1. OSA Broomrapesist (Orobanche Caryophyllacea, Phelipanche Arenaria ja P. Ramosa) eraldatud fenüülpropanoidglükosiidide antioksüdant ja antikoagulant

Bartosz Skalski a, Sylwia Pawelec sm, Dariusz Jedrejek b, Agata Rolnik a, Rostyslav Pietukhov a,

Renata Piwowarczyk c, Anna Stochmal b, Beata Olas a,*

Ło´d´zi ülikool, üldbiokeemia osakond, bioloogia- ja keskkonnakaitseteaduskond, 90-236 Ł´od´z, Poola

b Biokeemia ja põllukultuuride kvaliteedi osakond, Mullateaduse ja taimekasvatuse instituut, Riiklik Uurimisinstituut, 24-100 Puławy, Poola

Bioloogilise mitmekesisuse uurimise ja säilitamise keskus, Jan Kochanowski ülikooli bioloogiainstituut, keskkonnabioloogia osakond, 25-406 Kielce, Poola

Abstraktne

Orobanchaceae holoparasiittaimed, sealhulgasCistanche, Orobanche ja Phelipanche spp. on tuntud oma fenüülpropanoidglükosiidide (PPG) rikkuse poolest. On leitud, et paljudel PPG-ühenditel on lai toimespekter, nagu antimikroobne, põletikuvastane, antioksüdant ja mälu parandav. Euroopa luude (O. Caryophyllaceae – OC, P. Arenaria – PA, P. ramosa – PR) ja kümne üksiku isoleeritud fenüülpropanoidkomponendi bioaktiivsuse potentsiaali paremaks uurimiseks uurisime nende radikaalidevastast toimet, kaitsvat toimet oksüdatsiooni vastu plasmas in vitro süsteemis. ja mõju hüübimisparameetritele. Testitud ekstraktid näitasid 50–70 protsenti Troloxi võimsusest. OC ekstrakt, mis on rikasakteosiid, omas üle 20 protsendi paremat antiradikaali potentsiaali kui PR-ekstrakt, mis oli ainus, mis sisaldas PPG-sid, millel puudus atsüülühikus B-tsükli katehhool. Lisaks leiti, et ainult kaheksa testitud PPG-d näitasid H2O2/Fe-ga töödeldud inimese plasmas antioksüdantset potentsiaali; kolmel testitud PPG-l oli aga lisaks antioksüdantsetele omadustele ka antikoagulantne potentsiaal. Näib, et PPG-de struktuur, eriti atsüül- ja katehhoolrühmade olemasolu, on peamiselt seotud nende antioksüdantsete omadustega. Nende ühendite antikoagulantne potentsiaal on samuti seotud nende keemilise struktuuriga. Valitud PPG-del on potentsiaal oksüdatiivse stressiga seotud südame-veresoonkonna haiguste raviks.

Lisateabe saamiseks võtke ühendust:Joanna.jia@wecistanche.com

Cistanchetubulosal on palju mõjusid

1. Sissejuhatus

Oksüdatiivne stress on laialdaselt tuntud oma negatiivse mõju tõttu elusorganismide tervisele, sealhulgas kiirenenud vananemisele ja mõnedele vähivormidele. Oksüdatiivse stressi tekkimine on seotud oksüdatiivsete ja antioksüdatiivsete mehhanismide (sh ensümaatilise (katalaas, glutatioonperoksidaas) ja mitteensümaatilise (glutatioon) kaitse) tasakaalu häirimisega keharakkudes [1]. Reaktiivsete hapnikuliikide (ROS), sealhulgas oksüdeerivate radikaalide ja suletud kestaga liikide ületootmine on üks peamisi oksüdatiivse stressi tekkemehhanisme. ROS-i põhjustatud bioloogiline mõju sõltub aga suuresti kontsentratsioonist, kokkupuute ajast ja asukohast. Normaalsetes tingimustes (madal kontsentratsioon) võivad hapniku/lämmastiku radikaalid mängida sekundaarsete sõnumitoojate rolli, kuid kõrgemal tasemel võivad nad hakata reageerima bioloogiliste struktuuridega, näiteks rakumembraanidega [2]. Kõigist ROS-liikidest põhjustab hüdroksüülradikaal (HO.) üht suurimat kahju biomakromolekulidele: valkudele, lipiididele ja DNA-le. Oksüdatiivne stress mängib teadaolevalt olulist rolli paljudes haigustes, sealhulgas südame-veresoonkonna haigustes. Veresüsteemi häired on olnud korrelatsioonis ja/või neile on eelnenud muutused hemostaasi ja plasma biomarkerite erinevates parameetrites [1,3].

