1. osa: Ephedra Fragilise bioaktiivsed ühendid: ekstraheerimise optimeerimine, keemiline iseloomustamine, antioksüdant ja glükoosivastane toime

Lisateabe saamiseks. kontaktitina.xiang@wecistanche.com

Abstraktne: Ephedra fragilis'est bioaktiivsete ühendite ekstraheerimise optimeerimiseks kasutati Box-Behnkeni (BBD) kujundusega reageerimispinna metoodikat (RSM). Tulemused näitasid, et selle muutujate kombinatsiooni jaoks oli parim lahendus ekstraheerimine 61,93% etanooliga temperatuuril 44,43 kraadi 15,84 tundi. Optimaalsetes ekstraheerimistingimustes saadud tooretanooliekstrakt (CEE) fraktsioneeriti järjestikku kasvava polaarsusega lahustitega. Üldfenooli (TP) ja üldflavonoidi (TF) sisaldus, samutiantioksüdantja antiglükatsiooni aktiivsust mõõdeti. Kõrgeima aktiivsusega fraktsiooni fütokeemilist sõrmejälje profiili iseloomustati RP-HPLC abil. Etüülatsetaadi fraktsioonil (EAF) oli kõrgeim TP ja TF sisaldus ning sellel oli kõige tugevam antioksüdant ja antiglükatsioon. Pearsoni korrelatsioonianalüüsi tulemused näitasid, et TP ja TF sisaldused olid väga olulises korrelatsioonis antioksüdantide ja antiglükatsiooni aktiivsusega. Kokku tuvastati E. fragilis'e EAF-is kuus ühendit, sealhulgas neli fenoolhapet ja kaks flavonoidi. Lisaks näitas molekulaarne dokkimisanalüüs ka võimalikku seost tuvastatud bioaktiivsete ühendite ja nende toimemehhanismide vahel. Meie tulemused viitavad uutele tõenditele E. fragilis'e bioaktiivsete ühendite antioksüdantse ja antiglükatsioonilise toime kohta, mida saab kasutada vananemise ja glükatsiooniga seotud tüsistuste ravis ja ennetamisel.

Märksõnad: Ephedra fragilis; vastuse pinna metoodika; Box-Behnken disain; bioaktiivsed ühendid; RP-HPLC; antioksüdantne ja antiglükatsiooniline toime

Toodete lisateabe saamiseks klõpsake siin

1. Sissejuhatus

Pidev kokkupuude erinevatest allikatest pärit agressoritega võib kaasa tuua tõusuvabad radikaalidtootmist inimkehas, ületades selle võimet neid reguleerida, ning aja jooksul aitab see kaasa mitmete oksüdatiivse stressiga seotud haiguste, sealhulgas vananemise ja diabeedi tekkele[1]. Seegaantioksüdandidtoidulisandid võivad aidata säilitada optimaalset bioloogilist süsteemi, eemaldades vabade radikaalide liigse kontsentratsiooni [2]. On tõestatud, et vabad radikaalid osalevad glükoosiprotsessis. Glükatsioon, spontaanne mitteensümaatiline reaktsioon valkude aminohappejääkide saadaolevate aminorühmade ja redutseerivate suhkrute vahel, esineb suuremal määral vananemise ja hüperglükeemia korral, mille tulemuseks on glükatsiooni lõppproduktide (AGE) tootmine ja akumuleerumine 3]. Lisaks valkude häirimisele ja nende funktsionaalsuse muutmisele võivad AGE-d ka seda teha

haakub AGE-de (RAGE) retseptoriga, 45 kDa multiligandi rakupinna retseptoriga, mis kuulub immunoglobuliinide superperekonda [4], ja aktiveerib mitu allavoolu intratsellulaarset signaaliülekande rada, millega kaasneb vabade radikaalide tootmise suurenemine, mis aitavad kaasa patoloogilistele tüsistustele. diabeedi korral [5].

On hästi teada, et antioksüdandid ja radikaalide püüdjad on nende protsesside vastu head kaitsjad [6]. Ravimtaimede kasutamine oksüdatiivse stressiga seotud haiguste ennetamisel ja tasakaalustamisel on vana meditsiinitraditsioon. Hiljuti on paljud uuringud näidanud, et sekundaarsed metaboliidid, nagu tanniinid, fenoolhapped ja flavonoidid, millel on kaks antioksüdantset ja antiglükatsioonipotentsiaali, on suhkurtõve ravis tõhusamad [7]. Seetõttu pakub suurt huvi uute fütokemikaalide allikate tuvastamine, mis tõhusalt eemaldavad vabu radikaale ja vähendavad mitteensümaatilist glükatsiooni.

