1. osa Cistanches Herba keemiline ja geneetiline diskrimineerimine UPLC-QTOF/MS ja DNA vöötkoodi alusel
Mar 03, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com
Abstraktne
Cistanches Herba(Rou Cong Rong), tuntud kui "kõrbe ženšen", omab silmatorkavat ravivat toimet jõule ja toitumisele, eriti neerude tugevdamisel yangi tugevdamiseks. Cistanches Herba, Cistanche deserticola ja Cistanche tubulosa, kaks taimset päritolu erinevad farmakoloogilise toime ja keemiliste komponentide poolest. Cistanches Herba taimse päritolu eristamiseks kasutati selles uuringus esmalt kombineeritud keemilist ja geneetilist meetodit – UPLC-QTOF/MS tehnoloogiat ja DNA vöötkoodi. Tulemused näitasid, et PCA ja OPLS-DA analüüside abil saadi kolm potentsiaalset markerühendit (kampneosiidi II, tsistanosiidi C ja tsistanosiidi A isomeer), et eristada kahte päritolu. DNA vöötkodeerimine võimaldas kahte päritolu täpselt eristada. NJ puu näitas, et kaks päritolu koondusid kaheks klaadiks. Meie leiud näitavad, et Cistanches Herba kahel päritolul on erinev keemiline koostis ja geneetilised variatsioonid. See on esimene teatatud hinnang Cistanches Herba kahe päritolu kohta ning leid hõlbustab kvaliteedikontrolli ja selle kliinilist rakendamist.
Sissejuhatus
Cistanches Herba(Rou Cong Rong), tuntud kui "kõrbe ženšen", pärineb kuivatatud mahlakatest vartest.Cistanche deserticolaYC Ma jaCistanche tubulosa(Schrenk) Parukas vastavalt Hiina farmakopöale (2010. aasta väljaanne) ja on populaarne oma neeru-yini toniseeriva, kasuliku elutegevuse ja soolestikku lõõgastava poolest. PraeguCistanches Herbaon levinud peamiselt kuivades ja soojades kõrbetes Loode-Hiinas, eriti Xinjiangi ja Sise-Mongoolia provintsides. Kuid kaks päritoluCistanches Herbaerinevad oma farmakoloogilise aktiivsuse ja keemiliste komponentide poolest. Tu et al. uuris kolme Cistanche liigi keetmist (C. deserticola, C. tubulosa, Cistanche salsa) ja leidis selleC. tubulosanäitas madalaimat efekti Yangi puudulikkusega hiiremudelis [1]. Zhang et al. vahel võrreldi farmakoloogilist aktiivsustC. deserticola, C. tubulosa,jaC. salsa,ja leidis, et neil liikidel on meditsiinilised funktsioonid, nagu väsimus- ja hüpoksiataluvus, kuid mitte samal määral [2]. Varasemad uuringud kirjeldasid keemilist komponenti ja näitasid keemilise komponendi ja taimse päritoluga sisalduse erinevustCistanches Herba[3]. Mis puudutab kliinilist kasutamist ja tururinglust, siis toonikuna,C. tubulosaJaapanis on traditsiooniliselt kasutatud vereringet soodustava vahendina ja impotentsuse, steriilsuse, lumbago ja keha nõrkuse ravis [4–8]. Järelikult on väga oluline eristada kahte päritoluCistanches Herbakvaliteedikontrolliks ja kliiniliseks kasutamiseks. Siiski ei keskenduta kahe päritoluga diskrimineerimiseleCistanches Herba. Perekonna tuvastamiseks on kasutatud paljusid uuritud