Teisest küljest on paljud looduslikud ained, nagu polüfenoolid ja polüküllastumata rasvhapped, tuvastatud tugevate antioksüdantidena, mis on võimelised takistama reaktiivsete hapnikuliikide teket ja/või nende arvu vähendamist. Selliste omadustega ühendeid leidub paljudes taimset päritolu toiduainetes ja ravimpreparaatides. Seetõttu on laialdaselt soovitatav kasutada värskete köögiviljade ja puuviljadega rikastatud dieeti ning looduslikel antioksüdantidel põhinevaid antioksüdatiivseid ravimeetodeid, kuna need võivad vähendada oksüdatiivse stressi taset ja ennetada erinevaid patofüsioloogilisi protsesse [4,5]. Taimsed polüfenoolid on mitmekesine sekundaarsete metaboliitide rühm, mille hulgas on fenoolhapetel oluline koht, kuna need on laialt levinud ja neil on mitmesugused bioloogilised toimed, nagu antimikroobsed, antioksüdandid ja põletikuvastased. Fenüülpropanoidglükosiidid (PPG-d) on hüdroksükaneelhappe estrite sugulased ja need on peamine/ainuke sekundaarsete metaboliitide klass, mis esinevad holoparasiitsetes Orobanchaceae taimedes, sealhulgasCistanche, Orobanche ja Phelipanche spp. Mitmed selle perekonna liigid on tõsised põllukultuuride kahjurid, millest põllumehed tahavad põldudel vabaneda (näiteks Phelipanche ramosa), väheseid kasutatakse farmakoloogias, samas kui enamikul on inimeste jaoks vähe tähtsust. HerbaCistanchekasutatakse laialdaselt Aasia traditsioonilises meditsiinis neerupuudulikkuse ravis ning immuunsust ja mälu parandava, vananemis- ja väsimusvastase vahendina [6]. Erinevate uurimisrühmade fütokeemilised analüüsid on näidanud, et fenüülpropanoidglükosiidid, nagu atsetoniid, ehhinakosiid ja poodiumikülg, on üks Herba Cistanche peamisi toimeaineid [7]. Jedrejek jt hiljutine uuring mitme Poolast leitud luud-rapi liigi kohta. [8] on näidanud, et sellel taimsel materjalil on sarnane kvalitatiivne koostis (PPG-de domineerimine), pealegi on see võrdne või isegi ületabCistanchespp. toimeainete sisalduse poolest [8].

Cistanche deserticolal on palju mõjusid, lisateabe saamiseks klõpsake siin

Käesoleva uuringu eesmärk oli hinnata kolme erinevat fenüüli sisaldava luumarja ekstrakti (Orobanche Caryophyllaceae – OC, Phelipanache Arenaria – PA ja P. ramosa – PR) antiradikaalset ja antioksüdantset potentsiaali, samuti mõju hemostaasi parameetritele. -

prostanoidid, aga ka nende üksikud PPG koostisosad. Antiradikaalivõimet mõõdeti 2,2'-asinobis-3-etüülbenstiasoliin-6-sulfoonhappe/troloksiekvivalendi (ABTS/TE) ja 2,2-difenüül-1-pikrüülhübrasili (DPPH) abil. ) testid. Plasma testimissüsteemi oksüdatiivne stress indutseeriti hüdroksüülradikaali (H2O2/Fe) abil, seejärel mõõdeti lipiidide peroksüdatsiooni (tiobarbituurhappega reageerivate liikide (TBARS) test) ning valgu karbonüül- ja tioolrühmade taset. Hemostaasi määratud parameetrite hulka kuulusid: aktiveeritud osaline tromboplastiini aeg (APTT), protrombiiniaeg (PT) ja trombiiniaeg (TT).

