Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Imane Bensaata, Blaise Robin3, Joeille Perez, Yann Salemkour, Anna Chipont, Marine Camus, Mathilde Lemoine, Lea Guyonnet, Helene Lazareth, Emmanuel Letavernier, Carole Henique, Pierre-Louis Tharaux ja Olivia Lenoir

'Université de Paris, PARCC, Inserm, Pariis, Prantsusmaa; ja Université Paris Descartes, Sorbonne Paris Cite, Pariis, Prantsusmaa

Proteinuuria tugev ennustav väärtus krooniliste glomerulopaatiate korral on kindlalt tõestatud, samuti angiotensiin ll patogeenne roll glomerulaarhaiguse progresseerumise soodustamisel muutunud glomerulaarfiltratsiooni barjääri, podotsüütide vigastuse ja glomerulite armistumise korral. Siin leidsime, et krooniline angiotensiin Il-indutseeritud hüpertensioon pärssis autofagia voogu hiire glomerulites. Atg5 (autofagiaga seotud valku kodeeriv geen) deletsioon podotsüütides põhjustas angiotensiin I poolt indutseeritud podotsütopaatia kiirenemise, suurenenud albuminuuria ja glomeruloskleroosi. See näitab, et autofagia on selles seisundis podotsüütide peamine kaitsemehhanism. Angiotensiin-Il-indutseeritud kalpaiini aktiivsus podotsüütides pärsib autofagia voogu. Endogeense kalpaiini inhibiitori kalpastatiini transgeense ekspressiooniga hiirte podotsüütidel ilmnes algtasemel kõrgem podotsüütide autofagia, mis oli resistentne angiotensiin Il-sõltuva inhibeerimise suhtes. Samuti piiras kalpastatiiniga püsiv autofagia podotsüütide kahjustusi ja albuminuuriat. Need leiud viitavad sellele, et hüpertensioonil on patogeensed mõjud glomerulaarstruktuurile ja -funktsioonile, osaliselt kalpaiinide aktiveerimise kaudu, mis põhjustab podotsüütide autofagia blokeerimist. Need leiud paljastavad algse mehhanismi, mille kohaselt angiotensiin Il-vahendatud hüpertensioon inhibeerib autofagiat kaltsiumi poolt indutseeritud kalpaiini värbamise kaudu, millel on patogeensed tagajärjed kalpastatiini aktiivsuse tasakaalustamatuse korral. Seega võib kalpaiini poolt vahendatud autofagia vähenemise vältimine olla paljutõotav uus ravistrateegia nefropaatiate jaoks, mis on seotud kõrge reniin-angiotensiini süsteemi aktiivsusega.

Cistanchedeserticola takistabneerudhaigus

Tõlkeavaldus

Arvestades autofagia olulist rolli arengusneerudhaigused, võib autofagia farmakoloogiline moduleerimine olla paljutõotav strateegia mitmete neeruhaiguste ennetamiseks ja raviks. Paralleelselt leiti, et kalpaiini aktiivsuse üleaktiveerimine podotsüütides avaldab podotsüütide funktsioonile kahjulikku mõju, samas kui selle kahjulikke toimemehhanisme ei tuvastatud. Siin pakume tõendeid selle kohta, et kalpaiin seob angiotensiin Il kahjuliku toime autofagia kahjuliku blokaadiga podotsüütides ja viitab sellele, et kalpaiini inhibeerimine võib olla paljulubav terapeutiline sihtmärk podotsüütide haiguste korral osaliselt podotsüütide autofagia säilitamise kaudu.

Hüpertensioon on progresseerumise peamise põhjusena diabeedi järel teisel kohalkroonilineneerudhaigus-ja isegi mõõdukas vererõhu tõus on lõppstaadiumis neeruhaiguse sõltumatu riskitegur. Üha rohkem eksperimentaalseid uuringuid on rõhutanud podotsüütide tähtsust nende arengusneerudvigastus. Podotsüütide progresseeruv kadu ja mikrovaskulaarsed muutused ilmnevad varakult koos neerude funktsionaalse langusega eksperimentaalse hüpertensiivse nefropaatia korral. Patsientidel näidati, et elujõuliste podotsüütide eritumine uriiniga on preeklampsia tundlik ja spetsiifiline marker ning nefroskleroosiga patsientidel oli glomerulaarsete podotsüütide tihedus oluliselt väiksem kui neerudoonoritel. Lisaks on angiotensiin II (Angel) patogeenne roll glomerulaarhaiguse progresseerumist soodustades hästi kindlaks tehtud, mitte ainult hüpertensiivsete seisundite, vaid ka mitmete glomerulaarhaiguste korral.