meetodeid, sealhulgas mikroskoopiat, ultraviolett- ja infrapunatuvastust ning lihtsate järjestuste korduste meetodit.Cistanches, kuid mitte ainult kahe päritolu puhul, eriti [9–20]. Siin kasutasime ühiselt keemilisi ja molekulaarseid tehnikaid, et eristada Cistanches Herba kahte päritolu, UPLC QTOF/MS (üliefektiivne vedelikkromatograafia koos kvadrupoolse lennuaja massispektromeetriaga) ja DNA vöötkoodi. UPLC-QTOF/MS pakub teavet teiste tehnikatega võrreldes kiiremini ja tõhusamalt. UPLC-QTOF/MS kõrge selektiivsus ja tundlikkus on viinud selle rakendamiseni nii kvantitatiivsetes kui ka kvalitatiivsetes analüüsides, samuti metaboliitide analüüsis ja kompleksühendite tuvastamises traditsioonilises hiina meditsiinis [21–22]. Võimalike markerühendite tuvastamiseks töötatakse välja ka põhikomponentide analüüs (PCA) ja ortogonaalne projektsioon varjatud struktuuri diskrimineerivale analüüsile (OPLSDA). DNA vöötkodeerimine, lihtsam ja universaalsem molekulaarse markeri tehnoloogia, kasutab DNA fragmenti liikide või perekondade tuvastamiseks. See on objektiivne, täpsem ja lihtsamini teostatav kui traditsioonilised identifitseerimismeetodid ja muud molekulaarsete markerite tehnoloogiad. Lisaks on DNA vöötkoodi edukalt rakendatud loomade ja taimede, sealhulgas ravimtaimede tuvastamiseks [23–26]. Selle uurimistöö eesmärk on luua teaduslik meetodite süsteem kombineeritud UPLC-QTOF/MS ja DNA vöötkoodiga, et eristada kahte taimset päritolu.Cistanches Herba.
Tistaneerib terveid juuri
Materjalid ja meetodid
Eetikaavaldus Kinnitame, et väliuuringud ei hõlmanud ohustatud ega kaitsealuseid liike. GPS-koordinaadid on näidisinfos sisaldunud, vt tabelit 1."
Taimsed materjalid ja reaktiivid
Cistanches Herba mahlakad varred koguti Hiina Rahvavabariigi Xinjiangi Uiguuri autonoomse piirkonna Sise-Mongoolia Qinghai provintsi looduslikest kõrbepiirkondadest (tabel 1) 2012. aasta mais. Kõik uuringu proovid koguti metsikutest kõrbepiirkondadest, mitte eramaal, kus erilube polnud vaja. Dr Linfang Huang kinnitas varte botaanilise identiteedi. Voucheri näidised anti hoiule ravimtaimede arendamise instituuti. UPLC analüüsiks kasutati kõrgsurvevedelikkromatograafia (HPLC) puhtusastmega atsetonitriili (Merck KGaA, Darmstadt, Saksamaa) ja sipelghapet (Tedia, USA). Deioniseeritud vesi puhastati Milli-Q süsteemiga (Millipore, Bedford, MA, USA). Kõik muud kemikaalid olid analüütilise kvaliteediga.
Proovi ettevalmistamine
Cistanches Herba proovid (1.0 g, 65-võrk) kanti 50- ml koonilisse kolbi ja lisati 50 ml 70% metanooli. Pärast 30-minutilist leotamist viidi ultraheliga (35 kHz) läbi toatemperatuuril 30 minutit. Pärast tsentrifuugimist kiirusel 10, 000 pööret/min 10 minutit, säilitati supernatanti temperatuuril 4 °C ja filtreeriti läbi 022- mm membraani, enne kui süstiti analüüsimiseks UPLC-QTOF/MS süsteemi.
