1. OSA Cistanche Deserticola polüsahhariid pärsib OVX-indutseeritud luukadu hiirtel ja RANKL-indutseeritud osteoklastogeneesi
Mar 02, 2022
Sissejuhatus
Osteoporoos – haigus, mida iseloomustavad luumassi vähenemine, luukoe ebanormaalne mikrostruktuur, suurenenud luude haprus ja luumurrud (De Martinis, Di Benedetto, Mengoli ja Ginaldi, 2006) – mõjutab praegu üle 200 miljoni inimese üle maailma ning on oluline meditsiiniline ja sotsiaalmajanduslik koormus kaasaegsele ühiskonnale (Strom et al., 2011). Osteoporoosi kliiniline ravi keskendub peamiselt hormoonasendus-, bisfosfonaat- või denosumabravile. Need meetodid on tõhusad, kuid tekitavad pikaajalisi kõrvalmõjusid, nagu potentsiaalne risk rinnavähi ja ebatüüpiliste reieluumurdude tekkeks (Black, Bauer, Schwartz, Cummings ja Rosen, 2012; Rachner, Khosla ja Hof-Bauer, 2011). Seetõttu on tungiv vajadus uurida ravimeid, mis ei suuda mitte ainult pärssidaosteoporooskuid neil on ka vähem soovimatuid kõrvaltoimeid.
Cistanche deserticola(CD), Hiinas laialdaselt kasutatav toonik ja ravimtoit, tuntud kui "kõrbeženšen", on kuivatatud mahlane vars koos soomuslehtedega.C. deserticolaYC Ma (Gu, Yang ja Huang, 2016) ning on mitmekesine ja tõhusfarmakoloogilinetegevusednagu immuunregulatsioon, antioksüdatsioon ja anti-osteoporoosomadused (Hu et al., 2020; Li et al., 2012; Zhang et al., 2014). Varasemad uuringud CD toimeainete kohta osteoporoosi ravis keskendusid peamiseltfenüületanoidglükosiidid(Li, Jiang ja Gu, 2018; Xu, Zhang, Wang, Yao ja Ma, 2017). Kuid CD sisaldab ka teisi tõhusaid komponente nagu iridoidid, lignaanid,polüsahhariidid(Wang, Zhang ja Xie, 2012). Traditsioonilise hiina meditsiini (TCM) kliiniline rakendus on peamiselt vee dekokteerimine.Polüsahhariididon vees lahustuvad komponendid ja on kõige tõenäolisemalt TCM-i peamised farmakodünaamilised komponendid. TCM-ist ekstraheeritud polüsahhariididel on metsikult teatatud, et neil on anti-osteoporoostoime ja mõned soovimatud kõrvaltoimed, mida on kliinikutes üldiselt kasutatud (nt polüsahhariidid, mis on ekstraheeritud Epimedium brevicornum'ist (Zheng, He, Wu, Cai ja Wei, 2020), Achyranthes bidentata (Zhang, Zhang, Zhang, Wang ja Yan, 2018) ja Morinda officinalis (Yan et al., 2019)). Seetõttu püstitasime selle hüpoteesiCistanche deserticolapolüsahhariidCD-st eraldatud (CDP) võib olla potentsiaalselt ohutu ravim osteoporoosi raviks.
