1. osa krooniline neeruhaigus ja vananemine vähendavad erinevalt C57Bl/6 hiirte luumaterjali ja mikroarhitektuuri

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Krooniline neeruhaigus ja vananemine vähendavad C57Bl / 6 hiirte luumaterjali ja mikroarhitektuuri erinevalt

Chelsea M. Heveran1, Charles Schurman2,*, Claire Acevedo3, Eric W. Livingston4, Danielle Howe5, Eric G. Schaible6, Heather Hunt7, Adam Rauff8, Eve Donnelly7,#, R. Dana Carpenter9, Moshe Levi10, Anthony Bate Lauman5, Ted , Tamara Alliston2,*, Karen B. King11, Virginia L. Ferguson1

1 Colorado ülikooli masinaehituse osakond, Boulder, CO

2 Ortopeedilise kirurgia osakond, California ülikool, San Francisco, CA

3TÜ Salt Lake City Utah ülikooli masinaehituse osakond

4 Biomeditsiinitehnika osakond, Põhja-Carolina ülikool, Chapel Hill, NC

5 Biomeditsiinitehnika osakond, New Jersey kolledž, Ewing, NJ

6 Advanced Light Source, Lawrence Berkeley National Laboratory, Berkeley, CA

7 Materjaliteaduse ja tehnika osakond, Cornelli ülikool, Ithaca, NY

8 Bioinseneri osakond, Colorado ülikool, Denver, CO

9 Colorado ülikooli masinaehituse osakond, Denver, CO

10 Biokeemia ning molekulaar- ja rakubioloogia osakond, Georgetowni ülikool, Washington DC

11 Ortopeedia osakond, Colorado ülikooli meditsiinikool, Aurora, CO *California ülikool Berkeley – California San Francisco ülikooli bioinseneri kraadiõppe programm, San Francisco, CA

# Erikirurgia haigla uurimisosakond, New York, NY

Cistanche võib aidata neeruhaiguste korral

Abstraktne

Krooniline neeruhaigus (CKD) on tavaline vananemisega kaasnev haigus, mis suurendab luumurdude riski ainult kõrges eas. Vananemine ja krooniline neeruhaigus kahjustavad erinevalt luude ainevahetust ja mineraliseerumist. Seega oletame, et luukvaliteedi kaotus oleks suurim kõrge vanuse ja kroonilise neeruhaiguse kombinatsiooni korral. Hindasime noorte täiskasvanud (6 kuud), keskealiste (18 kuud) ja vanade (24 kuud) isaste C57Bl/6 hiirte luud kolm kuud pärast 5/6 nefrektoomiat, et kutsuda esile kroonilise neeruhaiguse või võltsprotseduure. CKD süvendas vananemisega seotud kortikaalse ja trabekulaarse mikroarhitektuuri kadu. Vananemine ja krooniline neeruhaigus andsid mõlemad tulemuseks õhemad, poorsemad ajukoored ning vähem ja õhemad trabekulid. Luumaterjali kvaliteet vähenes ka kroonilise neeruhaigusega ja need muutused luumaterjalis erinesid vanusest tingitud muutustest. Vananemine vähendas kogu luu paindetugevust ja moodulit, mikromeetri skaala nanoindentatsioonimoodulit ning nanomeetri suurust koe ja kollageeni tüve (väikese nurga röntgenikiirguse hajumine (SAXS)). Seevastu CKD vähendas tööd kuni luumurdude ja luukoe mooduli ja koostise varieerumiseni (Ramani spektroskoopia) ning suurendas kollageeni tüve protsenti. Suurenenud kollageeni tüvekoormus oli seotud kroonilise neeruhaiguse sitkuse vähenemisega. Lisaks muutusid osteotsüütide lüngad Sham-hiirte vanusega väiksemaks, hõredamaks ja korrapäratumaks, kuid neid vanusega seotud muutusi ei täheldatud kroonilise neeruhaiguse korral selgelt. Kuid kroonilise neeruhaiguse korral korreleerusid suuremad lüngad positiivselt suurenenud seerumi fosfaaditasemega, mis viitab sellele, et osteotsüüdid mängivad rolli süsteemses mineraalide homöostaasis. See töö näitab, et krooniline neeruhaigus vähendab luu kvaliteeti, sealhulgas mikroarhitektuuri ja luumaterjali omadusi, ning et luukvaliteedi langus vanusega lisandub kroonilise neeruhaigusega. Need leiud võivad aidata ühitada, miks luumass ei ennusta järjekindlalt luumurdeid kroonilise neeruhaigusega populatsioonis, ja ka seda, miks on kroonilise neeruhaigusega vanematel inimestel suur hapruse risk.