Glomerulaarhüpertensioon põhjustab glomerulaarsete kapillaaride venitamist, endoteeli kahjustusi ja glomerulaarvalgu filtratsiooni suurenemist, mis põhjustab glomerulaarse kollapsi ja glomeruloskleroosi. Samuti avaldab see otsest toimet glomerulaarstruktuuridele, põhjustades kompenseerimiseks regulatiivseid signaalivastuseid. Aktiveeritud süsteemne ja lokaalne reniin-angiotensiin-aldosterooni süsteem (RAAS) soodustab mesangiaalset hüperplaasiat ja veresoonte läbilaskvusfaktorite sünteesi. Samal ajal näitavad podotsüüdid kaltsiumi signaali ja muudavad oma kuju AnglI 1. tüüpi retseptoril (AT1)-28Need stimulatsioonist sõltuvad adaptiivsed mehhanismid.{5}} muutuvad pikas perspektiivis kohanemisvõimetuks, põhjustades lõpuks glomeruloskleroosi. AT1 vahendab RAAS-i silmapaistvat osalust vererõhu ning soola ja vee homöostaasis. Angiotensiini konverteeriva ensüümi inhibiitoreid ja AT1 blokaatoreid kasutatakse kliiniliselt hüpertensiooni ja südamepuudulikkuse raviks patsientidel. Huvitaval kombel on mõlemal blokaatoril ka kaitsev toimeneerudfunktsiooni.

Näidati, et autofagia on rakulise homöostaasi säilitamiseks hädavajalik, eriti postmitootilistes ja eriti podotsüütides.{0}} Autofagia on pikaealiste tsütoplasmaatiliste valkude ja düsfunktsionaalsete organellide cl9olüsosoomiga seotud lagunemissüsteem55 ning see hõlmab valkude ja organellide sekvestreerimist. autofagosoomides. Autofagosoomide moodustumine sõltub mitme geeni, sealhulgas Mapllc3a/b, Berlin 1 ja Atgs indutseerimisest. Üha enam on tõendeid selle kohta, et autofaagilise raja düsregulatsioon on seotud patogeneesiga.neerudvananemine ja mitmedneerudhaigused, nagu äge neerukahjustus, polütsüstiline neeruhaigus, vananemine ja diabeetiline nefropaatia.

Autofagia reguleerimine podotsüütides, füsioloogiline ja ennekõike patoloogilises kontekstis, ei ole hästi teada. Hiljuti näitasime, et podotsüütide autofagia ei sõltu rapamütsiini (mTOR) regulatsiooni mehaanilisest sihtmärgist füsioloogilistes tingimustes, muutes selle rakutüübi erandiks. AT1 aktiveerimine stimuleerib rakkudes valgusünteesi ja valkude käivet. Seega põhjendasime, et RAAS-i aktiveerimine võib mõjutada ka valkude ringluse stimuleerimist ja proteostaasi.

Käesolevas uuringus keskendusime AnglI signaalimise rollile podotsüütide autofagia regulatsioonis. Tuvastasime kaltsiumiga aktiveeritud proteaaside kalpaiinid, mis vahendavad AnglI kroonilist blokeerivat toimet podotsüütide autofagiale. Lisaks leidsime, et endogeenne kalpaiini inhibiitor kalpastatiin suutis hüpertensiooni ajal ära hoida AngI-sõltuvat autofagia inhibeerimist ja podotsüütide vigastusi.

Need leiud paljastavad originaalse mehhanismi, mille abil AnglI-vahendatud hüpertensioon inhibeerib autofagiat kaltsiumi poolt indutseeritud kalpaiini värbamise kaudu, millel on patogeensed tagajärjed kalpastatiini aktiivsuse tasakaalustamatuse korral.