Tavaliselt säilitavad luu resorptsioon ja luu moodustumine luu ümberkujundamise ajal dünaamilise tasakaalu, mis on kooskõlastatud mitut tüüpi rakkudega, sealhulgas osteoklastide, osteoblastide, luuvoodri rakkude ja osteotsüütidega (Kular, Tickner, Chim ja Xu, 2012). Selle tasakaalu katkemine võib põhjustada mitmesuguseid luu ainevahetushaigusi, naguosteoporoos(Zhu et al., 2018) ja osteoskleroosi (Ihde et al., 2011). Osteoklastid kui mononukleaarsest/makrofaagiliinist pärinevad diferentseerunud rakud on ainsad rakud, millel on luu resorptsiooni funktsioon (Teitelbaum, 2000). Osteoklastide diferentseerumises ja küpsemises osalevad kaks peamist tsütokiini (Koga et al., 2004): makrofaagide kolooniaid stimuleeriv faktor (M-CSF) ja tuumafaktori κB (NF-κB) ligandi (RANKL) retseptori aktivaator. M-CSF vahendab vereloome tüvirakkude diferentseerumist osteoklastide eellasrakkudeks ja soodustab osteoklastide diferentseerumist, reguleerides RANK retseptori ekspressiooni (Takayanagi, 2007). RANKL-i ja RANK-i seondumine osteoklastide rakupinnal toob kaasa järgmised: (1) signaaliadaptermolekulide nagu TNF-i retseptoriga seotud faktor 6 (TRAF6) värbamine; (2) mitme allavoolu sihtmärgi, sealhulgas NF-KB ja mitogeen-aktiveeritud proteiinkinaaside (MAPK) aktiveerimine; ja (3) aktiveeritud T-rakkude, tsütoplasmaatilise 1 (NFATc1) tuumafaktori ekspressioonitasemete ülesreguleerimine (Liu et al., 2019; Yamashita et al., 2007). Nende signaaliradade aktiveerimine reguleerib otseselt osteoklastide geenide, sealhulgas happelise fosfataasi 5 (Acp5) [kodeerib tartraadiresistentset happelist fosfataasi (TRAcP)], maatriksi metalloproteinaasi 9 (MMP9) ja katepsiin K (CTSK) (Boyle, Simonet) ekspressiooni. ja Lacey, 2003). Seetõttu on RANKL-i indutseeritud osteoklastide diferentseerumisega seotud signaaliradade pärssimine osteoporoosi potentsiaalne ravimeetod.
Selles uuringus püüdsime välja selgitada CDP-ravi mõjud munasarjade eemaldamise (OVX) põhjustatud munasarjade eemaldamisele.osteoporooshiiremudel in vivo ja RANKL-i indutseeritud osteoklastide aktiivsus in vitro, keskendudes osteoklastispetsiifiliste geenide ekspressioonile ja NFATc1 ning NF-KB ja MAPK signaaliradade aktiveerimisele. Meie leiud võivad anda uusi teadmisi CDP kui ohutu ja tõhusa ravimi potentsiaalist osteoporoosi raviks.
Lisateabe saamiseks võtke ühendust:Joanna.jia@wecistanche.com
2. Materjalid ja meetodid
2.1. Kemikaalid ja proovide kogumine
CD (nr 180801) osteti ettevõttelt Anhui Jishun Traditional Chinese Medicine Co., Ltd. (Anhui, Hiina) ja selle tuvastas professor Haibo Huang Hiina Guangzhou Hiina Meditsiini Ülikooli Farmaatsiateaduste Koolist. Östradioolvaleraadi tabletid osteti firmalt Bayer (Leverkusen, Nordrhein-Westfalen, Saksamaa). Alfa-modifitseeritud minimaalne oluline keskkond
(-MEM) ja veiseloote seerum (FBS) saadi firmalt Gibco (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Penitsilliin / streptomütsiin ja TRAcP värvimiskomplekt saadi ettevõttest Solarbio (Peking, Hiina). Rekombinantse hiire M-CSF ja rekombinantse hiire RANKL hankis R&D Systems (Minneapolis, MN, USA). Hüdroksüapatiidiga kaetud plaadid osteti ettevõttelt Corning Life Sciences (St. Lowell, MA, USA). NFATc1 ja CTSK primaarsed antikehad (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA); IKB-, p65, P-p65, p38, P-p38, ERK1/2, P-ERK1/2, JNK ja P-JNK (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA); ja -aktiini (CWBIO, Peking, Hiina) saadi ka. Teised selles uuringus kasutatud reaktiivid olid analüütilise kvaliteediga ja vesi puhastati Milli-Q veepuhastussüsteemiga (Millipore, Bedford, MA, USA).