Ephedra fragilis on Ephedra perekonna (Ephedracea perekond) liige, mis sisaldab enam kui 60 liiki, mis kasvavad mõlemal poolkeral kuuel kontinendil kõrbes ja poolkuivades tingimustes [8]. Rohkem kui 5000 aastat on paljusid Ephedra perekonna liike traditsioonilises hiina meditsiinis (TCM) tavaliselt kasutatud mitmete haiguste raviks; on tehtud mitmeid uuringuid, mis on teatanud nende mitmetest tervisega seotud eelistest, nagu põletikuvastane [9, invasiivne, antiangiogeenne, [10], antimikroobne, antiproliferatiivne, pro-apoptootiline[11], neuroprotektiivne [12], hepatoprotektiivne ja antioksüdant. -oksüdeerivad omadused [13]. Flavonoide, alkaloide, fenoolhappeid ja muid efedra taimede ühendeid on peetud nende farmakoloogiliste omaduste peamisteks fütokeemilisteks komponentideks [14]. Farmaatsiatööstuses kasutatakse pöördfaasi kõrgsurvevedelikkromatograafiat (RP-HPLC) laialdaselt analüütilise meetodina keemiliste ühendite tuvastamiseks ja tuvastamiseks nende erinevate hüdrofoobsete omaduste põhjal, kuigi kirjanduses on kirjeldatud vähe uuringuid Efeedra liigid.

Nende bioaktiivsete ühendite ekstraheerimine erinevatest taimeallikatest on esimene oluline samm nende kvalitatiivses ja kvantitatiivses analüüsis [15]. Erinevad tegurid, nt. ekstraheerimismeetod, lahusti tüüp ja kontsentratsioon, temperatuur, aeg ja muud võivad oluliselt mõjutada nende ühendite koostist ja ekstraheerimiskiirust [16]. Seetõttu on kõrge taimsete toimeainete sisalduse saamiseks vaja ekstraheerimisprotsesse optimeerida. Algselt 1950. aastatel Boxi ja Wilsoni poolt välja töötatud reageerimispinna metoodika (RSM) on tänapäeval kõige sagedamini kasutatav vahend selliste protsesside läbiviimiseks, täiustamiseks ja optimeerimiseks, kus sõltumatutel teguritel on kombineeritud mõju soovitud vastusele. Teadlaste üks RSM-i kõige sagedamini valitud kujundusi on Box-Behnkeni disain (BBD), kuna see vajab piiratud katsetamist ja on seetõttu alternatiiv, mis väldib pikaajalisi katseid ja vähendab kulusid [17-19].

Seni ei ole kirjanduses kättesaadavad uuringud E. fragilis'e bioaktiivsete ühendite ekstraheerimise optimeerimise kohta. Seetõttu oli selle uuringu eesmärk optimeerida kogu fenooli (TP) ja flavonoidide (TF) sisalduse ekstraheerimist E. fragilis'est, rakendades BBD-d. Optimaalsetes ekstraheerimistingimustes saadud tooretanooliekstrakt (CEE) fraktsioneeriti järjestikku kasvava polaarsusega lahustitega ning nende antioksüdantset ja antiglükatsioonilist aktiivsust uuriti erinevate in vitro testide abil. Lõpuks teostasime in silico analüüsi, et paremini mõista mehhanisme, mille abil EAE bioaktiivsed ühendid, mis on tuvastatud pöördfaasi kõrgsurvevedelikkromatograafia (RP-HPLC) abil, seonduvad sihtvalkudena BSA ja RAGE-ga.