Märksõnad: CKD; vananemine; luu kvaliteet; luude haprus; kollageen

1. Sissejuhatus

Krooniline neeruhaigus (CKD) mõjutab hinnanguliselt 23–36 protsenti eakatest inimestest ning seda seostatakse suurenenud luumurdude riski ja luumurdudega seotud suremusega (1, 2). Kuigi luumassi kadu (mõõdetuna kahe energiaga röntgenikiirguse absorptiomeetriaga) ennustab luumurdude teket kroonilise neeruhaiguse kõikides staadiumides, on madala luumassi ja kroonilise neeruhaigusega vanematel inimestel suurem tõenäosus luumurdude tekkeks võrreldes nendega, kellel on madal luumass ja terve neerud. funktsioon (3). Luumurdude risk suureneb kroonilise neeruhaigusega üldiselt võrreldes ainult vananemise mõjuga (4, 5). Näiteks kolmeaastases uuringus suurenes keskmise kuni lõppstaadiumis kroonilise neeruhaigusega 40–65-aastastel isikutel luumurdude esinemissagedus 1,7–5,1 korda võrreldes vastava vanusega kontrollrühmadega, samas kui 65-aastastel ja vanematel inimestel suurenes kroonilise neeruhaiguse esinemissagedus jätkuvalt. luumurd 1,8–4,3 korda suurem kui kontroll (4).

trabekulaarse luu mikroarhitektuur (10, 13), samas kui teised ei teatanud kontrolliga võrreldes muutusi (9). Kuigi need uuringud erinevad näriliste liikide ja tüvede, kroonilise neeruhaiguse esilekutsumise meetodi ja mõõdetud tulemuste osas, pakuvad need varasemad tööd olulisi tõendeid selle kohta, et krooniline neeruhaigus muudab luude kvaliteeti.

Jääb mitu võtmeküsimust selle kohta, kuidas krooniline neeruhaigus luu kvaliteeti halvendab, mil määral on luu kvaliteedi langus tingitud mineraal- ja orgaanilise faasi defektidest ning kuidas luu kvaliteedi muutused mõjutavad luukoe tugevuse vähenemist. Nimelt, kuigi mõned uuringud on tuvastanud muutusi kollageeni ristsidemetes ja koe küpsuses (st aja jooksul pärast luu moodustumist) kroonilise neeruhaiguse korral, ei ole teada, kas CKD muudab kollageenikiudude nanomõõtmelisi interaktsioone mehaanilise koormuse ajal ja kas need muutused nanomehaanikas mõjutavad kogu -luu sitkus (11, 12). Laiemas plaanis ei ole veel teatatud luu kvaliteedi ja mehaanika muutuste hindamisest vastusena kroonilise neeruhaigusele nano- kuni terve luu pikkuse skaaladest.

Osteotsüütide roll luu kvaliteedi mõjutamisel kroonilise neeruhaiguse ja vananemise korral on samuti ebakindel. Need rakud käituvad ebanormaalselt, suurendades oluliselt FGF23 ekspressiooni CKD progresseerumise alguses (7, 14). Osteotsüüt on oluline luumaterjali kvaliteedi säilitamiseks ja luumurdude vastupanuvõime reguleerimiseks (15–17). Osteotsüütide tervist näitab osaliselt lakunaarne morfoloogia. Osteotsüütide lakunaarsed morfoloogiad muutuvad, kui osteotsüüt osaleb mineraalide homöostaasis, nagu laktatsiooni (18, 19) ja x-seotud hüpofosfateemia (20) korral. Lacunaarne geomeetria võib muutuda ka väiksemaks, hõredamaks ja korrapäratumaks nii vananemise kui ka kasutuseta (21–23). Osteotsüütide lakunaarse morfoloogia muutused kroonilise neeruhaigusega võivad mõjutada luukoe tüvesid, struktuuri terviklikkust ja osteotsüütide mehaanilist tundlikkust (24). Ei ole veel teada, kas krooniline neeruhaigus mõjutab osteotsüütide lakunaarseid morfoloogiaid ja kas selline seos võib vananedes muutuda.