2.2. CDP ekstraheerimine
CD jahvatati peeneks pulbriks ja segati kolm korda petrooleetriga, et see purustada. Tahke jääk koguti filtrimisega ja seejärel kuivatati toatemperatuuril. Thepolüsahhariididekstraheeriti eeltöödeldud proovidest kolm korda veega 2 tundi, kontsentreeriti, sadestati veevaba etanooli lisamisega lõppkontsentratsioonini 80% (maht/maht) ja säilitati temperatuuril 4 °C 24 tundi. Sade koguti tsentrifuugimisega kiirusel 3000 p/min 20 minutit, lahustati destilleeritud vees ja puhastati (vabade valkude eemaldamine), kasutades Sevagi meetodit (Zhao et al., 2019). Tervenenudpolüsahhariididdialüüsiti, kuivatati ja säilitati kuni edasise kasutamiseni. Lisaks näitasid keemilise koostise tulemused, et CDP suhkru, uroonhappe, sulfaadi ja valgu üldsisaldus oli 67.63 0.98 protsenti , 21.05 0.49 protsenti , 1.{{7 }}.24 protsenti ja 8.{10}}.36 protsenti .
CDP monosahhariidide koostis ja Fourier' teisenduse infrapunaanalüüs on näidatud täiendavatel joonistel 1 ja 2.
2.3. OVX-indutseeritud osteoporoosi hiiremudel
Kõik loomkatsed kiitis heaks Guangzhou Hiina meditsiini ülikooli loomaeetika komitee (kinnitatud SYXK 2019-0202). Kolmkümmend 6-nädalast emast C57BL/6 hiirt tarnisid Guangzhou Hiina meditsiini ülikooli katseloomade keskus. Pärast 1-nädalast aklimatiseerumist tehti ühele hiirte rühmale võltsoperatsioon (võltsrühm), ülejäänud hiirtele tehti munasarjade eemaldamise operatsioon (OVX rühm). Pärast operatsiooni lasti hiirtel 1-nädala jooksul taastuda. Seejärel jagati edukalt modelleeritud hiired juhuslikult 5 rühma, kus igas rühmas oli 6 hiirt:
(1) võltsrühm: töödeldud destilleeritud veega, (2) OVX rühm: töödeldud destilleeritud veega, (3) OVX E2 rühm (E2): töödeldud 0.13 mg/kg östradioolvaleraadi tablettidega, (4) ) OVX CDP väikese annuse rühm (CDP-L): töödeldud 300 mg/kg CDP-ga, (5) OVX CDP suure annuse rühm (CDP-H): töödeldud 600 mg/kg CDP-ga. Destilleeritud vett, E2 või CDP-d manustati sondiga üks kord päevas. Kõik hiired surmati pärast 12--nädalast raviperioodi (joonis 1A). Emakad koguti ja kaaluti ning vasak sääreluud koguti järgnevateks uuringuteks. Koguti täisvereproovid ja tsentrifuugiti kiirusel 5000 p/min
15 minutit temperatuuril 4 ◦C. Seerumi supernatandid aspireeriti ja säilitati temperatuuril
—80 ◦C kuni edasise analüüsini.
2.4. Mikrokompuutertomograafia (mikro-CT) analüüs ja luu histomorfomeetria
Vasaku sääreluu fikseeriti 4-protsendilise paraformaldehüüdiga 48 tundi ja asetati seejärel tavalist soolalahust sisaldavatesse tsentrifuugitorudesse. Fikseeritud proovid skaneeriti Skyscan 1172 mikro-CT instrumendiga (Bruker micro-CT, Skyscan, Kontich, Belgia), kasutades järgmisi seadistusi: pinge, 80 kV; lähtevool, 100 μA; Al, 0,5 mm filter; piksel
suurus, 9,76 μm; ja pööramise samm, 0.6◦. Mitmed parameetrid
trabekulaarset luud, sealhulgas luu mineraalset tihedust (BMD), luu mahu fraktsiooni (BV/TV), luu pinda kogumahu kohta (BS/TV), trabekulaarset arvu (Tb. N) ja trabekulaarset vahekaugust (Tb. Sp) mõõdeti kasutades. CT- Analyser® tarkvara (Bruker micro-CT, Skyscan). Kolmemõõtmelised kujutised genereeriti tarkvara CTVol (Bruker micro-CT. Skyscan) abil.