UPLC-QTOF/MS
UPLC analüüsi jaoks kasutati järgmisi süsteeme/parameetreid: Waters Acquity süsteem (Waters), mis on varustatud binaarse lahusti kohaletoimetamise pumba, automaatse proovivõtturi ja Waters Empower 2 andmejaamaga ühendatud PDA detektoriga; ultrahelitöötlus (250 W, 50 kHz, Kunshan Ultrasonic Instrument Co., Zhejiang, Hiina); ja elektrooniline analüütiline tasakaalumudel AB135-2 (Mettler Toledo., Greifensee, Zürich, Šveits). Kasutati Waters Acquity UPLC BEH C18 kolonni (1,7 mm, 2,16100 mm, Waters) ja Waters C18 kaitsekolonni (sama materjal, veed), mida hoiti 30 uC juures. Liikuvaks faasiks oli 0,1-protsendiline sipelghappe vesilahus (A) ja atsetonitriil (B) gradiendiprogrammiga järgmiselt: 0–3 min, 10–22 protsenti B; 3–4 min, 22–23 protsenti B; 4–6 min, 23–35 protsenti B; 6–8 min, 35–37 protsenti B; 8–11 min, 37–42 protsenti B; 11–12 min, 42–48 protsenti B; 12–15 min, 48–50 protsenti B voolukiirusel 0,3 ml/min. Süstimismaht oli 5 ml.
UPLC/MS analüüs viidi läbi QTOF Synapt G2 HDMS süsteemiga (Waters, Manchester, UK), mis oli varustatud negatiivse iooni režiimis töötava elektropihustusionisatsiooni (ESI) allikaga. Desolvatatsioonigaasina kasutati N2. Desolvatatsioonitemperatuuriks määrati 45{{10}}uC voolukiirusel 800 l/h ja lähtetemperatuuriks 120 uC. Kapillaari ja koonuse pinge määrati vastavalt 2500 ja 40 V. Andmeid koguti vahemikus 50–1200 Da 0.{11}}s skaneerimisajaga ja 0.{13}} s skaneerimise vahelise viivitusega 15-minutilise analüüsiaja jooksul. Kokkupõrkegaasina kasutati argooni rõhul 7,06661023 Pa. Massi täpsuse ja reprodutseeritavuse tagamiseks koguti kõik MS andmed LockSpray süsteemi abil. Leutsiin-enkefaliini [MH]-iooni m/z 554,2615 juures kasutati lukumassina negatiivses ESI režiimis.
Andmete analüüs
Võimalike diskrimineerivate muutujate tuvastamiseks analüüsiti Cistanches Herba proovide UPLC-QTOF/MS andmeid. ES-i toorandmete piikide leidmine, joondamine ja filtreerimine viidi läbi Marker Lynxi rakenduste halduri versiooni 4.1 abil (Waters, Man chester, UK). Kasutati järgmisi parameetreid: retentsiooniaeg (tR) 0–15 min, mass 50–1200 Da, retentsiooniaja tolerants 0,02 min ja massi tolerants 0,02 Da. Kasutati kolme igast geograafilisest asukohast kogutud kordusproovi (n=3). Mudeli loomisel kasutati kokku 6 339 muutujat.
DNA vöötkodeerimine: DNA ekstraheerimine, PCR amplifikatsioon ja sekveneerimine
C. deserticola ja C. tubulosa (30 mg) kuivatatud lihavatest vartest võetud proove hõõruti 2 minutit sagedusega 30 r/s. DNA ekstraheeriti vastavalt tootja juhistele (Tangen). Täpsemalt, protokolli muudeti nii, et kloroform asendati kloroformi: isoamüülalkoholi (24:1 samas mahus) ja puhverlahuse GP2 seguga isopropanooliga (sama maht). Hõõrutud pulber pandi 1,5 ml eppendorfi tuubidesse, lisati 700 ml 65 °C eelsoojendatud GP1 ja 1 ml b-merkaptoetanooli, et segada vorteksiga 10–20 sekundit ja inkubeerida 60 minutit temperatuuril 65 °C; Lisades 700 ml kloroformi:isoamüülalkoholi segu (24:1), tsentrifuugige 5 minutit kiirusel 12000 p/min (134006 g); Pipeteerige supernatant uude katsutisse, lisades 700 ml isopropanooli, segades 15–20 minutit; Kogu segu torujuhtmega tsentrifuugimiskolonni CB3 ja tsentrifuugimine 