Kuigi levinumad kroonilise neeruhaiguse populatsioonid hõlmavad vanemaid täiskasvanuid, tuleb vananemise ja kroonilise neeruhaiguse koosmõju luu kvaliteedile veel uurida. Varasemad tööd on näidanud, et vananemine vähendab kogu luu moodulit, tugevust ja murdumist painutamisel (25), luumurdude tugevust (26), kortikaalse ja trabekulaarse luu mikroarhitektuuri (27–29) ning suurendab mineraalide sisaldust ja küpsust (30, 31). Need vananemisega kaasnevad muutused luus on segadust tekitavad ja esinevad mitme pikkusega skaalal, kusjuures luukoe materjali ja struktuuri muutused mõjutavad kogu luu mehaanikat. Vanusega seotud muutusi luumaterjalis ja luumahus mõjutavad osaliselt luukoe ringluse vähenemine (st koe kõrgem küpsus) ja negatiivne tasakaal luu mitmerakulises üksuses (30, 32). Sellised vanusega seotud muutused on vastuolus ebanormaalse luuvahetuse ja mineraliseerumisega, mis sageli esineb kroonilise neeruhaigusega. Mikroarhitektuuri kadu on seotud negatiivse tasakaaluga, mida on oodata vananedes ja mis võib tekkida kroonilise neeruhaiguse korral (9, 10, 13). Kudede küpsus aga suureneb koos vananemisega ja väheneb suure käibega kroonilise neeruhaiguse taustal. Luu hapruse aluse mõistmisel kroonilise neeruhaiguse korral on olulisi lünki, samuti seda, kuidas vananemine ja krooniline neeruhaigus kombineerituna vähendavad luu kvaliteeti ja resistentsust murdude vastu. Vananemise ja kroonilise neeruhaiguse koosmõju selgitamine luu kvaliteedile täidaks need teadmiste lüngad.

Selle uuringu eesmärk oli uurida vananemise ja kroonilise neeruhaiguse kombineeritud mõju luu kvaliteedile nano-läbi terve luu pikkuse skaaladest kroonilise neeruhaiguse kirurgilises mudelis vananevatel hiirtel. Me oletasime, et krooniline neeruhaigus ja vananemine vähendavad mõlemad luu kvaliteeti, kuid need kaks tegurit mõjutavad luukoe materjali omadusi erinevalt ja negatiivselt. Lisaks oletasime, et vanaduse ja kroonilise neeruhaiguse koosmõju kahjustab luu kvaliteeti kõige rohkem. Nende hüpoteeside hindamiseks hindasime luu kvaliteeti, sealhulgas kortikaalset ja trabekulaarset mikroarhitektuuri ning kortikaalse luu materjali omadusi noortel täiskasvanutel vanade hiirte kaudu, kellel oli krooniline neeruhaigus, mis oli indutseeritud 5/6 nefrektoomiaga (5/6 Nx) või võltsoperatsioonidega.

Tistanche kohta

2. Meetodid

2.1 Loomade mudel ja proovide ettevalmistamine

Isased C57Bl/6 hiired saadi riiklikust vananemiskolooniast 3, 15 ja 21 kuu vanuselt. Hiiri hoiti 12-h valguse / 12-h pimeduse tsüklis, majutati individuaalselt polükarbonaadist puurides standardse allapanuga, toideti Harlan Teklad 2920X toiduga ja neile võimaldati vaba juurdepääs veele. Kõigi kolme vanuse jaoks määrati hiired juhuslikult CKD või Sham rühmadesse. CKD rühmale tehti kaheetapiline nefrektoomia. Neid protseduure kirjeldati varem (33). Lühidalt, vasaku neeru juurde pääses keskjoone sisselõike kaudu, mis eemaldati kusejuhi ja neerupealiste kahjustuste vältimiseks kapslitest ning seejärel eemaldati. Nädal hiljem eemaldati parem neer kapslist ning ülemine ja alumine poolus lõigati osaliselt välja, et saavutada neerumahu vähenemine 2/3 võrra. Kontrollrühmale tehti võltsprotseduurid (st keskjoone sisselõige ilma neerukahjustusteta) sama aja jooksul. Hiired anesteseeriti protseduuride ajal 1,5-protsendilise isofluraaniga. Buprenorfiini operatsioonijärgne annus (0,5 mg/kg) manustati pärast neid protseduure ja enne taastumist, samuti iga 12 tunni järel järgmise kahe päeva jooksul. Hiired surmati kolme kuu pärast CO2 ja emakakaela dislokatsiooni kaudu. Uuringu lõpp-punktis olid hiired 6 (noor täiskasvanud; võlts: n=6, krooniline haigus: n=7), 18 (keskealine; võlts: n=8; krooniline haigus: n { {25}}) ja 24 (vana; näilik: n=8; krooniline haigus: n=8) elukuune. Kõik loomkatsed kiitis heaks Colorado Denveri ülikooli institutsionaalne loomade kasutamise ja hooldamise komitee.

Vasak reieluu, sääreluu, õlavarreluu, raadius ja küünarluu reserveeriti luu kvaliteedi analüüsideks. Vasakut sääreluu säilitati 70% etanoolis temperatuuril 4 °C. Kõik ülejäänud luud mähiti fosfaadiga niisutatud marli ja hoiti analüüsimiseni temperatuuril –20 °C.

