1. osa: Akteosiid toimib interleukiini vastu

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com

HyangI Lim, 1 Do Kyung Kim, 1 Tae-Hyeon Kim, 1 Kyeong-Rok Kang

Osteoartriit (OA) on kõige levinum degeneratiivne liigesehaigus, millega kaasneb krooniline liigesevalu, mis on põhjustatud sünoviaalliigeste liigesekõhre progresseeruvast degeneratsioonist.Akteosiid, koﬁoüülfenüületanoidglükosiid, omab mitmesuguseid bioloogilisi toimeid, nagu antimikroobne, põletikuvastane, vähivastane, antioksüdatiivne, tsütoprotektiivne ja neuroprotektiivne toime. Lisaks suukaudne manustamineakteosiidsuurtes annustes ei põhjusta genotoksilisust. Seetõttu on käesoleva uuringu eesmärk kontrollida selle antikataboolset toimetakteosiidosteoartriidi ja selle antikataboolse signaaliraja vastu.Akteosiidei vähendanud normaalsete rakkudena kasutatud hiire fibroblasti L929 rakkude ja primaarsete roti kondrotsüütidena kasutatavate rakkude elujõulisust.Akteosiidneutraliseeris IL-1 -indutseeritud proteoglükaanide kadu kondrotsüütides ja liigesekõhredes, pärssides kõhre lagundava ensüümi, nagu maatriksi metalloproteinaas- (MMP-) 13, MMP-1 ja MMP{ ekspressiooni ja aktivatsiooni {6}}. Lisaks pärssis akteosiid põletikuliste vahendajate, nagu indutseeritav lämmastikoksiidi süntaas, tsüklooksügenaas-2, lämmastikoksiid ja prostaglandiin E2, ekspressiooni IL-1-ga töödeldud primaarsetes roti kondrotsüütides. Seejärel vähendas akteosiid põletikku soodustavate tsütokiinide ekspressiooni IL-1-ga töödeldud primaarsetes roti kondrotsüütides. Veelgi enam, akteosiid ei pärssis mitte ainult mitogeen-aktiveeritud proteiinkinaaside fosforüülimist IL-1-ga töödeldud primaarsetes roti kondrotsüütides, vaid ka NFkB translokatsiooni tsütosoolist tuuma, pärssides selle fosforüülimist. Akteosiidi 5 ja 10 mg/kg suukaudne manustamine nõrgendas liigesekõhre progresseeruvat degeneratsiooni osteoartriidi hiiremudelis, mis tekkis mediaalse meniski destabiliseerimisel. Meie leiud näitavad sedaakteosiidon paljutõotav potentsiaalne antikataboolne aine või toidulisand liigesekõhre progresseeruva degeneratsiooni nõrgendamiseks või ärahoidmiseks.

cistanche-acteoside

cistanche-akteosiid

1. Sissejuhatus

Osteoartriit (OA) on kõige levinum degeneratiivne liigesehaigus, millega kaasneb krooniline liigesevalu, mis on põhjustatud sünoviaalliigeste liigesekõhre progresseeruvast degeneratsioonist [1]. Oodatava eluea pikenemise tõttu on liigesekõhre progresseeruvast degeneratsioonist sünoviaalliigeste liigesekõhre progresseeruvast degeneratsioonist põhjustatud OA levimus hinnanguliselt vastavalt 18 protsenti ja 9,6 protsenti meestel [2]. ]. Kuigi OA levimus maailmas suureneb igal aastal, on OA patofüsioloogiline etioloogia endiselt teadmata. Selle põhjuseks võivad olla väga keerulised ja mitmefaktorilised riskitegurid, nagu vananemine, sugu, geneetiline pärand, traumaatiline liigesevigastus ja tugev mehaaniline liigeste koormus. Lisaks ei ole teada neuropatoloogilised seosed liigesekõhre progresseeruva degeneratsiooni ja kroonilise liigesevalu tekke vahel [3]. Seega on OA-ga patsientide kliinilise ravi eesmärk säilitada keha liikuvus ja liigese mehaaniline funktsioon kroonilise liigesevalu leevendamise kaudu, kasutades farmakoloogilisi ja mittefarmakoloogilisi lähenemisviise ning liigeseasendusoperatsioone. Nõudlus pikaajalise bioloogilise ohutusega tõhusa sekkumise või täienduse väljatöötamise järele, et ennetada või leevendada OA-d, et säilitada elukvaliteeti eakate liigese mehaanilise funktsiooni säilitamise kaudu, kasvab.