MEETODID

Loomad

Kalpastatiini transgeensed (CST18) hiired pakkus lahkelt dr E. Letavernier. Atg5 podotsüütidespetsiifilise häirega hiired genereeriti vastavalt eelnevalt kirjeldatud geenile (Nphs2.cre Atg5'o), ristades Nphs2.cre hiired Ag5lxlomice5-ga C57BL6/J taustal. Nphs2.cre Atg5'oxlox hiired ja kontroll-pesakonnakaaslased isased , vanuses 10 kuni 12 nädalat. Hüpertensiivne mudel kutsuti esile AnglI (Sigma-Aldrich, A9525) subkutaanse infusiooniga annuses 1 ug/kg/min 4 kuni 6 nädala jooksul. osmootsed minipumbad (Alzet Corp, mudel 2006). Pumbad implanteeriti seljale abaluude ja puusade vahele. Hiired said toidus soolalisandit (3 protsenti NaCl). Kontrollina kasutati Atgsloxilox (metsikut tüüpi [WT]) hiiri Kõik uuringud. Deoksükortikosteroonatsetaadi (DOCA) soola puhul nefroni redutseerimise mudeliga tehti täiskasvanud isastele hiirtele ühepoolne vasakpoolne nefrektoomia. Kaks nädalat pärast nefrektoomiat said nad DOCA graanulid 21-päevase vabanemisega (Innovative Research of America) implantaadiga sc. Teine pellet implanteeriti 3 nädalat pärast esimest implantaati said joogivees ad libitum 0,9 protsenti NaCl ja nad hukkusid pärast 6-nädalast DOC manustamist.6 Katsed viidi läbi vastavalt Prantsusmaa veterinaarjuhistele ja Euroopa Ühenduse poolt katseloomadel kasutamiseks koostatud juhistele (L358-86/609EEC). ning need kiitsid heaks Prantsusmaa teadusministeerium ja kohaliku ülikooli teaduseetika komitee (APAFIS-7646 ja -22373).

Primaarse podotsüütide kultuuri katse

Diferentseeritud primaarseid podotsüüte kultiveeriti eelnevalt kirjeldatud viisil./Lühidalt, värskelt eraldatud neerukoor segati ja seediti kollagenaas I-ga (Gibco, {{0}}) Roswell Parki memoriaalinstituudis 1640 (Life Technologies,{{2). }}). Seejärel juhiti koed läbi 70 μm ja 40 μm rakufiltrite (BD Falcon, 352340 ja 352350). 40 um rakusõela külge kleepuvad glomerulid eemaldati fosfaatpuhverdatud soolalahusega (PBS; Life Technologies, 10010023), millele oli lisatud rõhu all 0,5 protsenti veise seerumi albumiini (Eurobio, HALALB07-65) ja seejärel pesti kaks korda. PBS-is. Värskelt isoleeritud glomerulid kanti 6-kaevunõudesse Roswell Parki memoriaalinstituudis 1640 (Gibco, 61870036), millele lisati 10 protsenti vasikaloote seerumit ja 1 protsenti penitsilliini/streptomütsiini (Life Technologies, 15140122), et võimaldada glomerulite väljutamist podoküütidest. ja kasvada. Podotsüüdi rikastamist kontrolliti Western blot analüüsiga nagu varem (täiendav joonis S1). Podotsüüte kultiveeriti bafilomütsiin Al (100 nmol/, Sigma-Aldrich, B1793) puudumisel või juuresolekul 4 tundi. Immunofluorestsentskatsete jaoks plaaditi primaarsed podotsüüdid 4 tassi etiketile (Dutcher, 055071). Seejärel fikseeriti podotsüüdid 10 minutiks 4% paraformaldehüüdis ja töödeldi immunofluorestsentsi jaoks.

