on kõige paremini tuntud oma tugeva antioksüdatiivse toime poolest, on võimeline inhibeerima MTH1.

ehhinakosiidcistanche purgisapoptoosivastane toime

materjalid ja meetodid

Materjalid

Looduslikud taimsed ühendid osteti ettevõttelt Yuanye Biological Technology Co., Shanghai, Hiina Rahvavabariik. Iga ühendi nimi, katalooginumber, Chemical Abstracts Service (CAS) registrinumber ja puhtus on loetletud tabelis S1. Ühendite põhilahused valmistati 100% dimetüülsulfoksiidis (DMSO) (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) ja töölahused valmistati analüüsipuhvris või täielikus rakukultuurisöötmes. Vehiikli kontrollina kasutati sama lahust ilma testühendita, kuid sisaldas sama kogust DMSO-d. (S)-krisotiniib osteti ettevõttelt Selleck Chemicals, Houston, TX, USA.

in vitro sõelumine

Looduslike taimsete ühendite sõelumiseks kasutatud in vitro ensümaatiline analüüs järgis Gad et al.32 kirjeldatud protseduure. Lühidalt, üksikute ühendite seerialahjendused valmistati analüüsipuhvris, mis sisaldas 100 mM Tris- atsetaat (pH 8.{11}}), 40 mM NaCl, 10 mM Mg atsetaati, 0,005 protsenti Tween 20 ja 1 mM DTT. Järgmisena lisati 0,5 nM rekombinantset inimese MTH1 (Abcam, Cambridge, UK), 100 µM dGTP-d (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) ja 0,2 U/ml anorgaanilisi pürofosfataase (Thermo Fisher Scientific) ning plaatidel inkubeeriti. plaadiloksutis 1 tund toatemperatuuril. Reaktsiooni lõppmaht oli 96-süvendiplaadil 100 μL. Reaktsiooni lõpus lisati malahhiitroheline (J&K Scientific, Peking, Hiina Rahvavabariik)41 ja plaate inkubeeriti toatemperatuuril veel 15 minutit. Neeldumist lainepikkusel 630 nm mõõdeti BioRad 680 mikroplaadilugejaga (Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA). Inhibeeriva kontsentratsiooni (IC50) väärtused määrati mittelineaarse regressioonianalüüsiga, kasutades tarkvara GraphPad Prism.

rakukultuur

Inimese MG-63 osteosarkoom, SK-HEP-1hepatokartsinoom, MCF7 rinnavähk, SW480 kolorektaalne vähk, HEK293 embrüonaalne neer ja hiire NIH/3T3 fibroblasti rakuliinid pärinesid American Type Culture Collectionist ja inimese normaalsest rakust. maksa rakuliin L-O2 osteti ettevõttelt KenGen Biotech, Nanjing, Hiina Rahvavabariik. Neid rakke hoiti 37 kraadi juures 5% CO2-sisaldusega niisutatud atmosfääris, järgides tarnijate antud juhiseid. Nende rakuliinide kasutamiseks ei nõutud institutsionaalselt järelevalvenõukogult eetikaavaldust.

Rakusisese {{0}}okso mõõtmine Intratsellulaarset 8-oksoG taset mõõdeti Cy3-konjugeeritud avidiiniga värvimise teel.42 Kokku määrati 1 × 104 rakku külvatud ümmargusele katteklaasile 12-kaevuplaatidele. Järgmisel päeval töödeldi rakke 0 μM, 15 μM, 30 μM, 60 μM või 80 μM ehhinakosiidiga 5 tundi, 12 tundi või 24 tundi ja seejärel fikseeriti jääga. -külmas metanoolis 20 minutit, millele järgneb inkubeerimine Tris-puhverdatud soolalahuses (TBS) 0,1 protsendilise Triton X-100-ga (Sigma-Aldrich) 15 minutit. Proovid blokeeriti TBS-is 0,1% Triton X-100 ja 15% veise loote seerumiga 1 tund toatemperatuuril ja seejärel värviti Cy3-konjugeeritud avidiiniga (0,5 ug/ml) (Rockland Immunochemicals, Limerick, PA, USA) blokeerivas lahuses 1 tund 37 kraadi juures. Pärast 3-kordset 5-minutilist pesemist fosfaatpuhverdatud soolalahuses (PBS) suleti katteklaasid klaasklaasidele putukakaitse paigaldussöötmele 4′,6-diamidino-2-fenüülindooliga (Vector Laboratories, Burlingame, CA , USA). Pildid tehti ja neid analüüsiti Zeiss LCM 510 konfokaalse mikroskoobiga.