Nagu on näidatud joonisel 1, on akteosiid (CAS nr 61276-17-3; C29H36O15) kofeoüülfenüületanoidglükosiid, mis on eraldatud mitmest taimsest taimest, nagu Verbascum chlorides [4], Buddleja globosa [5] ja Plantago australis [6]. Akteosiidil on mitmesugused bioloogilised toimed, nagu antimikroobne [5], põletikuvastane [7], vähivastane [8], antioksüdatiivne [9], tsütoprotektiivne [9] ja neuroprotektiivne toime [10]. Lisaks ei põhjusta akteosiidi suukaudne manustamine suurtes annustes genotoksilisust [11].

Seetõttu oletasime, et põletikuvastase bioloogilise ohutusega akteosiidil on antikataboolne toime, mis on seotud liigesekõhre kaitsmisega liigesekõhre progresseeruva degeneratsiooni eest, pärssides kataboolseid tegureid, nagu põletikku tekitavad tsütokiinid, liigesepõletiku põletikulised ensüümid ja liigesekõhrepõletikud. . Seetõttu oli selle uuringu eesmärk uurida akteosiidide indutseeritud antikataboolseid toimeid ja selle rakulist signaaliülekande rada nii in vitro, kasutades primaarseid kondrotsüüte, mis on eraldatud roti põlveliigese liigesekõhrest, kui ka in vivo, kasutades kirurgiliselt genereeritud OA loommudelit. mediaalse meniski destabiliseerimine hiirte põlveliigeses.

cistanche-acteoside

pärit akteosiidcistanche

2. Meetodid

2.1. Rakukultuur. Primaarsed roti kondrotsüüdid eraldati roti (5-päevane; Sprague-Dawley) põlveliigeste liigesekõhrest vastavalt protokollile (CIA-CUC2019-A0027), mille on heaks kiitnud institutsioon. Chosuni ülikooli loomade hooldamise ja kasutamise komitee, Gwangju, Korea Vabariik. Eraldatud primaarseid roti kondrotsüüte hoiti Dulbecco modifitseeritud Eagle'i söötme/toitainete segus F{8}} (DMEM/F12) (Thermo Scientiﬁc, Rockford, IL, USA), millele oli lisatud 10 protsenti veiseloote seerumit (FBS) , Grand Island, NY, USA), antibiootikumid (50 U/mL penitsilliini ja 50 ug/ml streptomütsiini) ja 50 ug/ml askorbiinhapet. Tavaline hiire fibroblasti L-929 rakuliin osteti ettevõttest American Type Culture Collection (ATCC). Vastavalt ATCC juhistele kultiveeriti L-929 rakke Eagle'i minimaalses olulises söötmes, mis sisaldas 10% FBS-i, ja kasvatati niisutatud inkubaatoris 37 kraadi juures 5% CO2-ga.

2.2. Rakkude elujõulisuse test. Dimetüültiasolüüldifenüültetrasooliumsoola (MTT) test viidi läbi, et hinnata normaalse rakuna kasutatud hiire fibroblasti rakuliini L929 rakkude ja akteosiidiga töödeldud primaarsete roti kondrotsüütide elujõulisust. Lühidalt, L929 rakke ja primaarseid roti kondrotsüüte kultiveeriti 24 tundi rakutihedusega 8 × 105 rakku/ml ja seejärel töödeldi 24 tundi 2,5, 5, 10, 25, 50 ja 100 µM akteosiidiga. Pärast MTT lahusega töötlemist kultiveeriti nii L929 rakke kui ka kondrotsüüte veel 4 tundi. Pärast inkubeerimist suspendeeriti moodustunud MTT kristallid täielikult dimetüülsulfoksiidis ja mõõdeti neeldumist 570 nm juures, kasutades rakkude elujõulisuse hindamiseks spektromeetrit (Epoch mikroplaadi spektrofotomeeter, BioTek®, Winooski, VT, USA).