Kalpaiini aktiivsuse test

Intratsellulaarne kalpaiini aktiivsus määrati primaarsetes podotsüütides, nagu eelnevalt kirjeldatud. Roswell Park Memorial Institute 1640-s kasvatati kokku 100,000 rakku 24-kaevu koekultuuri tassides, millele oli lisatud 10 protsenti vasikaloote seerumit ja 1 protsenti penitsilliini/streptomütsiini. Pärast näidatud kultiveerimisperioodi asendati sööde Krebs-Ringeri HEPES-vesinikkarbonaadi (KRH) lahusega (pH 7,4), mis sisaldas 4 mM CaCl2 koos 10 uM kalpaiini inhibiitoriga või ilma, ja inkubeeriti 10 minutit enne lisamist. 50 mM kalpaiini substraadi N-suktsinüül-Leu-Leu-Val-Tyr-7-amino-4-metükumariini (Sigma-Aldrich, S6510). Pärast 90-minutilist inkubatsiooniperioodi määrati cal-valu aktiivsus fluorestsentsi erinevusena (mõõdetuna 360 nm ergastuse ja 430 nm emissiooni juures) koos ja ilma kalpaiini inhibiitorita-1.

Western blot

Primaarsed podotsüüdid kriimustati 80 ul radioimmunosadestamise analüüsi puhvriga, mis sisaldas fosfataasi ja proteaasi inhibiitorit. Valgu kontsentratsiooni mõõdeti BCA Protein Assay Kitiga (Merck Biochemistry, 71285). 20 mikrogrammi valke elektroforeesiti Criterion XT monteeritava geeliga (12 protsenti Bis-Tris, Bio-Rad, 3450124). Valgud kanti üle polüvinülideendifluoriidmembraanile (Thermo Fischer Scientific, 88518). Pärast blokeerimist 5% piimas Tris puhvri soolalahuses 0,1% Tween (TBS-T) inkubeeriti membraane küüliku polüklonaalse anti-LC3 (1:1 000, Cell Signaling Technology, 2575), küüliku polüklonaalse anti-ATG5-ga. (1:2000, Cell Signaling Technology, 2630), merisea polüklonaalne anti-sekvestosoom 1 (SQSTM1)/P62 (1:10 000, PROGEN, GP62), küüliku polüklonaalne anti-kalpaiini 1 domeen IV (1:1000, Abcam,ab39170 ), küüliku polüklonaalne anti-kalpaiin 2 aminoterminaalne ots domeeni I (1:1000, Abcam, ab39165), hiire monoklonaalne IgG1 anti-kalpaiin 4 (1:1000, Santa Cruz Biotechnology, sc-32325), jänes anti-podotsiin (1:1000, Abcam, ab50339), merisea anti-nefriini (1:500, PROGEN, GP-N2) ja roti monoklonaalne anti-tubuliini (1:5000, Abcam, ab6160) antikeha. Pärast pesemist inkubeeriti membraane mädarõika peroksidaasiga seotud antikehaga (1:2000, Cell Signaling Technology, 7074, 7076, 7077). Spetsiifiliste signaalide tuvastamine viidi läbi ECL kemiluminestsentskomplekti (Bio-Rad, 170-5070) abil seadmel LAS 4000 (Fuji). Kvantifitseerimiseks kasutati densitomeetria analüüsi ImageJ tarkvaraga (National Institutes of Health).

Vererõhu mõõtmine ja füsioloogilised hinnangud

Hiirte süstoolne vererõhk registreeriti sabamanseti meetodil (Visitech Systems Inc., BP-2000). Igalt hiirelt tehti kümme mõõtmist ja seejärel määrati keskmine väärtus. Süstoolset vererõhku mõõdeti algtasemel (12 nädala vanuselt) ja seejärel kord nädalas kuni raviperioodi lõpuni. Kõik hiired paigutati 6-tunniseks uriini kogumiseks metaboolsetesse puuridesse, kus oli vaba juurdepääs veele. Uriini kreatiniini ja plasma uurea kontsentratsiooni analüüsiti spektrofotomeetriliselt, kasutades kolorimeetrilist meetodit (Olympus, AU400). Albumiini eritumist uriiniga mõõdeti spetsiaalse ensüümiga seotud immunosorbentanalüüsi abil albumiini kvantitatiivseks määramiseks hiire uriinis (Crystal Chem, 80630).