Intratsellulaarse Rosi mõõtmine Intratsellulaarset ROS-i taset mõõdeti voolutsütomeetria abil, kasutades rakupõhist ROS-analüüsi komplekti (Beyotime Biotechnology, Haimen, Hiina Rahvavabariik). Kuue süvendiga plaatidel kasvatatud rakke töödeldi 0 µM, 15 µM, 30 µM, 60 µM või 80 µM ehhinakosiidiga 5 tundi, 12 tundi või 24 tundi, pesti kaks korda PBS-ga ja inkubeeriti 10 µM-ga. μM diklorofluorestseiindiatsetaati 30 minutit temperatuuril 37 kraadi. Seejärel rakud trüpsiiniti ja analüüsiti FACSCaliberi voolutsütomeetriga (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Intratsellulaarsed ROS-i tasemed väljendati rakkude keskmise diklorodihüdrofluorestseiini fluorestsentsi intensiivsusena. Näidatud numbrid olid kolme sõltumatu katse keskmised.

Immunofluorestsentsvärvimine

Katteklaasidel kasvatatud rakke töödeldi {{0}} µM, 15 µM, 30 µM, 60 µM või 80 µM ehhinakosiidiga 5 tundi, 12 tundi või 24 tundi, seejärel pesti üks kord PBS-ga ja fikseeriti 4% paraformaldehüüdi PBS-s 20 minutit ja blokeeriti TBS-is 0,1% Triton X-100 ja 15% veise loote seerumiga 1 tund toatemperatuuril. Fikseeritud rakke värviti 2 tundi toatemperatuuril primaarse antikehaga 8-oksoG (hiire monoklonaalne anti-8-oksoG, Abcam), 53BP1 (küüliku anti-53BP1; Bethyl Laboratories, Montgomery) vastu. , TX, USA) või aktiivne kaspaas-3 (küüliku anti-kaspaas-3, Bioss, Peking, Hiina Rahvavabariik), millele järgneb värvimine Alexa 488-konjugeeritud eesli antihiirega ( Abcam) või Cy{26}}konjugeeritud kitse küülikuvastane antikeha (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, USA) sekundaarset antikeha 1 tund toatemperatuuril. Pärast 3-kordset 5-minutilist pesemist PBS-is suleti katteklaasid slaididele VECTASHIELD paigaldussöötmes koos DAPI-ga (Vector Laboratories). Pildid tehti Zeiss LCM 510 konfokaalse mikroskoobiga.

kolooniate moodustumise test

Päev enne töötlemist külvati rakud kuue süvendiga plaadile kontsentratsiooniga 1 × 10 4 rakku süvendi kohta. Seejärel töödeldi neid 7 päeva 0 μM, 60 μM või 80 μM ehhinakosiidiga. Pärast PBS-ga pesemist fikseeriti rakud jääkülma metanooliga ja värviti kristallvioletse lahusega (Sigma-Aldrich) (0,5% 25% metanoolis). Pildid pildistati pärast plaatide kuivatamist üleöö. Kristallvioletsed kristallid lahustati 70% etanooli lisamisega ja neeldumist 595 nm juures mõõdeti BioRad 680 mikroplaadilugejaga. Andmeid analüüsiti GraphPad Prism tarkvara abil.

MTT analüüs

Üks päev enne töötlemist külvati rakud 96-süvendiga plaatidele kontsentratsiooniga 1 × 104 rakku süvendi kohta, millele järgnes töötlemine ehhinakosiidi seerialahjendustega 24 tundi või 48 tundi või 60 μM ehhinakosiidiga 5 tundi, 12 tundi. või 24 tundi. Sööde eemaldati ja rakke pesti PBS-iga ja seejärel 20 μL 3-(4,5-dimetüültiasool-2-üül)-2,{{15} Igasse süvendisse lisati difenüültetrasooliumbromiidi (MTT) lahust (5 mg/ml PBS-s, pH 7,2) (Thermo Fisher Scientific). Plaate inkubeeriti 37 kraadi juures veel 4 tundi. Lõpuks eemaldati MTT lahus ja igasse süvendisse lisati 150 μL DMSO-d. Plaate inkubeeriti plaadiloksutil 10 minutit ja neeldumist 570 nm juures mõõdeti BioRad 680 mikroplaadilugejaga. Iga katse viidi läbi kaks korda kolmes eksemplaris. Andmeid analüüsiti GraphPad Prism tarkvara abil. IC50 väärtused määrati mittelineaarse regressioonianalüüsi abil.

rakutsükli analüüs

Kuue süvendiga plaatidel olevaid rakke töödeldi 0 μM, 6{{10}} μM või 80 μM ehhinakosiidiga 24 tundi ja koguti trüpsiiniga (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) , pesti kaks korda PBS-ga ja seejärel fikseeriti jääkülma etanooliga (70 protsenti) 2 tundi temperatuuril –20 °C. Fikseeritud rakke pesti kaks korda külmas PBS-is ja resuspendeeriti 300 µl värskelt valmistatud PBS-is, mis sisaldas 0,1 protsenti Triton X-100, 0,2 mg/ml DNaasivaba RNaasi A (Sigma-Aldrich), 10 ug/ml propiidiumjodiidi ( PI) (Hoffman-La Roche Ltd., Basel, Šveits). Pärast 20-minutilist inkubeerimist pimedas 37 kraadi juures filtriti rakud läbi Falcon nailonvõrgu (BD Biosciences), laaditi FAC-SCalibur voolutsütomeetrile ja analüüsiti tarkvara ModFit (BD Biosciences) abil.