2.2 Seerumi ja uriini keemia

Uuringu lõpp-punktis kogutud vere ja uriiniga viidi läbi seerumi biokeemilised analüüsid. Seerumi ja uriini uurea, samuti seerumi fosfaadi, kaltsiumi ja PTH kontsentratsioonid mõõdeti vastavalt tootja juhistele (vastavalt BioAssays Systems ja Immunotropics).

2,3 mikroCT

Mikroarhitektuuri hinnati reieluu keskosa kortikaalse luu ja proksimaalse sääreluu trabekulaarse luu jaoks, kasutades mikroCT-d kõigi uuritavate hiirte puhul (μCT, Scanco 80, Scanco AG, Basserdorf, Šveits). Reieluud sulatati enne skaneerimist üleöö temperatuuril 4 °C. Skaneerimine viidi läbi voksli suurusega 10 µm, järgides eelnevalt kirjeldatud hankimis- ja analüüsimeetodeid (10). Ajukoore parameetrite hulka kuulusid luu maht / kogumaht (BV/TV), luu pindala / kogupindala (BA/TA), kortikaalne poorsus (Ct. Po), kortikaalne paksus (Ct. Th), kogu mineraaltihedus (TMD), hetk inerts mediaal-lateraalse telje (IML) ümber, tsentroidi ja luu pinna vaheline kaugus eesmise-tagamise suunas (C) ja polaarne inertsimoment (pMOI) (34). Trabekulaarsete parameetrite hulka kuulusid trabekulaarne arv (Tb.N), trabekulaarne vahekaugus (Tb.Sp), trabekulaarne paksus (Tb.Th), luu maht (BV), kogumaht (TV), luu maht / kogumaht (BV/TV), mahuline luu mineraaltihedus (vBMD) ja ühenduvustihedus (Conn.D). Pärast mikroCT-d mähiti reieluud uuesti fosfaadiga niisutatud marli ja hoiti järgnevaks kogu luu mehaaniliseks iseloomustamiseks temperatuuril -20 ° C.

2.4 Terve luu mehaanilised ja materjali omadused

Pärast mikroCT-d läbisid vasaku reieluu kolmepunktiline painutamine (Insight II materjali testimissüsteem, 250 N koormusandur, MTS Systems Corporation, Eden Prairie MN). Reieluud eemaldati fosfaatpuhverdatud soolalahusega niisutatud marlilt ja testiti läbipaindekiirusega 5 mm/min 8 mm laiusega kohandatud alasil. Koormuse-nihke kõveraid analüüsiti mehaaniliste omaduste, sealhulgas jäikuse, maksimaalse koormuse, nihke maksimaalse koormuse korral, energia maksimaalse koormuse korral, koormus tootlikkuse korral, nihke saagisel, energia tootlikkuse korral, tootlikkuse järgse nihke, koormuse murdmisel, nihke murdmisel, ja energia murdumisel. Joonepiiri määrati kui lõikejoone lõikepunkti, mis on tõmmatud 10-protsendilise kalde vähenemisega võrreldes esialgse puutuja jäikuse ja koormuse-nihke kõveraga. Kasutades µCT-st saadud IML-i ja C-d, hindasime kolmepunktilise paindeandmete põhjal materjali omadusi, sealhulgas paindemoodulit, voolavuspinget, lõplikku pinget ja tugevust, kasutades standardseid tala paindevõrrandeid, mida rakendati hiire reieluule (35).

2.5 Proksimaalse sääreluu jäikuse lõplike elementide analüüs

Luu mehaanilise käitumise uurimiseks kasutati igas mudelis proksimaalse sääreluu aksiaalset kokkusurumist simuleerides arvutuslikku lõplike elementide (FE) modelleerimist. Proksimaalne sääreluu valiti seetõttu, et sääreluu on hiirtel kandevõimeline struktuur ja see on tavaline luu omaduste analüüsikoht mikroCT abil. Proksimaalse sääreluu (kortikaalne ja trabekulaarne luu) MicroCT kujutise andmed eksporditi 16--bitiste DICOM-kujutise viiludena, et täiendavalt segmenteerida ja konstrueerida subjektipõhiseid lõplike elementide mudeleid. DICOM-i kujutise andmed imporditi Mimics Innovation Suite 18-sse (Materialise, Leuven Belgia) kujutise töötlemiseks ja segmenteerimiseks, et luua vastav FE-mudel sama luu proksimaalse sääreluu piirkonna jaoks, mida analüüsiti mikroCT-ga. Luukoe eraldati pildil teistest kudedest, kasutades segmenteerimisläve 313 mg/cm3 (36,37). Kui luu piirkond oli segmenteeritud, eksporditi subjektipõhine FE-võrk, mis sisaldas nii kortikaalset kui ka trabekulaarset sektsiooni. FE mudelis kasutati 10 µm isotroopse elemendi suurusega kuuseedrilist FE võrku.