2.3. Elus/surnud rakkude analüüs. Rakkude ellujäämiseks kasutati Cell Live/Dead analüüsikomplekti (Molecular Probes, Carlsbad, CA, USA), mis koosneb rohelisest kaltseiin-AM-ist elusrakkude märgistamiseks (rohelise fluorestsentsiga) ja etiidiumi homodimeerist-1 surnute märgistamiseks. rakud (punase fluorestsentsiga). Lühidalt öeldes kultiveeriti nii L929 rakke kui ka primaarseid roti kondrotsüüte 24 tundi rakutihedusega 8 × 105 rakku/ml (Nunc® Lab-Tek® Chamber Slide™ süsteem; Sigma-Aldrich; Merck KGaA) ja seejärel töödeldi 50 ja 100 µM akteosiidi 24 tundi. Pärast kultiveerimist viidi läbi rakkude ellujäämise test vastavalt tootja juhistele. Seejärel pildistati värvitud rakke fluorestsentsmikroskoobiga (Eclipse TE200; Nikon Instruments, Melville, NY).

2.4. Dimetüülmetüleensinise (DMMB) test. DMMB test viidi läbi, et hinnata proteoglükaanisisalduse muutust primaarsetes roti kondrotsüütides, mida raviti akteosiidiga 21 päeva IL-1 juuresolekul või puudumisel. Primaarsete roti kondrotsüütide omaduste säilitamiseks 21 päeva jooksul suspendeeriti primaarsed roti kondrotsüüdid (2 × 106 rakku) 1 ml 1,2% alginaadis ja seejärel kapseldati raku/alginaadi suspensiooni tilgutamisega 105 mM CaCl2 lahusesse. Alginaadis kapseldatud primaarseid roti kondrotsüüte kultiveeriti 24 tundi DMEM/F12-s (sisaldas 10 protsenti FBS-i, 50 U/mL penitsilliini, 50 ug/ml streptomütsiini ja 50 ug/ml askorbiinhapet) ja seejärel kohandati 24 tundi DMEM/F12-s. miniinsuliin-transferriin-seleen (mini-ITS) ja 50 ug/ml askorbiinhapet. Seejärel töödeldi kondrotsüüte 21 päeva jooksul 50 või 100 µM akteosiidiga 1 ng/ml IL-1 juuresolekul või puudumisel. 21. päeval koguti primaarsed roti kondrotsüüdid proteoglükaani sisalduse hindamiseks, kasutades DMMB testi, nagu eelnevalt kirjeldatud [12]. Lisaks mõõdeti proteoglükaanisisalduse kvantifitseerimiseks raku kohta ja primaarsete roti kondrotsüütide proliferatsiooni hindamiseks rakkude arvu DNA testiga, kasutades PicoGreeni (Molecular Probes, Carlsbad, CA), vastavalt tootja juhistele.

2.5. Roti liigesekõhre kudede ex vivo organkultuur. Liigesekõhre koed eraldati 5-päevaste Sprague-Dawley rottide põlveliigestest ja kultiveeriti seejärel DMEM/F12-s, millele oli lisatud 10 protsenti FBS-i. Järgmiseks liigesekõhre

proove töödeldi 100 µM akteosiidiga10 ng/ml IL-1 olemasolu või puudumine 7 päeva jooksul. Kultiveerimisperioodi lõpus koguti proovid ja fikseeriti histoloogiliseks analüüsiks 4% paraformaldehüüdis 72 tundi.