2. Tulemused ja arutelu

2.1. Mudelite sobitamine

RSM with a BBD was applied to investigate the effect of ethanol concentration (%, Xj), temperature(°C, X2), and time (h, X3)on the extraction yield of TP and TF from E. fragilis. The results of 15 trials after the BBD are given in Table 1. Analysis of variance(ANOVA)(Table 2) indicates that the models were significant as evidenced by F and p-values. The coefficient of multiple determinations (R')of the models were 0.9935 and 0.9939 for TP and TF, respectively, suggesting that only 0.65 and 0.61%of the total variations are not explained by the models. A comparable value of adjusted R2 to R2 represents an excellent statistical model. As given in Table 2, the adjusted R2(0.9818 and 0.983 for TP and TF contents, respectively) is close to R2, which means that the insignificant terms were not included in the models. Moreover, predicted R2(0.9012 and 0.9338 for TP and TF contents, respectively) is in reasonable agreement with adjusted R2 and confirms that the models are highly significant. The"fitness" of the models was also confirmed using the lack of fit test The insignificant p-value for lack of fit (p >{0}}.05) kahe vastuse korral näitab mudelite sobivust tulemuste variatsiooni täpseks ennustamiseks [20]. Head täpsust kirjeldatakse kui signaali-müra suhet, mis on suurem kui 4, mida peetakse soovitavaks [21]. Piisava täpsusega väärtused on TP ja TF sisu jaoks vastavalt 29,4772 ja 28,729, mis näitab piisavat signaali. Samal ajal näitavad variatsioonikoefitsiendi väiksemad väärtused (CV protsenti) (vastavalt 1,52 ja 0,4246 protsenti TP ja TF sisalduse puhul) katseväärtuste paremat täpsust ja usaldusväärsust. Iga reaktsiooniteguri puhul uuriti hoolikalt ekstraheerimistegurite XI (etanooli kontsentratsioon), X2 (ekstraheerimistemperatuur) ja X3 (ekstraheerimisaeg) mõju (tabel 2). Iga koefitsiendi olulisust testiti F- ja p-väärtuste abil, arvestades, et suurem F-väärtus ja väiksem p-väärtus tõid alati kaasa olulisema vastavuse erinevate sõltumatute muutujate vahel [22]. Need tulemused näitasid ühiselt, et mudelid olid reprodutseeritavad ja sobivad optimeerimiseks.

2.2. Ekstraheerimismuutujate mõju TP sisule

Nagu on näidatud tabelis 2, näitasid ANOVA tulemused märkimisväärset lineaarset (X ja X2), ruudukujulist (Xj, X5 ja X) ja interaktiivset (X1X ja X2X3) mõju TP sisaldusele. Nende hulgas sõltub TP sisu peamiselt X-st, X3-st p<0.001 followed="" by="" x1="" and="" x1x,="" at=""><0.01. the="" following="" second-order="" polynomial="" equation="" could="" be="" used="" to="" express="" the="" relationship="" between="" tp="" content="" and="">

Sobivuse puudumise väärtus oli ebaoluline (F-väärtus =11.02, p-väärtus=0.0843), mis näitab, et mudel on hästi koostatud hea prognoosiga (R{ {9}}.9935; Adj R2=0.9818)(tabel 2).

Etanooli kontsentratsiooni ja ekstraheerimistemperatuuri (XjX2) vahelised vastasmõjud annavad väga olulise (lk<0.01)effect on="" tp="" content="" (table2).="" as="" ethanol="" concentration="" (x1)="" and="" extraction="" temperature="" (x)increase="" in="" the="" range="" of="" 40-61.80%="" and="" 25-44.30°c="" respectively,="" the="" tp="" content="" increases="" rapidly.="" however,="" beyond="" 61.80%and="" 44.30°c,="" tp="" content="" decreases="" slightly(figure="" 1a).="" however,="" the="" interaction="" of="" the="" extraction="" temperature="" and="" extraction="" time="" (x2x3)showed="" a="" highly=""><0.001) effect="" on="" tp="" content="" (table="" 2).="" as="" shown="" in="" figure="" 1b,="" tp="" content="" slightly="" improved="" with="" increasing="" extraction="" temperature="" (x2)and="" extraction="" time="" (x3)up="" to="" 44.37℃c="" and="" 15.77="" h,="" respectively,="" but="" diminished="" slowly="">

Need mõjud võivad olla tingitud asjaolust, et fenoolsed ühendid on polaarsed molekulid, mis looduslikult esinevad koos glükosiididega, mis muudab need vees paremini lahustuvaks [23]. Kuna fenoolsete ühendite ekstraheerimine sõltub tugevalt lahusti polaarsusest, on vee-alkoholi segu ekstraheerimisel efektiivsem kui ainult alkohol [20]. "Sarnane-lahustub-sarnane" põhimõttel toob etanooli kontsentratsiooni vähenemine kaasa lahusti polaarsuse suurenemise, mis aitab TP-d lahustada[15]. Sellegipoolest võib kõrge etanoolikontsentratsioon mõjutada ekstraheerimiskiirust, takistades fenoolsete ühendite lahustumist. Samuti suurendas ekstraheerimistemperatuuri tõus sihtmärk-fenoolühendite taastumist kudede pehmendamise kaudu, nõrgendas rakuseina terviklikkust, suurendas massiülekannet ja lahusti tungimist taimemaatriksisse ning suurendas nii lahustuvust kui ka difusioonikiirust; pikemaks ekstraheerimisajaks liiga kõrged temperatuurid võivad aga suurendada nende lagunemise tõenäosust [23]. Lisaks on leitud, et pikk ekstraheerimisperiood võib potentsiaalselt pikendada hapniku ja valgusega kokkupuudet, mis lõppkokkuvõttes suurendab vabade radikaalide tekke ohtu, mida fenoolühendid võivad eemaldada [23]. Seetõttu ei olnud pikendatud ekstraheerimisajast abi ekstraheerimissaagise maksimeerimiseks [24].