40 s kiirusel 12000 p/min; Filtraat visatakse ära ja lisatakse 500 ml GD (enne kasutamist kvantitatiivse veevaba etanooli lisamine), tsentrifuugitakse 40 sekundit kiirusel 12000 p/min; filtraadi äraviskamine ja 700 ml PW lisamine (enne kasutamist kvantitatiivse veevaba etanooli lisamine), et membraani pesta, tsentrifuugitakse 40 sekundit kiirusel 12000 p/min; Filtraat visatakse ära ja lisatakse 500 ml PW, tsentrifuugitakse 40 s kiirusel 12000 p/min; Filtraat visatakse ära ja tsentrifuugitakse 2 minutit kiirusel 12000 p/min, et eemaldada pesupuhvri jääk PW; Tsentreerimiskolonni CB3 viimine puhtasse 1,5 ml Eppendorfi katsutisse ja kuivatamine toatemperatuuril 3–5 minutit; Tsentrifuugige 2 minutit kiirusel 12000 p / min, et saada kogu DNA. Polümeraasi ahelreaktsiooni (PCR) praimerid põhinesid varem teatatud järjestustel [4, 5]. PCR reaktsioonisegud sisaldasid 2-mL DNA matriitsi, 8.{51}} ml ddH2O, 12.5-mL 26Taq PCR Master Mix (Beijing TransGen Biotech Co., Hiina), 1/{{57 }}mL edasi/tagasi (F/R) praimereid (2,5 mM), lõppmahus 25 mL. PCR amplifikatsioon viidi läbi nii, nagu on kirjeldanud Kress et al. [4]. PCR reaktsiooni praimerid olid fwd PA: GTTATGCATGAACGTAATGCTC (59- 39) ja rev TH: CGCGCATGGTGGATTCACAATCC (59-39). PCR-produktid eraldati ja tuvastati 1-protsendilise agaroosgeelelektroforeesiga. PCR tooted puhastati tootja protokolli järgi ja allutati otse sekveneerimisele.
Tistanche peamine efektiivne ühend: akteosiid
Tulemused
Esialgne piikide määramine UPLC-QTOF/MS abil. C. deserticola ja C. tubulosa tüüpilised kromatogrammid erinevatest tootmispiirkondadest on näidatud joonisel 1. Sõrmejälgede kromatogramm näitas Cistanches Herba proovide sarnasusi. Kokku tuvastati 23 kvalifitseeritud massipiiki ja 16 piiki tuvastati, sobitades peetumisajad ja massispektrid eelnevalt teatatud omadega (tabel 2) [29–35]. Piigid 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 15, 16, 17, 20, 21, 22 ja 23 tuvastati esialgselt kui tsistanosiid F, mussaenosiidhape, tsistanbulosiid C1/C2, kampneosiid II , kampneosiid II isomeer, ehhinakosiid, tsistanosiid A, akteosiid, isoakteosiid, syringaliid A-39-aL-ramnopüranosiid, tsistanosiid C, 29-atsetüüllakteosiid, osmantusiid B, tsistanosiid D, tubulosiid B, tsistaansiid B . Keemilisteks koostisosadeks määrati peamiselt fenüületanoidglükosiidid (PhG), samas kui üks ühend, mussaenosiidhape, oli iridoidne polüsahhariid. PhG-d on peamised aktiivsed ühendid neerupuudulikkuse ravis ning antioksüdantsed ja neuroprotektiivsed toimed [36]
C. deserticola ja C. tubulosa PCA
PCA-d kasutati erinevate taimeliikide proovide eristamiseks. PCA on järelevalveta mitme muutujaga andmeanalüüsi meetod, mille eesmärk on visualiseerida sekundaarse metaboliidi koostise mitme muutujaga andmete sarnasusi ja/või erinevusi [37]. Kahekomponendiline PCA mudel moodustas kumulatiivselt 46,04 protsenti variatsioonist (PC1, 36,43 protsenti; PC2, 9,61 protsenti). Joonisel 2 on näidatud, et 24 proovi rühmitati kahte rühma PCA skoorides, mis olid koostatud vastavalt liigi päritolule, mis näitab, et C. deserticola ja C. tubulosa keemiline koostis erines oluliselt.
Tistanche peamine efektiivne ühend: ehhinakosiid