2.6. Histoloogiline analüüs. Viidi läbi histoloogiline analüüs, kasutades safraniin-O ja kiiret rohelist värvimist, et kontrollida proteoglükaani kadu liigesekõhres, mida töödeldi 100 µM akteosiidiga 10 ng/ml IL-1 juuresolekul või puudumisel 7 päeva jooksul. Lühidalt, fikseeritud liigesekõhre proovid dekaltsifitseeriti etüleendiamiintetraäädikhappes ja sisestati seejärel parafiini. Seejärel lõigati liigesekõhre sisaldavad valmistatud parafiiniplokid järjestikku 5 μm paksusteks viiludeks ja asetati objektiklaasidele. Seejärel viidi läbi safraniin-O ja kiire roheline värvimine, et hinnata proteoglükaani kadu liigesekõhre pinnases. Lisaks viidi läbi hematoksüliini ja eosiini värvimine, et jälgida liigesekõhre üldist morfoloogiat.

2.7. Western Blotting. Kataboolsete tegurite, sealhulgas MMP-13, MMP-1, MMP-3, indutseeritava lämmastikoksiidi süntaasi (iNOS) ja tsüklooksügenaasi-2 (COX) ekspressiooni uurimiseks viidi läbi Western blot meetod. -2) ja raku signaalmolekulide, nagu mitogeen-aktiveeritud proteiinkinaasid ja tuumafaktor-kappa B (NFkB) muutmine. Lühidalt, roti primaarseid kondrotsüüte töödeldi 50 või 100 µM akteosiidiga 10 ng/ml IL-1 juuresolekul või puudumisel 24 tundi. Seejärel koguti roti primaarsed kondrotsüüdid tsentrifuugimisega ja lüüsiti lüüsipuhvriga (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) vastavalt tootja juhistele. Lisaks töödeldi NFkB tuuma translokatsiooni kontrollimiseks roti primaarseid kondrotsüüte 50 või 100 µM akteosiidiga 10 ng/mL IL-1 juuresolekul või puudumisel 24 tundi. Seejärel ekstraheeriti tsütosool- ja tuumafraktsioonid, kasutades NE-PER™ tuuma- ja tsütoplasma ekstraktsioonireagente (Thermo Sciﬁc, Rockford, IL, USA) vastavalt tootja juhistele. Roti primaarsetest kondrotsüütidest ekstraheeritud koguvalgu kontsentratsioon määrati bitsinhoniinhappe valgu analüüsi komplekti (Thermo Scientiﬁc, Rockford, IL, USA) abil vastavalt tootja juhistele. Lisaks koguti konditsioneeritud sööde, et tuvastada kondrotsüütidest sekreteeritud kõhre lagundavate ensüümide taset. Võrdsed kogused valku ja konditsioneeritud söödet elektroforeesiti naatriumdodetsüülsulfaat-polüakrüülamiidi geelelektroforeesil (SDS-PAGE) ja kanti seejärel nitrotselluloosmembraanidele. Seejärel viidi läbi Western blot, kasutades MMP-13, MMP-1, MMP-3, iNOS, COX-2, phosphoERK1/2, total-ERK1 vastaseid primaarseid antikehi. /2, phosphop38, total-p38, fosfor JNK, kogu JNK, fosfoNFkB, kogu NFkB, - aktiin ja lamin B. Immunoreaktiivsed ribad visualiseeriti täiustatud kemoluminestsentssüsteemi abil (Thermo Sci- entific, Rockford, IL, USA) tootja juhistes ja seejärel pildistatakse Microchemi seadmega (DNR Bioimaging Systems, Jeruusalemm, Iisrael).