DNA fragmentatsiooni analüüs

Kuue süvendiga plaatidel kasvatatud rakke töödeldi 0 µM, 60 µM või 80 µM ehhinakosiidiga 24 tundi ja fikseeriti jääkülmas 4% paraformaldehüüdis (Sigma-Aldrich) 20 minutit. Pärast PBS-ga pesemist suleti rakud VECTASHIELD kinnitussöötmesse DAPI-ga (Vector Laboratories). Tuumamorfoloogiat pildistati Olympuse fluorestsentsmikroskoobiga. DNA fragmentatsiooni tuvastamiseks agaroosgeelidel ekstraheeriti DNA, kasutades QIAamp DNA mikrokomplekti (Qiagen NV, Venlo, Holland) ja elektroforees viidi läbi 2% agaroosgeelidel, mis sisaldasid 0,1 ug/ml etiidiumbromiidi.

Apoptoosi analüüs voolutsütomeetria abil Apoptootilisi rakke uuriti, kasutades anneksiin V-FITC apoptoosi tuvastamise komplekti (Bestbio, Shanghai, Hiina Rahvavabariik), järgides tootja juhiseid. 96-Süvendiga plaatidel kasvatatud rakke töödeldi 0 μM, 15 μM, 30 μM, 60 μM, 80 μM või 160 μM ehhinakosiidiga 2 tundi, 5 tundi, 12 tundi või 24 tundi, pesti kaks korda PBS-ga ja seejärel resuspendeeriti sidumispuhvris. Järgmisena lisati järjestikku 5 μL anneksiin V-FITC ja 5 μL PI (Roche) ning rakke inkubeeriti 15 minutit pimedas toatemperatuuril. Rakud laaditi FACSCalibur voolutsütomeetrile (BD Biosciences) ja andmeid analüüsiti Cell Quest tarkvara (BD Biosciences) abil.

Western blot analüüs

Kuue süvendiga plaatidel kasvatatud rakke töödeldi 0 µM, 6{{10}} µM või 80 µM ehhinakosiidiga 5 tundi, 12 tundi või 24 tundi, pesti kaks korda PBS-ga ja kaabiti plaadilt maha, kasutades 100 μL radioimmunosadestamise puhvrit (150 mM NaCl, 1,0 protsenti IGEPAL CA-630, 0,5 protsenti naatriumdeoksükolaati, 0,1 protsenti naatriumdodetsüülsulfaati). ja 50 mM Tris, pH 8,0) (Sigma-Aldrich), mis sisaldab 1 mM fenüülmetaansulfonüülfluoriidi. Proove tsentrifuugiti 12,000 × g juures 20 minutit 4 kraadi juures. Valgu kontsentratsioonid supernatantides määrati Bradfordi reagendiga (Dingguo, Changchun, Hiina Rahvavabariik). Proove denatureeriti 95 kraadi juures 10 minutit ja eraldati 12% naatriumdodetsüülsulfaat-polüakrüülamiidi geelelektroforeesigeelil. Pärast elektroforeesi kanti valgud polüvinülideenfluoriidmembraanidele (Millipore), millele järgnes blokeerimine Tris-puhverdatud soolalahuses Tween 20-ga (10 mM Tris, pH 7,5; 100 mM NaCl; 0,1 protsenti Tween 20), mis sisaldas 5 protsenti (mass/maht) rasvavaba piim 1 tund toatemperatuuril. Blotte sondeeriti primaarsete antikehadega p21 (Abcam), polü (ADP-riboos) polümeraasi (Bioss) või aktiveeritud kaspaas-3 (Bioss), millele järgnesid mädarõika peroksüdaasiga konjugeeritud sekundaarsed antikehad (Jackson ImmunoResearch Laboratories). Signaalid töötati välja täiustatud kemoluminestsents-Western blotting-tuvastuskomplekti (Transgen Biotech, Changchun, Hiina Rahvavabariik) abil. Katseid korrati kolm korda.

ehhinakosiidcistanche purgisapoptoosivastane toimejaantioksüdatsioon

Mitokondrite mõõtmine

membraani potentsiaal

Mitokondriaalse membraani potentsiaali mõõdeti JC{{0}} värvainega (Biotechnology), järgides tootja juhiseid. Kuue süvendiga plaatidel kasvatatud rakke töödeldi 0 μM, 60 μM või 80 μM ehhinakosiidiga 5 tundi, 12 tundi või 24 tundi, pesti kaks korda PBS-is ja inkubeeriti seejärel 20 minutit JC-1-ga. Pildid tehti Olympuse fluorestsentsmikroskoobiga.

Statistiline analüüs

Statistiline analüüs viidi läbi GraphPad Prism tarkvara abil. Olulisus arvutati ühesuunalise dispersioonanalüüsi abil ja statistiliselt oluliseks peeti P0,05. Tulemused väljendati kui keskmine ± standardhälve.

ehhinakosiidcistanche purgisapoptoosivastane toimeja parandada immuunsust