2.3. Ekstraktsioonimuutujate mõju TF-i sisule

Nagu tabelist 2 nähtub, on X ja X3 lineaarsed efektid; X ja X ruutmõjud; ning X1X2 ja XjXg interaktsiooniefekt näitas olulist mõju TF sisaldusele. Kõigist olulistest teguritest sõltub TF peamiselt p-s X3, X, X, X ja X1X2<0.001 followed="" by="" x="" andx1x3="" at=""><0.01. the="" fitted="" second-order="" polynomial="" of="" tf="" content="" is="" as="">

Sobivuse puudumise mitteoluline väärtus (F-väärtus=1.13; p-väärtus=0.5024) viitas sellele, et pakutud mudel sobitus muutujate ruumilise mõjuga vastusele heaga ennustus (R2=0.9939; Adj R2= 0.9830) (tabel 2).

TF-i sisu jaoks genereeriti erinevad 3D-vastuse pinnagraafikud, mis on näidatud joonisel 1D-F. Etanooli kontsentratsiooni ja ekstraheerimistemperatuuri (X1X2) koosmõju näitas olulist (lk<0.001) effect="" on="" tf="" content.="" from="" figure="" 1d,="" tf="" content="" increased="" at="" first="" and="" then="" decreased="" quickly="" with="" the="" rise="" of="" the="" two="" parameters,="" and="" a="" maximum="" tf="" content="" was="" achieved="" when="" ethanol="" concentration="" (xj)="" and="" extraction="" temperature="" (xo)were="" 61.89%="" and="" 44.23°c,="" respectively.="" this="" phenomenon="" is="" similar="" to="" tp,="" which="" might="" also="" be="" attributed="" to="" the="" fact="" that="" a="" rise="" in="" the="" extraction="" temperature,="" the="" solubility,="" extraction="" rate,="" and="" diffusion="" rate="" increase,="" which="" ultimately="" helps="" tf="" to="" dissolve="" insolvent="">

Samamoodi näitas etanooli kontsentratsiooni ja ekstraheerimisaja (XIX3) vaheline interaktsioon sarnast korrelatsiooni (joonis 1F). TF ekstraheerimise saagis suurenes järk-järgult nii etanooli kontsentratsiooni (Xj) kui ka ekstraheerimisaja (X3) suurenemisega. Vastusgraafiku keskpunkti lähedal (vastavalt 61,89 protsenti ja 15,81 tundi X ja X3 puhul) saavutas TF saagis kõrgeima, kuid vähenes seejärel aeglaselt. See nähtus on tõenäoliselt tingitud Ficki difusiooniprintsiibi teisest seadusest, mis näitab, et lõplik tasakaal tahke maatriksi lahuse kontsentratsiooni ja lahusti vahel saavutatakse teatud aja möödudes, mis viib sihtühendite ekstraktsioonisaagise aeglustumiseni [26]. .

2.4. Optimeeritud tingimuste kinnitamine

Optimeerimise eesmärk oli määrata ekstraheerimistingimused, mis tagaksid üheaegselt kõrgeima TP ja TF sisalduse. Optimeerimise läbiviimiseks kasutati disainieksperttarkvara. BBD pakkus E. fragilis'e bioaktiivsete ühendite ekstraheerimiseks optimaalseks etanooli kontsentratsiooniks, ekstraheerimistemperatuuriks ja ajaks vastavalt 61,93 protsenti, 44,43 kraadi ja 15,84 tundi. Sellel optimaalsel hetkel oli prognoositud TP ja TF sisaldus vastavalt 15,335 mg GAE/g dw ja 2,972 mg OE/g dw (tabel 3). Mudelite ennustusvõime valideerimine viidi läbi eksperimentaalselt RSM-ist saadud optimaalsetes tingimustes. Katsed viidi läbi kolmes korduses saadud tingimustes ning keskmine TP ja TF sisaldus oli vastavalt 14,98±0,29GAE/g DW ja 2,92±0,09 QE/g dw. Uuritud vastuste eksperimentaalsed väärtused olid võrreldavad ja kooskõlas prognoositud väärtustega, mis kinnitas, et mudelid olid eeldatava optimeerimise kajastamiseks piisavad.