2.8. Kvantitatiivne polümeraasi ahelreaktsioon (qPCR) ja kvantitatiivne reaalajas PCR (qRT-PCR). Primaarseid roti kondrotsüüte töödeldi 50 või 100 µM akteosiidiga 10 ng/ml IL-1 juuresolekul või puudumisel 24 tundi. Seejärel eraldati kogu RNA primaarsetest roti kondrotsüütidest, kasutades TRIzol reagenti (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) vastavalt tootja juhistele. RNA kogukontsentratsiooni mõõdeti seadmega NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA). cDNA sünteesimiseks pöördtranskribeeriti 1 ug RNA-d, kasutades ThermoScripti pöördtranskriptsiooni-PCR süsteemi (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) vastavalt tootja juhistele. cDNA qPCR viidi läbi, kasutades 2x TOPsimple™ DyeMIX-Taq (Enzynomics, Seoul, Korea Vabariik) ja spetsiifilisi praimereid TaKaRa PCR Thermal Cycler Device'il (TaKaRa Bio Inc., Shiga, Jaapan). Seejärel elektroforeesiti PCR-produkte agaroosgeelil, et määrata sihtgeenide ekspressioonitasemed. Endogeense kontrollina kasutati glütseraldehüüdi 3-fosfaatdehüdrogenaasi (GAPDH). Lisaks amplifitseeriti qRT-PCR jaoks cDNA-d, kasutades Eco™ Real-Time PCR süsteemi (illumine Inc., San Diego, CA, USA). - Endogeense kontrollina kasutati aktiini. qPCR-is ja qRT-PCR-is kasutatud praimerite järjestused on kokku võetud vastavalt tabelites 1 ja 2.

cistanche (akteosiidi) kasulikkus: parandab immuunsust

3. Tulemused

3.1. Akteosiid ei mõjuta L929 rakkude ja roti primaarsete kondrotsüütide elujõulisust. Normaalsete rakkudena kasutatud hiire fibroblasti rakuliini L929 töödeldi 24 tundi 2,5, 5, 10, 25, 50 ja 100 µM akteosiidiga. Seejärel viidi läbi MTT test, et hinnata akteosiidi tsütotoksilisust L929 rakkudel. Nagu on näidatud joonisel 2(a), määrati L929 rakkude suhteline elujõulisus 94:8±8 protsenti, 93:6±7 protsenti, 100±5 protsenti, 103:9±5 protsenti, 126:1±8 protsenti. , ja 122:7±4 protsenti vastavalt 2,5, 5, 10, 25, 50 ja 100 µM akteosiidiga võrreldes kontrollrühmaga (100:02 ± 3 protsenti). Lisaks viidi akteosiidi tsütotoksilisuse kontrollimiseks primaarsetele roti kondrotsüütidele läbi MTT test, nagu on näidatud joonisel 2(b). 2,5, 5, 10, 25, 50 ja 100 µM akteosiidiga töödeldud primaarsete roti kondrotsüütide elujõulisuseks määrati 114 ± 4 protsenti, 117:8 ± 6 protsenti, 123:9 ± 5 protsenti, 132:6 ± 4 protsenti, 153:1±7 protsenti ja 142:1±6 protsenti võrreldes kontrolliga (100:4±5 protsenti). Veelgi enam, et kinnitada akteosiidi mõju nii L929 rakkude kui ka primaarsete roti kondrotsüütide elujõulisusele, viidi läbi Cell Live/Dead test, nagu on näidatud joonisel 2(c). Punase fluorestsentsina värvunud surnud rakkude arv ei suurenenud nii L929 rakkude kui ka primaarsete roti kondrotsüütide puhul, mida töödeldi 50 ja 100 µM akteosiidiga 24 tundi. Need andmed näitasid järjekindlalt, et akteosiidi määratud annus ei mõjutanud L929 rakkude ja primaarsete roti kondrotsüütide elujõulisust. Seega kasutati 50 μM akteosiidi ja 100 μM akteosiidi, mis on mittetoksilised annused nii L929 rakkudes kui ka primaarsetes roti kondrotsüütides, et kontrollida selle antikataboolset toimet in vitro uuringutes, kus kasutati primaarseid roti kondrotsüütides.