Pärast mikro-CT analüüsi eemaldati vasak sääreluu katlakivi 14-protsendilises EDTA lahuses ja sisestati lõikamiseks parafiini. Enne hematoksüliini ja eosiini (H&E) ja TRAcP värvimiskatseid lõigati proovid mikrotoomi abil 5 µm lõikudeks. Värvitud lõike uuriti ja dokumenteeriti Olympus CX 31 mikroskoobiga (Olympus Optical Co., Ltd, Tokyo, Jaapan).
Cistanchevõib suurendada luutihedust ja leevendada osteoporoosi
2.5. Seerumi analüüs
Kaltsiumi (Ca) ja fosfori (P) kontsentratsioonid määrati vastavalt komplekti juhistele, mille koostas Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing, Hiina). TRAcP-5b ja RANKL-i taset seerumis analüüsiti vastavalt TRAcP-5b ELISA komplekti (CUSABIO, Wuhan, Hiina) ja RANKL ELISA komplekti (Cloud-CloneCorp., Wuhan, Hiina) abil.
2.6. In vitro osteoklastogeneesi test
BMM-id eraldati 6-nädala vanuste emaste C57BL/6 hiirte sääreluust ja reieluust. Eraldatud rakke kultiveeriti -MEM söötmes, mis sisaldas 25 ng/ml M-CSF-i, 10 protsenti FBS-i ja 1 protsenti penitsilliini/streptomütsiini. Konfluentsuse saavutamisel külvati BMM-id (1 104 rakku süvendi kohta) 96-süvendiga plaatidele ja töödeldi CDP-ga 50 ng/ml RANKL-i juuresolekul. Sööde ja CDP vahetati iga 2 päeva järel. 7 päeva pärast fikseeriti rakud 4% paraformaldehüüdiga ja värviti TRAcP olemasolu suhtes. Osteoklastide arv, mis defineeriti kolme või enama tuumaga TRAcP-positiivsete rakkudena, loendati ja dokumenteeriti valgusmikroskoobiga.
2.7. Rakkude proliferatsiooni test
BMM-id (1 × 104 rakku süvendi kohta) külvati 96-süvendiga plaadile ja inkubeeriti üleöö. Pärast seda töödeldi rakke 48 tundi CDP erineva kontsentratsiooniga (0, 0,625, 1,25, 2,5, 5, 10, 20 ja 40 µg/ml). Rakkude liitumine tuvastati ja analüüsiti IncuCyte ZOOM® (Essen BioScience, Ann Arbor, MI, USA) abil, mis on pikaajaline reaalajas dünaamiline elusrakkude kuvamissüsteem.
2.8. Hüdroksüapatiidi resorptsiooni test
BMM-id ({0}} rakku süvendi kohta) külvati hüdroksüapatiidiga kaetud plaadile, töödeldi CDP-ga näidatud kontsentratsioonides (0, 5 ja 10 µg/ml) ja kultiveeriti täielikus -MEM-is. mis sisaldab 25 ng/ml M-CSF-i ja 50 ng/ml RANKL-i. 7 päeva pärast pesti rakke rakukomponentide eemaldamiseks 10% pleegituslahusega. Hüdroksüapatiidi resorptsioonipiirkondade kujutised jäädvustati IncuCyte ZOOM® abil ja analüüsiti ImageJ tarkvara abil (NIH, Bethesda, MD, USA) (Abramoff, Magelhaes ja Ram, 2003).