2. Materjalid ja meetodid

2.1. Kemikaalid

2,2-difenüül-1-pikrüülhüdrasüülradikaal (DPPH), 2,2'-asinobis-3-etüülbenstiasoliin-6-sulfoonhape (ABTS), kaaliumpersulfaat, {{9 }}hüdroksü-2,5,7,8-tetrametüülkromaan-2-karboksüülhape (Trolox), dimetüülsulfoksiid (DMSO), tiobarbituurhape (TBA), sipelghape (LC-MS klass), ja H2O2 osteti firmalt Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Metanool (HPLC gradiendi puhtus) ja atsetonitriil (LC-MS puhtus) saadi firmalt Merck (Darmstadt, Saksamaa). Kümme fenüül-

selles töös testitud propaanühendid, sealhulgas 2'-O-atsetüüllakteosiid (97 protsenti), 2'-O-atsetüülpoliumosiid (98 protsenti), 3-O-metüülpoliumosiid (96 protsenti), atsetoniid (99 protsenti), areen seestpoolt (97 protsenti), krenatosiidi (98 protsenti), teniposiidi (99 protsenti), poliumosiidi (99 protsenti), tubulosiidi A (96 protsenti) ja wiedemanniosiid D (96 protsenti) eraldasime varem allpool etteantud taimsest materjalist. 8]. Ühendite puhtust hinnati UHPLC-PDA-MS analüüsi abil. Ultrapuhas vesi valmistati ettevõttesiseselt, kasutades Milli-Q veepuhastussüsteemi (Millipore Co.). Teised reaktiivid olid analüütilise puhtusega ja neid tarnisid kodumaised kaubanduslikud tarnijad.

2.2. Taimne materjal

Prof. Renata Piwowarczyk (Jan Kochanowski ülikool, Kielce, Poola) ja kogutud Poolast looduslikust allikast.

Voucheri isendid (O. Caryophyllaceae – Chomento´wek (50.3349◦N, 20.4000◦E), kserotermiline rohumaa, parasiteerivad Galium boreale, mai 2014; P. Arenaria – Zwierzyniec, lou kesa, parasiteerib Artemisia campestris, juuni 2014;

P. ramosa – Szewce (50.3553◦N, 22.3038◦E), põld, parasiteerib Solanum Lycopersicum, september 2014) on hoiustatud Kielce Jan Kochanowski ülikooli herbaariumis (KTC). Taimne materjal lüofiliseeriti ja peeneks jahvatati enne ekstraheerimist.

2.3. Luuharja ekstraktide valmistamine

Pulbristatud taimne materjal (O. Caryophyllaceae (OC) – 2 g, P. Arenaria (PA) – 3 g ja P. ramosa (PR) – 3 g) ekstraheeriti 80% MeOH-ga temperatuuril 40 ◦C ja rõhul 1500 psi (lahusti rõhk) ) kasutades kiirendatud ASE 200

lahusti ekstraktor (Dionex, Sunnyvale, CA, USA). Ekstraktid aurustati ja külmkuivatati (Gamma 2–16 LSC külmkuivati, Christ, Saksamaa). OC, PA ja PR ekstraheerimise efektiivsus oli vastavalt 55%, 37% ja 43% taimse materjali massist. Suure süsivesikute sisalduse tõttu (andmeid pole näidatud) puhastati toorekstrakte täiendavalt tahkefaasilise ekstraheerimisega (SPE) Oasis HLB mikrokolonnil (500 mg; Waters, Milford, MA, USA). Suhkrud eemaldati 1% MeOH-ga, seejärel elueeriti huvipakkuvad ühendid 80% MeOH-ga. Pärast lahusti eemaldamist OC-, PA- ja PR-ekstraktid lüofiliseeriti (Gamma 2–16 LSC külmkuivati) ning SPE puhastamise saagised olid 53 protsenti (OC), 67 protsenti (PA) ja 51 protsenti (PR). .

2.4. Luuharja ekstraktide fütokeemilised omadused

Broomrape ekstraktide kvalitatiivsed ja kvantitatiivsed analüüsid viidi läbi, kasutades ACQUITY UPLC süsteemi (Waters), mis oli ühendatud fotodioodide massiividetektoriga (PDA) ja tandem-kvadrupool-massispektromeetriga (TQD-MS/MS). Külmkuivatatud OC, PA ja PR ekstraktid lahustati 50 protsendilises metanoolis kontsentratsiooniga 0,50 mg/ml ja seejärel

kromatografeeriti BEH C18 kolonnil (100 × 2,1 mm, 1,7 um, Waters). Kromatograafilised tingimused olid järgmised: ahju temperatuur – 25 ◦C,