2.5. Ekstraheerimise saagis ja fütokeemiline analüüs

Tabelis 4 on näidatud E. fragilis CEE ja selle fraktsioonide ekstraktsioonisaagis. Meie tulemused näitasid, et ekstraheerimissaagis eri fraktsioonides erineb oluliselt 0,78 kuni 10,6 protsenti (w/wo). Nagu on näidatud tabelis 4, on CEE(1{{14} Suurim saagis oli },6 protsenti, järgnesid WF (2,73 protsenti), WBF (2,{16}}4 protsenti), DMF (0,64 protsenti) ja EAF (0,93 protsenti), HF (0,78 protsenti). ) oli madalaima saagikuse protsendiga.

E. fragilis CEE ja selle fraktsioonide TP sisaldus määrati kalibreerimiskõvera (y {0}}) regressioonivõrrandi abil.009x-0.{{ 25}}154; R2=0,9973) ja väljendatud gallushappe ekvivalentide (GAE) milligrammides ühe grammi kuivatatud massi kohta (tabel 4). Üldiselt oli kõrgeim TP sisaldus EAF-il (32,78±0,49 mg GAE/g DW), millele järgnesid järjestikku WBF, DMF ja CEE (25,02±1,01, 19,21±0,22 ja 14,98±0,29 mg GAE/g). DW), samas kui WF ja HF olid madalaima sisaldusega (vastavalt 10, 47 ± 0, 71 ja 8, 14 ± 0, 17 mg GAE / g DW). E. fragilis CEE ja selle fraktsioonide TF sisaldust hinnati alumiiniumkloriidi kolorimeetrilise analüüsiga, kasutadeskvertsetiinas a standard (y=0.0295x+0.0361; R2=0.9986)(Table 4). Similar to the TP content, the same results were observed in the TF content with the highest and lowest content being detected in the EAF(10.50 ± 0.11 mg OE/g of DW)and HF(1.65± 0.13 mg OE/g of DW), respectively. The TF content is arranged as the following sequence: EAF>WBF>DMF> CEE>WF>HF. Huvitaval kombel olid TP ja TF sisaldused EAF-is 2,18 ja 3{3} korda kõrgemad kui Kesk- ja Ida-Euroopas, mis viitab sellele, et etüülatsetaat võib olla sobiv lahusti, et kontsentreerida rohkem saadaolevaid fenooli- ja flavonoidühendeid CEE fraktsioneerimise ajal. Meie andmed TP ja TF sisu kohta on kooskõlas Yao jt andmetega. [27], kes teatavad, et ravimtaimest Pyrola asarifolia saadud EAF-is oli võrreldes teiste fraktsioonidega (petrooleeter, n-butanool ja vesi) kõrgeim fenoolide ja flavonoidide sisaldus. Oma uuringus on Bhardwaj et al. [28] teatasid ka sarnastest tulemustest, kui kasutati mitut kasvava polaarsusega lahustit (n-heksaan, kloroform, etüülatsetaat ja n-butanool) ravimtaime Codonopsis clematidea lõhustamisel. Nende autorite sõnul on EAF-is kõrgeim TP ja TF sisaldus, millele järgneb kaugelt n-butanool, kloroform ja heksaan. See märkimisväärne erinevus ekstraheerimise saagikuses, koostises ja fenoolühendite puhtuses fraktsioonide vahel on tõenäoliselt tingitud erinevustest taimsetes materjalides leiduvate koostisosade polaarsuses, nende keemilises struktuuris, polümerisatsiooniastmes ja nende vastastikusest mõjust [29]. ].

2.6. In vitro antioksüdantne aktiivsus

2.6.1.DPPH"Puurimistegevus

DPPH" on üks vähestest stabiilsetest vabadest radikaalidest, mida kasutatakse laialdaselt taimeekstraktide antioksüdantse potentsiaali uurimiseks [30]. Ekstrakti püüduri potentsiaali seostatakse sageli selle võimega eemaldada stabiilseid vabu radikaale, mis on tingitud selle vesinikku annetavast võimest. .