2.9. RNA eraldamine ja reaalajas pöördtranskriptsiooni-kvantitatiivne PCR (RT-qPCR) analüüs
BMM-id ({{0}} rakku süvendi kohta) külvati 6-süvendiga plaadile ja stimuleeriti RANKL-i ja M-CSF-iga CDP juuresolekul erinevates kontsentratsioonides (0, 5 ja 10). µg/ml) 5 päeva jooksul. Kogu RNA eraldati hiirte rakkudest või luukoest, kasutades TRIzol reagenti (Sigma-Aldrich). Komplementaarne DNA sünteesiti 2 µg kogu RNA-st, kasutades pöördtranskriptaasi komplekti (TransGen Biotech, Peking, Hiina). RT-qPCR reaktsioonid valmistati, kasutades PerfectStart™ Green qPCR SuperMixi (TransGen Biotech) ja tuvastati ABI 7500 süsteemiga (Applied
Biosystems, Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA). PCR-i tsükliparameetrid määrati järgmiselt: 95 °C 5 minutiks, millele järgnes 40 tsüklit temperatuuril 95 °C 15 sekundit ja 60 °C 30 sekundit. Kasutatud spetsiifilised praimerid on näidatud tabelis 1 ja iga sihtgeeni kogus normaliseeriti GAPDH-le (sisekontroll).
2.10. Western blot analüüs
BMM-id ({{0}} rakku süvendi kohta) külvati 6-süvendiga plaadile. Lühiajaliste katsete jaoks eelinkubeeriti rakke 1 tund CDP erinevate kontsentratsioonidega (0, 5 ja 10 µg/mL) ning seejärel töödeldi 30 minutit 50 ng/ml RANKL-iga. . Pika aja jooksul stimuleeriti rakke 50 ng/ml RANKL-iga 3., 5. ja 7. päeval CDP juuresolekul (0, 5 ja 10 ug/ml). Kogu valgud ekstraheeriti RIPA lüüsipuhvriga (CWBIO). Valgud eraldati 10% SDS-PAGE abil ja kanti üle PVDF membraanidele. Membraanid blokeeriti 5% kooritud piimaga toatemperatuuril 2 tundi ja inkubeeriti primaarsega
antikehi üleöö temperatuuril 4 ◦C ja seejärel vastava sekundaarsega
antikehad 1,5 tundi. Membraanid töötati välja ECL-reaktiividega (Millipore Corp., Billerica, MA, USA) ja kujutised tehti Tanon 5200 Chemiluminescence Imaging Systemiga (Tanon Science and Technology, Shanghai, Hiina).
Cistanchevõib suurendada luutihedust
2.11. NFATc1 translokatsiooni tuvastamine immunofluorestsentstesti abil
BMM-id külvati {{0}}kaevu katteklaasidele, stimuleeriti RANKL-i ja M-CSF-iga ning töödeldi 10 µg/ml CDP-ga 5 päeva. Rakud fikseeriti 4% paraformaldehüüdiga 15 minutit, pesti kolm korda PBS-iga ja permeabiliseeriti 0,1% Triton X-100-ga 10 minutit. Rakud segati 10% kitse seerumiga (CWBIO) ja inkubeeriti 2 tundi. Seejärel inkubeeriti rakke primaarse antikehaga üleöö temperatuuril 4 °C ja seejärel Alexa Fluor 488 kitse hiirevastase sekundaarse antikehaga (Abcam, Cambridge, MA, USA) pimedas 1 tund. Katteklaase pesti PBS-ga, paigaldati Prolong Gold Antifade Reagendisse koos 4′, 6-diamidino-2-fenüülindooliga (DAPI) (päikeseenergia) ja
kontrolliti Zeiss LSM 800 abil Airyscan konfokaalse mikroskoobiga (Carl Zeiss, Oberkochen, Saksamaa).
2.12. Statistiline analüüs
Kõiki katseandmeid analüüsiti SPSS 25.0 statistikatarkvara abil (IBM Corporation, Armonk, NY, USA). Loom- ja rakuuuringute andmed on väljendatud vastavalt keskmistena ± SEM ja keskmistena ± SD. Tulemused kasutavad ühesuunalist dispersioonanalüüsi või Studenti t-testi. Väärtusi p < 0,05="" peeti="" statistiliselt="">
Cistanchesaab vähendadaapoptoosja tugevdada luudtihedus