lineaarne gradient 10→25 protsenti liikuvast faasist B (0,1 protsenti sipelghapet atsetonitriilis) liikuvas faasis A (0,1 protsenti sipelghapet H2O-s) üle 12 min, voolukiirus – 0,4 mL/min, süstimismaht – 2 μL, UV vahemik – 190–490 nm (eraldusvõime 3,6 nm). MS analüüs viidi läbi negatiivse iooni režiimis elektropihustusionisatsiooniga (ESI), kasutades järgmisi seadistusi: skaneerimisvahemik 100–1200 m/z; kapillaarpinge 2,8 kV; koonuse pinge 35 V;

lähtetemperatuur 150 ◦C; desolvatatsioonitemperatuur 450 ◦C; desolvatsioon

gaasivool 900 l/h ja koonusgaasi vool 100 l/h. Andmete kogumine ja töötlemine viidi läbi tarkvara Waters MassLynx 4.1 abil.

Fenüülpropanoidglükosiidi (PPG) piigid tuvastati saadud LC-MS andmete võrdlemisel varem eraldatud ühendite omadega [8]. PPG-de kvantifitseerimine luude ekstraktides põhines UPLC-UV meetodil tuvastamisega 330 nm juures ja välise standardse kalibreerimisel, kasutadesakteosiid(Sigma-Aldrich, 99 protsenti, HPLC) kui

rühma standard. Lineaarne kalibreerimiskõver koostati kuues kontsentratsioonis vahemikus 1–200 ug/ml ja see näitas head lineaarsust (R2

0.999). Kvantitatiivsed tulemused esindavad kolme süsti keskmist SD väärtust ja neid väljendati milligrammidesakteosiidekvivalendid (ekv) ühe grammi ekstrakti (mgakteosiidekv/g).

2.5. Antiradikaalne toime in vitro

2.5.1. ABTS radikaali püüdmise test

ABTS-i radikaalide vastane test viidi läbi meetodil, mida on kirjeldanud Kontek et al. [9], väikeste muudatustega järgmiselt: reaktiivide (7 mM ABTS ja 4,9 mM kaaliumi per-) valmistamiseks kasutati 20 protsenti MeOH-d.

sulfaat); OC, PA ja PR ekstraktide lahused nelja kontsentratsioonitasemega vahemikus 100–400 ug/mL ja Troloxi lahused kuue kontsentratsioonitasemega vahemikus 10 250 ug/mL valmistati 50 protsenti MeOH. Proovi ja ABTS töölahuse suhe oli 1:25 (maht/maht). Pärast 30-minutilist inkubeerimist mõõdeti neeldumine lainepikkusel 734 nm

pimedas, kasutades UV-vis spektrofotomeetrit (Evolution 260 Bio,

Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA).

Neeldumise inhibeerimine ( protsenti ) arvutati järgmiselt: [(Absecon-

trol–Abssample)/Abscontrol] ×100.

Arvutati luumarja ekstraktide Troloxi ekvivalendid (TE).

kasutades valemit TE=msample/mstandard, kus m on sirge kalle

joonkõverad (neeldumise inhibeerimine vs kontsentratsioon). TE väärtus

proov kirjeldab selle normaliseeritud aktiivsust Troloxi vastu (TEstandard =

1.{1}}). OC, PA ja PR ekstraktide ja Troloxi IC50 väärtused olid

jõudsid katseliselt, siis arvutati nende sirgjoonest

kõverad (neeldumise inhibeerimine vs kontsentratsioon) ja on väljendatud

ug/mL.

Analüüs viidi läbi kolmes eksemplaris ja tulemused on esitatud

keskmistena ± standardhälbed (SD).

2.5.2. DPPH radikaali püüdmise test

DPPH antiradikaalne test viidi läbi meetodil, mida on kirjeldanud Jedrejek et al. [8] ja Brand-Williams et al. [10], väikeste muudatustega järgmiselt: OC, PA ja PR ekstraktide lahused nelja kontsentratsioonitasemega vahemikus 50▽ 250 ug/mL ja Troloxi lahused kuue kontsentratsioonitasemega vahemikus 10▽ 250 ug/ml, valmistati 50% MeOH-ga. Proovi ja DPPH suhe oli 1:19 (maht/maht). Neeldumist lainepikkusel 517 nm mõõdeti pärast 30-minutilist inkubeerimist pimedas, kasutades UV-vis spektrofotomeetrit (Evolution 260 Bio). Absorptsiooni inhibeerimine (protsent) arvutati järgmiselt: [(Absecontroll–Abssample)/Abscontrol] × 100. Katseproovide Troloxi ekvivalendi (TE) ja IC50 väärtused arvutati samamoodi nagu ABTS-testis (punkt 2.5.1). Analüüs viidi läbi kolmes eksemplaris ja tulemused on esitatud kui keskmised ± SD.