Uuriti nii CEE/fraktsioonide kui ka VC eemaldamisvõimet DPPH* vabade radikaalide erinevatel annustel. Joonisel 2A on näidatud, et kõik fraktsioonid näitasid ilmset DPPH-d siduvat aktiivsust annusest sõltuval viisil vahemikus 0,1 kuni 1 mg/mL. Annuse 1 mg/ml korral 64,32, 44,1{{22} },67,24, 86,63,80,95,51,37 ja 99,62 protsenti DPPH"radikaalist kustutasid vastavalt CEE, HE, DMF, EAF, WBF, WF ja VC. EAF (0,116±{{30}}.015 mg/mL) kuvas kõigi fraktsioonide hulgast madalaima IC50 eemaldava DPPH" )töötleb WBF (0.175 ± 0.03 mg/mL), CEE (0.23 ± 0.065 mg/mL) ja DMF (0.297) ±0,044 mg/mL).WF ja HF näitasid suhteliselt kõrgemaid IC50 väärtusi (vastavalt 0,964±0,178 ja 1,245±0,105 mg/ml).

Observed differentials in the scavenging activities of the fractions against the DPPH*radical may be assigned to the structural characteristics and the number of phenolic compounds present in each fraction. Similar results were observed in the medicinal plant Liquidambar formosana Hance leaf since the EAF was more effective than the other fractions (dichloromethane, n-butanol, and water fractions)[31]. As a standard molecule, ascorbic acid (VC) displayed the lowest IC50 value (0.039 ±0.009 mg/mL) in comparison to all fractions. The scavenging potential is in decreasing order of VC>EAF> WBF>DMF >CEE>WF>HF.

DPPH radikaali eemaldamise IC50 väärtus oli märkimisväärselt positiivne korrelatsioonis mõlema TP sisaldusega (r=0.963;p<0.01) and="" tf="" content(r=""><0.01)as presented="" in="" table="" 5.="" therefore,="" the="" discovered="" antioxidant="" activity="" suggested="" that="" eaf="" can="" be="" a="" source="" of="" numerous="" natural="" compounds="" with="" antioxidant="" properties="" that="" can="" act="" as="" hydrogen="" donors="" to="" terminate="" the="" process="" of="" oxidation="" by="" converting="" the="" free="" radicals="" to="" their="" stable="">

2.6.2.ABTS· pluss puhastustegevus

ABTS-i eemaldamisanalüüsi kasutatakse laialdaselt indeksina, et teavitada ja uurida puhaste ühendite ja looduslike ekstraktide antioksüdantset võimet [32, 33]. ABTS* kromofoori sinise/rohelise värvuse tuhmumine temperatuuril 734 taimeekstrakti juuresolekul võib viidata antioksüdantsele toimele.

Nagu on näidatud joonisel 2B, näitas CEE/fraktsioonide puhastuskõver ABTS* pluss kontsentratsiooni suurenedes tõusutrendi. 1 mg/ml juures olid CEE, HF, DMF, WBF, EAF, WF ja VC eemaldamismäärad 80,31,40,54, 88,76, 9{{2{ {22}}}},11, 82,97, 67,36 ja 94,90 protsenti vastavalt. Kõigist murdosadest näitas EAF(0.11{{30}}±0.014 mg/) minimaalset ICs0 väärtust ml) töödeldi DMF-iga (0,196±0.023 mg/mL), WBF (0.277±0,031 mg/mL), CEE (0,429) ± 0,039 mg/ml) ja WF (0,654 ± 0,043 mg/mL), samas kui HF näitas kõrgeimat ICs0 väärtust (1,314 ± 0,104 mg/ml). Kokkuvõttes oli see järeldus Kaewseejani ja Siriamornpuni omaga [29]. Võrdlus VC inhibeerimisvõimega (0, 025 ± 0, 005 mg / ml) näitas, et CEE ja selle fraktsioonide puhastav aktiivsus oli veidi nõrk.

Nagu on näidatud tabelis 5, on ABTS-i radikaalide eemaldamise ja TP sisaldusega väga oluline korrelatsioon (r=0.921;p<0.01), and="" a="" significant="" correlation="" with="" tf="" content="" (r=""><0.05), were="" shown.="" this="" finding="" confirms="" the="" results="" obtained="" for="" the="" dpph*scavenging="" assay,="" proving="" the="" capacity="" of="" eaf="" to="" scavenge="" free="">

2.6.3. H2O2 eemaldamise aktiivsus

Olles peamine oksüdatiivse stressi põhjustaja, difundeerub H2O2 kergesti läbi rakkude membraani kaudu sõnumitooja molekulina [34]. Kokkuvõttes ei ole H2O2 iseenesest ohtlik [35], kuid see võib Fentoni reaktsiooni kaudu reageerida Fe2-ga ja tekitab kõrge reaktsioonivõimega hüdroksüülradikaali (OH*)[36]. Seega on see ROS-ist biomolekulidele kõige kahjulikum. Seetõttu on vaja hinnata CCE ja selle erinevate fraktsioonide võimet H2O2 eemaldada.