Histoloogia

Neerud koguti ja fikseeriti 4% PBS-puhverdatud formaliinis. Neerude morfoloogia hindamiseks värviti parafiiniga kaetud lõigud (3-um paksused) Massoni trikroomiga. Neerude kõrvalekaldeid hinnati komponentide kõrvalekallete, sealhulgas glomeruloskleroosi, mesangiaalse laienemise, tubulaarse atroofia või kipsude ja fibroosi olemasolu ja raskuse alusel. Sklerootiliste glomerulite osakaalu hinnati pimeuuringuga, mis hõlmas vähemalt 50 glomeruli neeruosa kohta.

Neeruosade ja primaarsete podotsüütide immunofluorestsentsvärvimine

Fikseeritud primaarsed podotsüüdid blokeeriti TBS-T 3% veise seerumi albumiiniga ja inkubeeriti üleöö 4 kraadi juures primaarsete antikehadega merisea anti-SQSTM1/P62 (1:1000, PROGEN, GP-62C) ja küüliku anti-roheline. fluorestseeruv valk (GFP; 1:500, Abcam, ab290). Pärast TBS-T loputamist fluorofooriga konjugeeritud sekundaarsed antikehad, eesli meriseavastane IgG AF594-konjugeeritud antikeha (Jackson ImmunoResearch,706-585-148) ja eesli küülikuvastane IgG AF488-konjugeeritud antikeha Invitrogen, A21206) kasutati. Pildid tehti Zeiss 2 fluorestsentsmikroskoobi, AxioCam HRc kaamera ja Axiovision 4.3 tarkvara abil.

Formaliiniga fikseeritud parafiiniga (FFPE) neerude puhul deparafineeriti sektsioonid (3 um) ja hüdreeriti ning antigeeni otsimine viidi läbi kuumutatud tsitraatpuhvris (pH 6). Seejärel lõigud permeabiliseeriti Tritoniga 0,1 protsenti (Euromedex) ja blokeeriti TBS-T3 protsendi veise seerumi albumiiniga enne üleöist antikehade inkubeerimist 4 kraadi juures. Kasutasime kitse anti-nefriini (1:100, PROGEN, GP-N2), merisea anti-SQSTM1/P62 (1:1000, PROGEN, GP-62C), küüliku anti-GFP-d (1:1000, Abcam, ab290), kitse podokalüksiini (PODXL; 1:1000, Bio-Techne, AF-1556) ja küüliku Wilmi kasvaja 1 vastane (WT1; 1:100, Abcam, ab192) antikeha. Sekundaarsed antikehad olid Alexa 488- ja Alexa 568-konjugeeritud Invitrogeni antikehad. Tuumad värviti Hoechsti abil siniseks. Slaidid paigaldati fluorestseeruva paigaldusvahendiga (Dako, S3023). Mikrofotod tehti Zeiss Axiophot fotomikroskoobi ja Axiovision tarkvaraga. Fidži poolautomaatset kvantifitseerimist kasutati nefriini-positiivsete ja PODXL pluss pindalade kvantifitseerimiseks glomerulaarsektsiooni kohta vähemalt 30 glomeruli hiire kohta. Podotsüütide arv loeti WT1 pluss tuumade arvuna glomerulaarsektsiooni kohta vähemalt 30 glomerulil hiire kohta.

Transmissioonelektronmikroskoopia protseduur

Väikesed tükid neerukoorest (1 mm) fikseeriti 3-protsendilises glutaaraldehüüdi EM-klassis (Electron Microscopy Sciences) 1 kuni 3 0 päevaks ja pesti kolm korda PBS-is. Proovid järelfikseeriti 1% osmium-te-troksiidis 0,1 M (elektronmikroskoopia teadus) 0,1 M PBS-s (pH 7,4) ja pesti veega. Proovid dehüdreeriti alkoholi ja 100-protsendilise propüleenoksiidiga (Electron Microscopy Science). Vaigu infiltratsioon viidi läbi järgmiselt: segage Epikote 812 ja propüleenoksiidi vahekorras 1:1 30 minutit, seejärel segage Epikote 812 ja propüleenoksiidi vahekorras 1:2 üleöö toatemperatuuril. Proovid asetati 4 mm želatiinkapslitesse 100-protsendilises Epikote 812-s ja polümeriseeriti ahjus, mida kuumutati temperatuurini 60 °C. Üliõhukesed lõigud lõigati UFC7 ultramikrotoomiga (Leica Microsystems GmbH) ja kanti Gilder Grids 200 võrgule (Electron Microscopy Science). Neid värviti 7-protsendilise uranüülatsetaadiga (LFG jaotus) ja Reynoldi pliitsitraadiga (LFG). Proove uuriti JEM1011 ülekandeelektronmikroskoobis (JEOL) Orius SC1000 CCD-kaameraga (Gatan), mida kasutati hankimiseks tarkvaraga Digi-talMicrograph (Gatan).