3.2. Akteosiid neutraliseerib IL-1 -indutseeritud proteoglükaani kadu roti primaarsetes kondrotsüütides. Alginaathelmestesse sisestatud primaarseid roti kondrotsüüte töödeldi 50 ja 100 µM akteosiidiga 1 ng/ml IL- 1 juuresolekul või puudumisel 21 päeva. Seejärel viidi läbi DMMB test, et hinnata proteoglükaanisisalduse muutusi, nagu on näidatud joonisel 3(a). Proteoglükaani suhteline sisaldus määrati 88:3±18:1 protsenti ja 86:8±16:3 protsenti primaarsetes roti kondrotsüütides, mida raviti vastavalt 50 ja 100 µM akteosiidiga, võrreldes kontrollrühmaga (103:8±16:3). 32:3 protsenti). Kuigi akteosiid vähendas suhtelist proteoglükaanisisaldust, ei olnud need tulemused märkimisväärsed. Siiski vähenes suhteline proteoglükaanisisaldus märkimisväärselt 37:1±14:7 protsenti primaarsetes roti kondrotsüütides, keda raviti 1 ng/mL IL-1-ga, kuid 50 ja 100 µM akteosiidiga vähenes proteoglükaanisisaldus märkimisväärselt 57:12:4 ± 12:4. protsenti ja vastavalt 64 ± 14:5 protsenti 1 ng/mL IL-1 juuresolekul. Seejärel, et kontrollida, kas akteosiid pärsib IL-1 --indutseeritud proteoglükaanide kadu, töödeldi roti põlveliigestest eraldatud liigesekõhre 7 päeva jooksul 100 µM akteosiidiga 10 ng/ml IL{42}} juuresolekul või puudumisel. Seejärel viidi läbi histoloogilised hinnangud, kasutades H&E värvimist ja safraniin-O ja kiiret rohelist värvimist, nagu on näidatud joonisel 3 (b). Morfoloogilist muutust ei täheldatud H&E värvimisega; kuid safraniin-O ja kiire roheline värvimine näitasid, et punase värvina värvitud proteoglükaan ei muutunud 100 μM akteosiidiga töödeldud liigesekõhredes võrreldes kontrollrühmaga. Siiski kutsus 10 ng/mLIL-1 esile tõsise proteoglükaani kadu liigesekõhres ja 100 µM akteosiid pärssis märkimisväärselt proteoglükaani kadu 10 ng/ml IL- 1-ga töödeldud liigesekõhres. Need andmed näitavad järjekindlalt, et akteosiidil on antikataboolne toime, mis pidurdab liigesekõhre degeneratsiooni, takistades IL-1 -indutseeritud proteoglükaanide kadu.

3.3. Akteosiidil on antikataboolne toime, mis pärsib MMP ekspressiooni ja aktivatsiooni IL-1-ga töödeldud primaarsetes roti kondrotsüütides. Et uurida, kas akteosiidist põhjustatud antikataboolne toime on seotud MMP ekspressiooni ja aktivatsiooni pärssimisega, töödeldi primaarseid roti kondrotsüüte 50 ja 100 µM akteosiidiga 10 ng/ml IL-1 juuresolekul või puudumisel 24 tundi. Seejärel uuriti MMP-de muutusi. Nagu on näidatud joonisel 4(a), suurenes kõhre lagundavate ensüümide, nagu MMP-13, MMP-1 ja MMP-3, ekspressioon märkimisväärselt primaarse roti konditsioneeritud söötmes. kondrotsüütides, mida raviti 10 ng/ml IL-1-ga, vähendas akteosiid seda annusest sõltuval viisil. Lisaks näitasid nii qPCR (joonis 4(b)) kui ka qRT-PCR (joonis 4(c)) tulemused, et IL-1 suurendas märkimisväärselt MMP-de, nagu MMP-13, MMP{ mRNA taset. {22}} ja MMP-3 primaarsetes roti kondrotsüütides. Siiski vähenesid need annusest sõltuvalt primaarsetes roti kondrotsüütidestöödeldud 50 ja 100 µM akteosiidiga. Lisaks pärsisid 50 ja 100 µM akteosiid tõhusalt MMP-de aktivatsiooni roti primaarsetes kondrotsüütides, mida raviti 10 ng/mL IL-1-ga (joonis 4(d)). Kokkuvõttes näitavad need andmed järjekindlalt, et akteosiidil on antikataboolne toime, mis pärsib kõhre lagundavate ensüümide ekspressiooni ja aktivatsiooni.