Scavenging activities of CEE/fractions, as well as standard antioxidants, were presented in Figure 2C. Notably, all extracts showed a strong scavenging activity on HO, which increased with the increase of sample doses ranging from 0.1 to 1 mg/mL. Moreover, the H2O2 scavenging potential decreased in the order of EAF> WBF>DMF>CEE>WF>HF ja vastav puhastusvõime 1.0 mg/ml juures olid vastavalt 84,56, 75,24, 67,17, 56,18, 50,19 ja 34,95 protsenti, mis olid palju madalamad kui VC-l (98,03 protsenti).

Kõigist fraktsioonidest näitas EAF madalaimat IC50 väärtust (ICs0= 0.098±0,013 mg/ml) ja see oli oluliselt kõrgem kui VC (0,024±0,006 mg/ml). See võib olla tingitud kõrge fenool- ja flavonoidühendite olemasolust EAF-is, millel on laialdaselt teada, et neil on bioloogilistes süsteemides antioksüdantidena ülioluline roll. Oma hiljutises uuringus demonstreerisime E.fragilis'e EAF-i võimet kaitsta Tetrahymena pyriformis't H2O2-indutseeritud oksüdatiivsete kahjustuste eest [37].

Meie andmeanalüüs näitas, et nagu DPPH" ja ABTS* pluss tulemuste puhul, täheldati H2O2 eemaldamise ICs0 väärtuse tugevat positiivset korrelatsiooni mõlema TP sisuga (r=0.926; p<0.01) and="" tf="" content="" (r=""><0.01)(table 5).="" in="" their="" study,="" sroka="" and="" cisowski="" [38]="" reported="" also="" a="" positive="" correlation="" between="" phenolic="" compounds="" with="" ho2-scavenging="" ability.="" according="" to="" these="" authors,="" the="" ho2-scavenging="" depended="" strongly="" on="" the="" number,="" positions,="" and="" the="" model="" of="" substitution="" of="" oh="" bonded="" to="" the="" aromatic="" ring="" of="" phenolic="">

2.6.4. Võimsuse vähendamine

Ekstrakti redutseeriv jõud toimib selle potentsiaalse antioksüdantse aktiivsuse indikaatorina [39, A40]. Antioksüdantide potentsiaali hinnatakse antioksüdantide võime järgi redutseerida raud(Fe3) raudkloriidis raud(Fe2 pluss). Üldiselt omistatakse redutseerivad omadused taimeekstraktides sisalduvatele reduktoonidele, mis avaldavad oma toimet vabade radikaalide ahela katkestamisel vesinikuaatomi loovutamise kaudu [41].

Joonisel 2D on näidatud E. fragilis'e ekstraktide redutseerimisvõime annuse-vastuse kõver. On teada, et mida suurem on neeldumine 700 nm juures, seda suurem on redutseerimisvõime. Käesolevas uuringus näitas CEE ja selle viis fraktsiooni märkimisväärset redutseerimisvõimet kontsentratsioonist sõltuval viisil.

EAF näitas maksimaalset antioksüdantset aktiivsust (EC{0}},136± 0.{{10}}13 mg/mL) võrreldes VC-ga (EC{{4). }}.083± 0.005 mg/mL).Sellele järgnes täpselt WBF (EC50=0.180 ± 0,028 mg/mL), DMF (EC50=0,319 ± 0,031 mg/ml), CEE (EC50=0.334±0,029mg/mL) ja WF (EC50=0.398±0,064 mg/mL) .HF on tagapool, mis näitab minimaalset vähendavat võimsust (EC5s0 =0.626±0,068 mg/ml) võrreldes teiste fraktsioonidega. Need leiud viitavad sellele, et EAF võib sisaldada erinevaid üksikuid ühendeid, millel on tõhus ja tugev vähendav aktiivsus. Teadlased on leidnud, et etüülatsetaadi ekstraktid võivad toimida tugevate antioksüdantidena [42].