Kvantitatiivne polümeraasi ahelreaktsiooni massiiv

Värskelt eraldatud glomerulid külmutati QIAzol Lysis reagendis (Qiagen) -80 kraadi juures. RNA täielikku ekstraheerimist fenoolipõhisel meetodil töödeldi vastavalt tootja soovitustele. cDNA-de sünteesimiseks kasutati komplekti RT²First Strand Kit (Qiagen, 330401) ja reaalajas polümeraasi ahelreaktsioon (PCR) viidi läbi kohandatud RT²Profiler PCR Array abil ( Qiagen, CLAM36771C) koos RT'SYBR Green qPCR Mastermixiga (Qiagen, 330502). Kvantitatiivseid PCR-plaate töödeldi Applied Bio-systems StepOnePlus tsükleriga. Iga massiiv sisaldab pöördtranskriptsiooni efektiivsuse ja genoomse DNA saastumise kvaliteedikontrolli. Kvantitatiivne PCR analüüs viidi läbi kasutades 2-△△ CT meetodit GeneGlobe'i andmeanalüüsi keskuse abiga (www. Qiagen. com/shop/genes-and-pathways/data-analysis-center-overview-page) ja seda väljendatakse geeniekspressiooni Log2-kordse muutusena.

In silico proteoomiline analüüs

Kalpaiini lõhustumiskoha in silico ennustamine tehti DeepCalpaini (http://deepcalpain.cancerbio.info/help.php), GPS-CCD (http://ccd.biocuckoo.org) ja CaMPDB (http://) abil. calpain.org/)veebitööriistad. Hiire valgu aminohappejärjestus saadi Uniprotist (//www.uniprot.org). Tulemusi jätkatakse täiendavates tabelites S1 ja S2.

Statistilised analüüsid

Kõik graafikud kujutavad individuaalseid väärtusi ja keskmisi ± SEM. Statistilised analüüsid viidi läbi tarkvara GraphPad Prism, versioon 9, abil. Kahe rühma võrdlus viidi läbi parameetrilise Studenti t-testi abil, kui proovid läbisid Anderson-Darlingi ja D'Agostino normaalsustestid ning dispersioonivõrdsuse F testi. Muidu kasutati mitteparameetrilist Mann-Whitney testi. Mitme rühma vaheline võrdlus viidi läbi, kasutades 1-viisi või 2-viisi dispersioonanalüüsi, millele järgnes mitmekordne võrdlustest Sidaki korrektsiooniga. P väärtused<0.05 were="" considered="" significant.=""><><><>

Joonis 1| Angiotensiin I (Angel) pluss kõrge soolasisaldusega dieedi (HSD) põhjustatud hüpertensioon pärsib glomerulaarset autofagiat. (ac)

Podokalüksiini (PODXL; punane) ja P62 (roheline) immunofluorestsents metsiktüüpi (WT) hiirte glomerulites (a, a'), WT hiirtel (b, B) pärast 6-nädalast Angel pluss HSD-d ja (c) Nphs2.cre Atgsl/ox hiirtelt, mis näitasid P62 akumuleerumist podotsüütides hüpertensiooni ajal ja podotsüütidespetsiifilistes ATG5-puudulikes hiirtes. Nooleotsad tähistavad P62 pluss punktid WT-s punktis (a'). Tuumad värviti Hoechstiga (sinine). Joonise alaosad, millel on prime, näitavad suuremat suurendust. Baarid =50 μm. （d) P62 plusi seotud kvantifitseerimine on väljendatud glomerulaarpiirkonna protsendina.n =4 WT hiired ja n=5 WT koos Angel pluss HSD ja Nphs2.cre Atgsoxlo hiirega. Väärtused on esitatud üksikute graafikutena ja keskmised ± SEM. Mann-Whitney test:*P= 0.0159.