3.4. Akteosiid pärsib IL1 -indutseeritud kataboolsete põletikuliste vahendajate ja põletikku soodustavate tsütokiinide ekspressiooni ja tootmist primaarsetes roti kondrotsüütides. Et teha kindlaks, kas akteosiidil on OA-vastane ennetav toime, töödeldi primaarseid roti kondrotsüüte 50 ja 100 µM akteosiidiga 10 ng/ml IL-1 juuresolekul või puudumisel 24 tundi. Seejärel uuriti muutusi põletikulistes vahendajates, tüüpilistes kataboolsetes tegurites nagu iNOS, COX{8}} ja PGE2. IL-1 suurendas märkimisväärselt iNOS-i, COX{10}} ja PTGS-2 mRNA tasemeid primaarsetes roti kondrotsüütides.

Kuid need vähenesid annusest sõltuvalt akteosiidiga ravitud primaarsetes roti kondrotsüütides (joonis 5 (a)). Lisaks ei pärssis akteosiid mitte ainult iNOS-i ja COX-2 ekspressiooni IL-1-ga töödeldud primaarsetes roti kondrotsüütides (joonis 5(b)), vaid vähendas oluliselt ka NO ja PGE2 suhtelist tootmist, nagu näidatud. vastavalt joonistel 5(c) ja 5(d). Need andmed viitavad sellele, et akteosiid pärsib põletikuliste vahendajate poolt indutseeritud põletikuliste tsütokiinide ekspressiooni, mis toimivad kataboolsete teguritena, kutsudes esile liigesekõhre progresseeruva degeneratsiooni. Seetõttu viidi 10 ng/mL IL- 1-ga töödeldud primaarsetes roti kondrotsüütides põletikku tekitavate tsütokiinide ekspressioonimuutuste uurimiseks 50 µM akteosiidi poolt läbi tsütokiinide massiiv, nagu on näidatud joonisel 6. Akteosiid pärssis tsütokiiniga indutseeritud tsütokiinide ekspressiooni. kemoatraktant- (CINC-) 2, CINC-3, tsiliaarne neurotroofne faktor (CNTF), fraktalkiin (CX3CL1), IL-1, IL- 1, leptiin, monotsüütide kemoatraktantne valk{{22} } (MCP-1), makrofaagide põletikuline valk- (MIP-) 3 ja -närvkasvufaktor (NGF) IL-1-ga ravitud primaarsetes roti kondrotsüütides võrreldes ainult IL-1-ga. Kokkuvõttes näitavad need andmed järjekindlalt, et akteosiid takistab liigesekõhre progresseeruvat degeneratsiooni, pärssides põletikulisi vahendajaid ja põletikku soodustavaid tsütokiine IL-1 --indutseeritud kataboolse toime vastu roti primaarsetes kondrotsüütides.

3.5. Akteosiid pärsib MAPK ja NFkB fosforüülimist primaarsetes roti kondrotsüütides, mida on töödeldud IL-1-ga. Akteosiidide poolt indutseeritud antikataboolse toimega MAPK ja NFkB proinflammatoorsete tsütokiinide IL-1 muutustega seotud rakuliste signaaliradade uurimiseks töödeldi roti primaarseid kondrotsüüte 50 ja 100 µM IL-i {8 akteosiidi juuresolekul või puudumisel. }} 24 tundi. Seejärel ekstraheeriti kogu valk ja elektroforeesiti SDS-PAGE geelil, et teostada Western blot. Nagu on näidatud joonisel 7, fosforüüliti MAPK, nagu ERK1/2, p38 ja JNK, märkimisväärselt IL-1-ga töödeldud roti primaarsetes kondrotsüütides, samas kui 50 ja 100 µM akteosiid ei indutseerinud oluliselt MAPK-i fosforitatsiooni. kontroll primaarses roti kondrotsüütides. 50 ja 100 µM akteosiid aga pärssis annusest sõltuvalt IL-1 --indutseeritud MAPK fosforüülimist primaarsetes roti kondrotsüütides. Lisaks vähendas akteosiid annusest sõltuval viisil järk-järgult NFkB fosforüülimist primaarsetes roti kondrotsüütides, mida raviti 10 ng/ml IL-1-ga. Need andmed näitavad, et MAPK ja NFkB raku signaaliülekanderajad on tihedalt seotud akteosiidide poolt indutseeritud antikataboolse toimega IL-1 vastu primaarsetes roti kondrotsüütides.