Positiivset korrelatsiooni täheldati vähendava võimsuse ning nii TP kui ka TF sisalduse vahel (r=0.975; p<0.01 and="" r="0.987;"><0.01; respectively).these="" correlations="" confirmed="" the="" contribution="" of="" phenolic="" compounds="" in="" the="" reducing="" power="">

2.6.5. Fosfomolübdeeni analüüs

CEE ja selle fraktsioonide TAC-i, samuti VC-d hinnati fosfo-molübdeeni testiga ja väljendati EC-dena 0, mis on kontsentratsioon, mis annab neeldumise 0,5. Meetod põhines Mo(VI) redutseerimisel Mo(V)-ks ekstraktidega, et moodustada happelise pH juures roheline fosfaat/Mo(V) kompleks, mille maksimaalne neeldumine lainepikkusel 695 nm [43].

As shown in Figure 2E, the total antioxidant capacity of CCE/fractions and VC correlated well with increasing concentrations in the range of 0.1 to 1 mg/mL.Of the CEE fractions, the ECs0 values ranged from 0.159±0.019 to 0.604±0.073 mg/mL, with a descending order of EAF>WBF> DMF> CEE >WF>HF(lk<0.05), which="" indicates="" that="" eaf="" and="" hf="" had="" the="" highest="" and="" lowest="" antioxidant="" activity,="" respectively.="" this="" activity="" could="" be="" due="" to="" the="" presence="" in="" eaf="" of="" various="" phenolic="" compounds="" that="" might="" possess="" antioxidant="" activity.="" vc,="" which="" is="" the="" positive="" control,="" displayed="" the="" lowest="" ec5o="" value="" (0.095±="" 0.008="" mg/ml)="" in="" comparison="" to="" all="">

Täheldati väga olulist korrelatsiooni kogu antioksüdantse aktiivsuse ning nii TP sisalduse kui ka TF sisalduse vahel (r=0.978 mõlema puhul;p<0.01) and="" is="" shown="" as="" presented="" in="">

2.6.6. -Karoteeni-linoleaadi mudelisüsteem

Karoteen-linoolhappe mudelis muutuvad väga küllastumata karoteeni molekulid linoolhappe oksüdeerumisel tekkivate linoleaadi vabade radikaalide tõttu kiiresti [44]. Antioksüdantidega täiendamine võib minimeerida karoteeni oksüdatsiooni, neutraliseerides linoleaadi vabu radikaale ja pärssides seega karoteeni pleegitamist [45].

Antioxidant activity of CCE/fractions and BHT, as measured by the β-carotene-linoleate model, are shown in Figure 2F. All tested extracts showed concentration-dependent scavenging activity. The EAF, which contained the highest amount of phenolics and flavonoids contents, showed a significant effect in inhibiting β-carotene bleaching, reaching 74.75%at a concentration of 1mg/mL. WBF, CCE, DMF, HF, and WF inhibited the oxidation of β-carotene by 51.61,58.12,50.09,41.39, and 31.66% respectively, at the same concentration. Overall, decreasing antioxidant activity was depicted as EAF> WBF> CEE>DMF>HF>WF.

EAF näitas minimaalset IC50 väärtust (IC50=0.127 ± 0.{{10}}42 mg/mL) võrreldes BHT-ga (ICs { {5}}.{13}}49 ± 0.001 mg/ml). WBF. CCE. DME. MEIE. ja HF näitasid suhteliselt kõrgemaid ICs0 väärtusi 0,5±0,111 mg/ml, 0,998±0,101 mg/ml, 1,073±0,084 mg/ml, 1,402±0,058 mg/ml ja vastavalt 2,209±0,081 mg/ml.

Täheldati olulist positiivset korrelatsiooni -karoteeni oksüdatsiooni eemaldamise ja mõlema TP sisalduse vahel (r= 0,850;p<0.05) and="" tf="" content="" (r=""><0.05)(table 5).="" this="" result="" suggests="" that="" eaf="" may="" contain="" some="" antioxidants="" that="" can="" inhibit="" the="" formation="" of="" hydroperoxide="" and="" stop="" the="" radical-chain="" reaction="">

The involvement of reactive oxygen species (ROS) in several pathological situations has been growing recently. Bioactive compounds are gaining interest thanks to their potent antioxidant activity, but their complexity imposes the development of many methods to evaluate the antioxidant activity and the effectiveness of these chemical compounds. Thus, in this study, CEE and its fractions have been investigated for their antioxidant potential using six assays: DPPH, ABTS, H>O, RP, TAC ja -karoteen. Seega näitasime, et CEE ja selle fraktsioonide tugevad antioksüdantsed aktiivsused näitasid suuremat eemaldamisaktiivsust ja see võib olla tugevalt tingitud nende koostisest fenoolhappest ja flavonoididest, nagu gallushape, rutiin ja kvertsetiin.