Mimicsist eksporditud FE-võrgud imporditi ABAQUS CAE 6.9-sse materjali omaduste määramiseks, piirtingimuste rakendamiseks ja aksiaalse mehaanilise koormuse simuleerimiseks. Luu materjaliomadused olid homogeensed, isotroopsed ja lineaarselt elastsed (Youngi moodul, E= 10 GPa ja Poissoni suhe, v= 0.3). Aksiaalse kokkusurumise simuleerimiseks rakendati luu alumise pinna sõlmedele fikseeritud piirtingimus ja sõlmedele rakendati 5 μm (0,5 protsenti luu segmendi kõrgusest) allapoole nihkumist. luu ülemine pind. Luu struktuurne jäikus arvutati reaktsioonijõuna (N) rakendatud nihke kohta.

2.6 Väikese nurgaga röntgenikiirguse hajumine

Kollageenfibrillide deformatsiooni mõõdeti kombineeritud küünarluude ja raadiuste üheteljelise pingetesti ajal, kasutades sünkrotroni väikese nurga röntgenikiirguse hajumist (SAXS) valgusvihu 7.3.3 juures Advanced Light Source (LBNL, Berkeley, CA) (38). Luud kinnitati nende distaalses ja proksimaalses otsas olevate klambrite vahele liimi ja liivapaberiga. Tundmatustestid viidi läbi TST35{11}} tõmbekatse etapiga (Linkam Scientific Inc.) hüdraatunud proovidega nihkekiirusel 2,5 µm/s. Katsetamise ajal eksponeeriti luu diafüüsi röntgenikiirgusele 10 keV 0,1 sekundit iga 5 sekundi järel. Kogu kiirgus oli piiratud 30 kGy-ga, et leevendada kokkupuute mõju mehaanilisele jõudlusele (39). Kollageeni d-vahekaugus, mis esindab kollageeni superstruktuuri korduvaid tühikuid, näib SAXS-i mustris silmapaistva Braggi difraktsioonipiikina. Kollageenispetsiifilist deformatsiooni mõõdeti kogu tõmbekatse ajal, jälgides Braggi piigi positsioonide nihkumist koormuse suurenemise korral. Kasutades kohandatud LabVIEW programmi, muudeti see hajumismustri järkjärguline muutus kollageeni fibrillide tüveks, normaliseerides d-vahega nullkoormusel, nagu eelnevalt kirjeldatud (40). Kudede pinge arvutati testimisetapil registreeritud jõudude jagamisel testitud luude ristlõike pindala mõõtmistega. Küünarluu ja raadiuse summeeritud ristlõikepindalad mõõdeti küünarluu pikkuse keskpunktist ereda välja peegeldava kujutise abil (Leica DM, 20x objektiiv) ja kvantifitseeriti ImageJ-ga (41). Terve luukoe tüved saadi kohandatud digitaalse kujutise korrelatsiooni (DIC) MATLAB paketiga, mis jälgis ja mõõtis kogu testimise ajal luuproovi peal olevate punktide ruudustiku vahelisi kaugusi. Saadud DIC tüved kombineeriti koetaseme pingetega, et luua standardsed pinge-deformatsiooni kõverad. Nendest kõveratest eraldati lineaarne elastsusmoodul, aga ka voolavuspinge ja tootlikkuse deformatsioon, mis on määratletud 0,2-protsendilise nihkega voolavuspiiriga. Kudede tüve sobitati ajaliselt SAXS-i kollageenitüvedega saagise ja maksimaalse pinge korral, et võrrelda deformatsiooni ajal pinget kandvaid komponente luuga.

Küünarluu/raadiuse komposiidi kontrollitud analüüs tõmbekatse ajal viidi läbi, sobitades digikaamera piltidelt koetaseme pinget tüvedega, mis arvutati röntgenikiirguse hajumise mustritest. Kaks koolitatud vaatlejat vaatasid digitaalvideod iseseisvalt läbi luumurdude ja kudede libisemise (nt küünarluu ja raadiuse vahelise libisemise) suhtes. Need sündmused sobitati seejärel deformatsioonikõveratega ja kõik pinge-deformatsiooni andmed kärbiti esimese murruga. Analüüsis võeti arvesse ainult andmeid kuni esimese luumurruni. Proovid jäeti välja, kui tõmbekäepidemete ja luude vahel oli libisemine või kui raadiuse vahel oli libisemine enne esimest murdumist. Proovid jäeti välja ka siis, kui koe ja SAXS-i deformatsioonikõverate vahel oli halb vastavus, mis näitab, et kiire koht oli keskendunud küünarluule, kuid suurem osa tüvest kandus üle raadiusele.