3.6. Akteosiid pärsib NFkB translokatsiooni tsütosoolist tuuma, pärssides IL-1 -indutseeritud NFkB fosforüülimist primaarsetes roti kondrotsüütides. Et uurida, kas akteosiid pärsib NFkB translokatsiooni tsütosoolist tuuma, töödeldi primaarseid roti kondrotsüüte 50 ja 100 ug/ml akteosiidiga 10 ng/mL IL-1 juuresolekul või puudumisel. Nagu on näidatud joonisel fig 8(a), siirdus NFkB märkimisväärselt 10 ng/ml IL-1-ga töödeldud primaarsete roti kondrotsüütide tsütosoolist tuuma. Kuid akteosiid inhibeeris seda annusest sõltuval viisil märkimisväärselt. Lisaks, kuigi NFkB tase tõusis 10 ng/ml IL-1-ga töödeldud primaarsetest roti kondrotsüütidest ekstraheeritud tuumafraktsioonis, langes akteosiid seda annusest sõltuvalt, nagu on näidatud joonisel 8(b). NFkB tase langes 10 ng/ml IL-1-ga töödeldud primaarsetest roti kondrotsüütidest ekstraheeritud tsütosoolfraktsioonis, kuid akteosiidi toimel suurenes see annusest sõltuvalt. Kokkuvõttes näitavad need andmed järjekindlalt, et akteosiididest indutseeritud antikataboolsed toimed IL-1 vastu on seotud tsütosoolist tuuma translokatsiooni pärssimisega NFkB signaaliraja moduleerimisel roti primaarsetes kondrotsüütides.

3.7. Akteosiid nõrgendab liigesekõhre progresseeruvat degeneratsiooni kirurgilise DMM-indutseeritud põlveliigese OA loomadel. Et selgitada in vivo akteosiidist põhjustatud antikataboolseid toimeid, manustati BALB/c hiirte põlveliigesele tehtud kirurgilise DMM-iga genereeritud OA-indutseeritud loomadele suukaudselt 5 ja 10mg/kg akteosiidi lahustatuna 5% etanoolis. igal teisel päeval 8 nädala jooksul. Seejärel hinnati põlveliigeseid histoloogiliselt, kasutades safraniin-O ja kiiret rohelist värvimist, nagu on näidatud joonisel 9. Proteoglükaani kadu ja liigesekõhre pinna vigastus suurenes märkimisväärselt DMM-i indutseeritud OA loomadelt eraldatud põlveliigeses. Kuid akteosiidi suukaudne manustamine pärssis proteoglükaani kadu ja vähem liigesekõhre vigastusi võrreldes ainult kandjaga. Lisaks suurenes Mankini hindamisskoor märkimisväärselt ainult OA loomade rühmas (n =5, 3± 0:7), kellele manustati ainult vehiikulit, võrreldes Naive'iga (n =5, 0). :67 ± 0:5). Kuid 5 ja 10mg/kg akteosiidi suukaudne manustamine OA loomade rühmale (n =5) vähendas Mankini hindamisskoori 2±0:7 ja 1:67±0:5 võrra. , võrreldes ainult sõidukiga. Kokkuvõttes näitavad need andmed, et akteosiidi suukaudne manustamine nõrgendab liigesekõhre progresseeruvat degeneratsiooni kataboolsete seisunditega sünoviaalsetes liigestes.