Angel pluss kõrge soolasisaldusega dieedist põhjustatud hüpertensioon pärssis podotsüütide autofagiat

Podotsüütidel on in vivo kõrge autofagia tase, nagu näitab tugev GFP ekspressioon transgeensetel hiirtel, kellel on GFP sulandumine LC3-ga (GFP-LC3 hiired), mis on autofagia võtmemarker (täiendav joonis S2A). Autofagia on dünaamiline protsess, millega kaasneb pidev autofagosoomide moodustumine ja autofagolüsosoomide lagunemine. Autofagosomaalse lagunemise blokeerimine klorokviiniga põhjustas GFP pluss punktide kuhjumise, mis näitab suurt autofagilist voogu podotsüütides (täiendavad joonised S2A ja B). Kinnitust, et GFP pluss punktid olid autofagosoomid, näitas topeltimmunofluorestsents GFP ja SQSTM1 / P62, autofagia poolt lagunenud chaperone valgu jaoks (täiendav joonis S2C ja D). Jällegi indutseeris klorokviinravi GFP pluss P62 pluss punktide akumuleerumist, näidates olulist autofagilist voogu podotsüütides. Lõpuks säilis kõrge autofagiline voog in vitro, nagu näitas GFP ja P62 ekspressioon GFP-LC3 hiirtest eraldatud primaarsetes podotsüütides ning GFP pluss ja P62 pluss punktide tugev akumuleerumine bafilomütsiin Al-ravi ajal, mis on veel üks autofagosomaalse lagunemise blokeerija (täiendav joonis S2E- H).

Seejärel hinnati hüpertensiooni võimet moduleerida podotsüütide autofagilisi vastuseid hiirtel, kellele infundeeriti AngII-d kõrge soolasisaldusega dieediga (HSD) 6 nädala jooksul ja mittehüpertensiivsetel kontrollidel. Nagu on näidatud joonisel l, indutseeris AnglI pluss HSD P62 akumuleerumist glomerulites koos tugeva akumuleerumisega podotsüütides, mis viitab sellele, et Angl pluss HSD vastutas podotsüütide autofagia blokaadi eest (joonis maa). Huvitaval kombel oli P62 akumuleerumine podotsüütides sarnane sellele, mida täheldati hiirtel, kellel puudus podotsüütide autofagia (Nphs2.cre Atg5'olox hiired). Teises hüpertensiooni mudelis, DOCA-soola mudelis, täheldasime ka progresseeruvat P62 akumuleerumist podotsüütides piki haiguse ajaline kulg (täiendav joonis S3).

Atg5 kustutamine spetsiifiliselt podotsüütides põhjustab Angel pluss HSD mudelis suurenenud albuminuuriat, podotsüütide kadu ja glomerulaarkahjustusi

Seejärel uurisime, kas autofagia blokaad ainult podotsüütides (Nphs2.cre Atg5laxlox hiired) mõjutab AnglI pluss HSD mudelis glomerulaarkahjustusi. Esmalt kinnitasime, et Nphs2. cre Atg5 hiirtel oli normaalne vererõhk, normaalne neerufunktsioon ja glomerulaarsed histoloogilised kahjustused kuni 10 kuu vanuseni, nagu varem teatatud (täiendav lox (WT) ja Nphs2.cre Atgslox joonis S4).2 Seejärel infundeeriti Atg5'cl hiirtele AngII HSD-ga 6 nädalat. Oluline on see, et süstoolne vererõhk oli kahes rühmas pärast AnglI infusiooni uuringu ajal sarnane (joonis 2a), kuigi vererõhu mõõtmiseks kasutatav sabamanseti meetod ei pruugi olla võimeline väikeseid vererõhu erinevusi lahendama. Angl infusioon HSD-ga suurendas märkimisväärselt uriini albumiini ja kreatiniini suhet WT hiirtel ja see toime suurenes hiirtel veelgi (joonis 2b). Hüpertensiivsetel Nphs2.cre Atg5lox/lox Nphs2.cre Atgsoxlox hiirtel esines ka oluliselt suurenenud glomerulaarskleroos võrreldes WT pesakonnakaaslastega (joonis 2c-e). Kooskõlas mõõdetud proteinuuriaga olid ATG5 podotsüütide puudulikkusega hiirtel valgulised kihid ja torukujuline dilatatsioon oluliselt rohkem levinud (joonis 2f-h).