2.7 Mikroskaala luukoe koostise ja mooduli hindamine kohapeal

Pärast kolmepunktilist painutamist dehüdreeriti reieluud histoloogiliselt etanoolis, puhastati atsetoonis ja sisestati PMMA-sse. Sisseehitatud luud lõigati reieluu keskvõlli juurest väikese kiirusega teemantsaega (Isomet, Buehler, Lake Bluff, IL). Proovid lihviti märja ränikarbiidpaberiga (60{{10}} ja 1200 grit) ning poleeriti seejärel alumiiniumoksiidi pastadega (9, 5, 3, 1, 0,1, 0,05 µm) ja Rayoni peeneid riideid (South Bay Technologies, San Clemente, CA) kuni lõpliku viimistluseni 0,05 µm. Proove töödeldi ultraheliga iga poleerimisetapi vahel.

Ramani spektroskoopia viidi läbi kaartidel, mis hõlmasid ajukoore paksust kohandatud süsteemiga: Renishaw inVia konfokaalne mikroskoopiasüsteem (Renishaw, Wotton-under-Edge, Gloucestershire, Ühendkuningriik), kasutades 785 nm lainepikkusega laservalgust, mis suunati läbi fiiberoptiliste kaablite 5{ {4}}x objektiiv (NA 0,75), mis on paigaldatud nanoindenteri Z-astmele (TI 950, Hysitron, Minneapolis, MN). Iga asukoha kohta koguti 10 10-sekundilist säritust. Kolmest taandest koosnevad read, mis olid üksteisest 15 µm kaugusel, ulatusid iga 10 µm järel läbi kortikaalse paksuse.

Fluorestseeruv baasjoon lahutati 11. järgu polünoomilise sobivusega ja kosmilised kiired eemaldati tarkvara Renishaw WIRE abil. Igast punktist lahutati kohandatud MATLAB-koodi abil võrdlus-PMMA-spekter. Seejärel analüüsiti neid korrigeeritud spektreid proliini (855 cm-1), ν1 fosfaadi (961 cm-1) ja ν1 karbonaadi (1071 cm-1) suhtes. Seejärel arvutati mineraal-maatriksi (fosfaat:proliin) pindala suhted,

karbonaat: fosfaat ja kristallilisus (poollaiuse pöördväärtus v1 fosfaadipiigi maksimaalsel kõrgusel).

Seejärel viidi nanoindentatsioon läbi kohtades, mis sobitati Ramani spektroskoopiaga hinnatud kohtadega. 5 µm sfääriline ots süvendas luu kiirusel 30 nm/s, kuni saavutati maksimaalne sügavus 500 nm. Seda sügavust hoiti 120 sekundit, et võimaldada viskoelastse energia hajumist. Vähendatud moodul (Er) arvutati Oliver-Pharri analüüsi abil, võttes arvesse mahalaadimiskõvera esimest 45 protsenti (42,43).

2.8 Kõrgfektiivne vedelikkromatograafia

Õlavarreluu lõigati kõigist pehmetest kudedest lahti ja luuüdi eemaldati veega. Humeri oli C ja seejärel tsentrifuugiti, et aurustada liigne HCl. Filtreeritud proovid lahjendati 1:5 10 protsendilises atsetonitriilis ja 0.05 protsendilises heptafluorovõihappes (HFBA), laaditi pöördfaasilisele Gemini-NX C{{7}. } kolonni (Phenomenex, Torrance, CA) ja analüüsiti hüdroksülüülpüridinoliini (HP), lüsüülpüridinoliini (LP) ja pentosidiini ristsidemete suhtes, mis on kooskõlas Bank jt (44) kirjeldatud meetoditega. HPLC süsteemi üksikasju (mudel 126, Beckman-Coulter, Fullerton, CA) kirjeldatakse pikemalt Oren et al (45). Kollageeni ristsidemete eraldamine hõlmas järgmist protokolli: 15 min. lahusti, mis sisaldab 24 protsenti metanooli ja 0,15 protsenti HFBA-d, 10 min. 40% metanooli ja 0,05% HFBA-d sisaldavat lahustit ning 10 min. 75% atsetonitriili ja 0,1% HFBA-d sisaldav lahusti. Kolonni tasakaalustati 24% metanooli ja 0,15% HFBA-ga vähemalt 10 minutit. proovikäikude vahel. Kollageeni ristsidemete piigid mõõdeti fluorestsentsdetektoriga (FP1520, JASCO; Easton, ML). Ergastuse ja emissiooni lainepikkused olid vastavalt 295 nm ja 400 nm HP ja LP puhul. Pentosidiin tuvastati 328 nm ergastuse ja 378 nm emissiooniga. Kalibreerimiskõverad koostati puhastatud HP ja LP (Quidel Corporation) ja pentosidiini (L. Sayre, Case Western Reserve University, Cleveland, OH) sisaldava kalibraatori viie lahjenduse mõõdetud intensiivsuste põhjal.