2.6. Testitud taimsete ühendite ja ekstraktide põhilahused inimplasma katseteks

Testitud ühendite ja taimeekstraktide põhilahused valmistati 50 protsendilises DMSO-s. DMSO lõppkontsentratsioon testitud proovides oli madalam kui 0,05 protsenti ja selle mõju määrati kõigis katsetes.

2.7. Inimese plasma isoleerimine

Inimveri ehk plasma saadi kuuelt püsidoonorilt (mittesuitsetajad mehed ja naised) verepanka (Lodz, Poola) ja meditsiinikeskusesse (Lodz, Poola). Veri koguti CPD lahusena (tsitraat/fosfaat/dekstroos; 9:1; maht/maht veri/CPD) või CPDA lahus (tsitraat/fosfaat/dekstroos/adeniin; 8,5:1; maht/maht; veri/CPDA). Doonorid ei olnud tarvitanud ravimeid ega sõltuvust tekitavaid aineid (sh tubakat, alkoholi ja antioksüdante) vähemalt kaks nädalat enne annetamist. Meie vereproovide analüüs viidi läbi vastavalt Helsingi inimuuringute deklaratsiooni juhistele ja selle kiitis heaks Lodzi ülikooli inimkatsete uurimise eetika komitee. Plasma valmistati värske inimvere tsentrifuugimisega 4500x g 25 minuti jooksul toatemperatuuril. Valgu kontsentratsioon arvutati testitud proovide neeldumise mõõtmisega 280 nm juures vastavalt Whitakeri ja Granumi protseduurile [11].

2.8. Oksüdatiivse stressi markerid inimese plasmas

2.8.1. Lipiidide peroksüdatsiooni mõõtmine

Plasma lipiidide peroksüdatsioon kvantifitseeriti tiobarbituurhappega reageerivate ainete (TBARS) kontsentratsiooni mõõtmisega. TBARS-i kontsentratsioon arvutati molaarse ekstinktsioonikoefitsiendi (ε=156, 000 M 1 cm 1 ) abil. Meetodit kirjeldatakse põhjalikumalt mujal [12,13]. 2.8.2. Karbonüülrühmade mõõtmine Karbonüülrühmade tase arvutati molaarse ekstinktsioonikoefitsiendi (ε=22, 000 M 1 cm 1 ) abil ja väljendati nmol karbonüülrühmadena plasmavalgu mg kohta vastavalt Bartosz [ 13] ja Levine et al. [14]. 2.8.3. Tioolirühma määramine Plasma valkude tioolirühmade sisaldust mõõdeti spektrofotomeetriliselt, kasutades SPECTROstar Nano Microplate Reader (BMG LABTECH, Saksamaa) neeldumise järgi 412 nm juures 5,5'-ditiool-bis-(2- nitrobensoehappega). Meetodit on täpsemalt kirjeldatud mujal [15–17].

2.9. Hemostaasi parameetrid

2.9.1. Protrombiini aja (PT) mõõtmine

PT määrati koagulomeetriliselt, kasutades optilist koagulatsiooni

Tähed tähistavad Tukey testi tulemusi (p < 0.05), väärtused on samad

täht reas ei erine oluliselt.

2.9.2. Trombiiniaja (TT) mõõtmine

TT määrati koagulomeetriliselt, kasutades optilist koagulatsioonianalüsaatorit (mudel K-3002, Kselmed, Grudziadz, Poola), Malinowska et al. kirjeldatud meetodil. [18].

2.9.3. Aktiveeritud osalise tromboplastiini aja (APTT) mõõtmine

APTT määrati koagulomeetriliselt, kasutades K-3002 optilist koagulatsioonianalüsaatorit (Kselmed, Grudziadz, Poola) vastavalt Mali now ska et al. [18].

2.10. Andmete analüüs Ebakindlate andmete kõrvaldamiseks viidi läbi Q-Dixoni test.

Andmeid testiti normaaljaotuse suhtes Shapiro-Wilki testiga ja dispersiooni võrdsust Levene testiga. Statistiliselt olulised erinevused tuvastati ANOVA abil, millele järgnes Tukey mitme võrdluse test või Kruskal-Wallise test. Võrdlusi peeti oluliseks p < 0,05.="" väärtused="" on="" esitatud="" keskmistena="" ±="">