Podotsüüdi arv glomeruli kohta vähenes oluliselt Nphs2.cre Atg5loxlox puhul (joonis 2i-k). Podotsüüdi kahjustus Nphs2.cre Atgsoxlo hiirtel AngII infusiooni ja HSD-ga progresseerus isegi fokaalseks ja segmentaalseks glomeruloskleroosiks, nagu näitab parietaalepiteeliraku (PEC) ekspressioon. ) aktiveerimismarker CD44 glomerulites (joonis 2l ja m). Elektronmikroskoopia analüüs tuvastas olulised muutused, mis on seotud ATG5 puudulikkusega kroonilise AngII infusiooniga HSD-ga, sealhulgas jalgade protsessi tuhmumine ... hiirtel. Seevastu vähesed ultrahüpertensiivsed Nph2-d. cre Atg5'oxlx struktuursed defektid leiti WT hiirte podotsüütides isegi pärast 10-nädalast AngII infusiooni HSD-ga (joonis 2n ja o), mis näitab, et podotsüütide autofaagiline aktiivsus on vajalik nende resistentsuse tagamiseks Angeli pluss HSD-st põhjustatud kahjustuste suhtes. Kokkuvõttes näitasid meie tulemused, et AnglIl pluss HSD mudelis süvendab autofagia inhibeerimine podotsüütide vigastusi ja kadu ning kutsub esile järgneva fokaalse ja segmentaalse glomeruloskleroosi.

Joonis 2|Atg5 deletsioon podotsüütides põhjustab märkimisväärselt albuminuuria, neerukahjustuse ja podotsüütide kadumise suurenemist pärast 6-nädalast angiotensiin Il (Angel) infusiooni ja kõrge soolasisaldusega dieeti (HSD). (a) Süstoolne vererõhk Atgslo/b ja Nphs2.cre Ataslo hiirtel 36 päeva jooksul Angel pluss HSD.n =9 hiirt genotüübi kohta. Väärtused on esitatud kui keskmine ± SEM. Kahesuunaline dispersioonanalüüs (ANOVA): ns. (bm),n =10 hiires genotüübi kohta. In(b,g,h,k) on väärtused esitatud üksikute graafikutena ja keskmisena ± SEM.(b) Angel pluss HSD (jätkub)

Joonis 3| Kalpaiini ekspressioon ja aktiivsus podotsüütides. (a) Western blot analüüs kalpaiini-1.kalpaiini-2 ja kalpaiini-4 ekspressiooni kohta primaarsetes podotsüütides. Tubuliini ekspressioon toimib normaliseerimisena. (b) Kalpaiini aktiivsust mõõdeti primaarsetel podotsüütidel, mida raviti või ei ravitud angiotensiin ll-ga (Angel; 100 nM) 24 tunni jooksul koos kalpeptiiniga (10 uM) või ilma, n =5 sõltumatut katset. Väärtused on esitatud üksikute graafikutena ja keskmised ± SEM. Ühesuunaline dispersioonanalüüs (ANOVA): ravi, P=0.0035.Sidaki mitmekordne võrdlustest:*P=0.0128 Angll versus baasjoon," P=0.0056 jaoks Angll pluss kalpeptiin versus Angll.(c) Kalpaiini aktiivsust mõõdeti metsikut tüüpi (WT) või kalpastatiini transgeensete (CST') hiirte primaarsetel podotsüütidel, keda raviti või ei ravitud Angeliga (100 nM) 24 tundi. n {{18} } sõltumatut katset. Väärtused on esitatud üksikute graafikutena ja keskmisena ± SEM. Kahesuunaline ANOVA paaris ravi genotüübi jaoks. P= 0,0483. Sidaki mitmekordne võrdlustest:**P=0,0009 WT jaoks Angll versus lähtetase,*P=0.0420 CST'9 jaoks Angll versus lähtejoon, *P=0.0424 WT versus CST9 Angll.

Palun klõpsake siin 2. osa juurde