Seejärel normaliseeriti ristsidemete kontsentratsioonid kollageeni kontsentratsiooniga. Kollageeni määrati hüdroksüproliini kontsentratsiooni järgi proovis, mida analüüsiti ristsidemete suhtes. Ristsidemete suhtes analüüsitud proovi alikvoot lahjendati 1:50 ja derivatiseeriti 9-fluoronüülmetüülkloroformiaadiga (46). Aminohapete protokolli jaoks kasutati järgmisi lahuseid (1) 20 mM sidrunhapet, 5 mM tetrametüülammooniumkloriidi ja 0,01 protsenti naatriumasiidi, pH 2,85; (2) 20 mM naatriumatsetaati, 5 mM tetrametüülammooniumkloriidi ja 0,01 protsenti naatriumasiidi, pH 4,5, ja (3) 100 protsenti atsetonitriili. Gradiendi elueerimise profiil on järgmine: 0–11,5 min. gradient 75 protsenti (1) / 25 protsenti (3) kuni 60 protsenti (1) / 40 protsenti (3), 13 min. üleminek 64 protsendile (2) / 36 protsendile (1), 13,1–18 min. gradient 64 protsenti (2) / 36 protsenti (3) kuni 62 protsenti (2) / 38 protsenti (3), seejärel 18 min. lülitus 25 protsendile (2) / 75 protsendile (3) kuni töötamise lõpuni 23 minutiga. Kolonn tasakaalustati 75 protsenti (1) / 25 protsenti (3) vähemalt 10 minutit. proovikäikude vahel. Aminohapete piike jälgiti 254 nm ergastuse ja 630 nm emissiooni juures. Kalibreerimiskõver koostati kollageenhüdrolüsaadist valmistatud aminohappestandardi viiest lahjendusest (Sigma-Aldrich #A9531, St. Louis, Missouri). Kollageenis on hüdroksüproliini konstantne kontsentratsioon, seega muudeti hüdroksüproliini kontsentratsioon kollageeni kontsentratsiooniks (285 mol hüdroksüproliini ühe mol kollageeni kohta).

2.9 Fluorestseeruvate AGE-de mõõtmine

Fluorestseeruvad AGE-d igas proovis määrati fluoromeetrilise testiga, mis võrdleb luukoe endogeenset fluorestsentsi kiniini standardiga. HPLC sisestandardiga resuspendeeritud hüdrolüüsitud luu alikvoot lahjendati DI veega kontsentratsioonini 1,6 ug luu/ml lahuse kohta. Lahjendatud hüdrolüsaadi ja seeriaviisiliselt lahjendatud kiniini põhilahuse (põhilahus: 10 ug kiniini/ml 0,1 N H2SO4) fluorestsentsi mõõdeti 96-süvendiplaadil (toode nr 3370, Corning), kasutades mitme režiimiga mikroplaadilugeja (Synergy H1, BioTek) ergastusega 360 nm ja emissiooniga 460 nm.

Hulgifluorestseeruvad AGE-d normaliseeriti luukoe kollageenisisaldusega, kasutades hüdroksüproliini kolorimeetrilist analüüsi. Lühidalt öeldes lahjendati hüdrolüsaati täiendavalt hüdroksüproliini põhilahuseni (200 µg L-hüdroksüproliini/ml 0,001 N HCl). Reaktsiooni käivitamiseks lisati lahjendatud hüdrolüsaadile kloramiin-T ja lahuseid inkubeeriti 20 minutit. toatemperatuuril. Reaktsioon peatati 3,15 M perkloorhappe lisamisega ja pärast 5-min. inkubatsiooniperioodi toatemperatuuril lisati p-dimetüülaminobensaldehüüd. Seejärel inkubeeriti lahust 20 minutit 60-kraadises veevannis, seejärel jahutati külmas vees pimedas toatemperatuurini. Proovide ja standardite neeldumist mõõdeti mikroplaadilugeja abil lainepikkusel 570 nm. Fluorestseeruvad AGE-d on esitatud ühikutes kiniini fluorestsentsi / mg kollageeni kohta.

2.10 3D osteotsüütide lakunaarsed geomeetriad

Vasak sääreluu dehüdreeriti histoloogiliselt etanoolis ja värviti 1-protsendilise aluselise fuksiiniga (47). Seejärel puhastati sääreluud atsetooniga ja sisestati polü(metüül)metakrülaadisse (PMMA). Manustatud proovid lõigati väikese kiirusega saega (Buehler Isomet, Buehler, Lake Bluff, IL) ristlõikega 1 mm proksimaalselt sääreluu-fibula ristmikul. Distaalsest sektsioonist valmistati jahvatatud sektsioon sihtpaksusega 200 um (Exakt 400 CS, Exakt Technologies Inc, Oklahoma City, OK).

Maapealsete sektsioonide pildistamine teostati edastamisel Zeiss LSM 710 konfokaalse laserskaneeriva mikroskoobiga, 555 nm ergastusega, 568–1000 nm ribapääsfiltriga ja 40-kordse õlikümblusobjektiiviga. Lahutusvõime x, y ja z suunas oli vastavalt 0,447 ja 0,493 µm. Vertikaalsed z-virnad saadi osteotsüütide lünkade nähtava vahemiku kaudu (50–100 µm kujutise sügavus). Osteotsüütide lünkade 3D-kujutised konstrueeriti ja analüüsiti lakunaarsete geomeetriate osas, kasutades avatud lähtekoodiga 3D Osteocyte Lacunae Analysis programmi ja MATLAB v17 (21). ). Lühidalt, iga 2D-pilt z-virnas segmentiti automaatselt, et määratleda lünkad, mis seejärel rekonstrueeriti 3D-s. Parima sobivusega ellipsoidide põhjal analüüsiti lünki ruumala, pindala, lähima massikeskme, sfäärilisuse (väikseima ja suurima lakunaarse raadiuse suhe, kus 1=kera), ulatuse teeta (vahe absoluutväärtus). 3D-vektor, mis kirjeldab peatelje suunda kõigi lünkade keskmisest suunast, lamutust (−1=täiesti prolateeruv, 1=täiuslikult lammutatud) ja lakunaararvu tihedust (osteotsüütide arv/pildimaht).

2.11 Andmete analüüs

Andmed on esitatud kui keskmine ± keskmise standardviga. Iga Ramani spektroskoopia ja nanoindentatsiooni massiivi jaoks keskmistati nii, et igal luul oleks iga mikroskaala mõõtmiseks üks väärtus. Samamoodi arvutati iga massiivi jaoks standardhälve, et hinnata luukoe mikroskaala ruumilist varieeruvust. Vananemise ja kroonilise neeruhaiguse mõju, aga ka nende koostoimet testiti kõigi parameetrite puhul kahesuunalise ANOVA abil. Sõltuvad muutujad teisendati vajadusel, et rahuldada jääknormaalsuse ja homoskedastilisuse eeldusi. Põhiefektide olulisus määrati apriori väärtusele p < 0.05.="" vanuse="" ja="" kroonilise="" neeruhaiguse="" vahelise="" olulise="" koostoime="" korral="" viidi="" läbi="" post-hoc="" testimine,="" et="" testida="" kroonilise="" neeruhaiguse="" mõju="" igas="" vanuses.="" nende="" post-hoc="" analüüside="" puhul="" kontrolliti="" perekondlikku="" viga,="" kasutades="" bonferroni="" kohandatud="" alfat,="" mille="" tulemuseks="" oli="" kriitiline="" alfa="" 0.05="" 3="0.017." tulemusi,="" kus="" lihtsate="" mõjude="" võrdluste="" p-väärtused="" olid="" vahemikus="" 0,="" 017="" kuni="" 0,="" 05,="" tõlgendati="">

Lineaarne regressioon viidi läbi, et testida, kas nano-mikroskaala luu kvaliteedi mõõtmised ennustavad kogu luu mehaanilist tugevust. Kuna kogu luu mehaanilised omadused näitavad tugevat sõltuvust vanusest, hõlmas see lineaarne regressioon vanust kui ühismuutujat. Spearmani korrelatsioone hinnati ka osteotsüütide lakunaarse geomeetria ja seerumi ja uriini keemia mõõtmiste ning PTH ja mikroskaala luukvaliteedi mõõtmiste osas. Lineaarsete regressioonide ja korrelatsioonide olulisus määrati väärtusele p < 0,05.="" kõikide="" analüüside="" jaoks="" kasutati="" minitabi="">

Kõrvalekalded tuvastati Grubbsi testiga (olulisuse tase=0.05). Seerumi kaltsiumi ja uurea analüüsidest jäeti välja mitmed kõrvalekalded. Kõikide ajukoore ja trabekulaarsete mikroarhitektuuri analüüside, aga ka FEA analüüsi puhul jäeti kõrvale nii 24-kuu kui ka kroonilise neeruhaiguse kõrvalekalle. Üks kõrvalekalle jäeti 24-kuu CKD rühmast välja LP-analüüsi jaoks ja üks kõrvalekalle jäi 24-kuu võltsitud grupist välja sitkuse, töö kuni murdumiseni ja saagikuse järgse nihke osas. Nanoindentatsioonimooduli standardhälbe ja kristallilisuse standardhälbe jaoks leiti üks eraldiseisev 24-kuu võltsväärtus.