Käesolevas uuringus galaktaan-eksopolüsahhariid (EPS) alatesCistancheKR780676 hinnati selle potentsiaali poolestleevendada oksüdatiivset stressikasutades in vitro teste ja in vivo uuringuid, saccharomyces cerevisiae (metsikut tüüpi) ja selleantioksüdant(sod14, sod24, tsa14, cta2 ja ctt12)anti-apoptootiline(pep4 ja fs14) jaVananemisvastane(sod24, tsa1 ja ctt12)) isogeensed geenideletsiooni mutandid. Galaktaanil oli tugev DPPH jalämmastikoksiidi eemaldamise aktiivsuslCso väärtusega vastavalt 450 ja 138 ug/mL. Pärmi mutandi mudelis eemaldati H,0 poolt tekitatud oksüdatiivne stress ulatuslikult söötmes oleva galaktaaniga, mida kinnitasid punktanalüüsid, millele järgnes fluorestseeruv DCF-DA värvimine ja mikroskoopilised uuringud. Galaktaaniga töötlemine vähendas pärmi mutantsetes rakkudes tekkinud ROS-i, mida näitas fluorestsentsi intensiivsuse vähenemine. Lisaks näitas galaktaan kaitset oksüdatiivsete kahjustuste eest pärmi mutantsete tüvede (pep4 ja fs1) ​​H, O-indutseeritud apoptoosi inhibeerimise kaudu, mis viis oksüdatiivse stressi neutraliseerimise teel elulemuse suurenemiseni. Kronoloogilises eluea testis näitas galaktaan-EPS-iga töödeldud WT-rakkude elujõulisuse tõusu 8 protsenti, samal ajal kui sod2 mutandil suurenes 10-15 protsenti, mis viitab märgatavale vananemisvastasele toimele. W. confuse KR780676 galaktaanil on tohutu potentsiaal kasutada loodusliku antioksüdandina nutratseutilistes, farmaatsia- ja toiduainetehnoloogilistes rakendustes. Meie teadmiste kohaselt on see esimene aruanne abakteriaalse EPS-i in vivo antioksüdantsete omaduste põhjaliku hindamise kohta pärmi deletsioonimudeli süsteemis.

Klõpsake, et saada Cistanche EPS-i rikkaks

Oksüdatsioon on oluline protsess bioloogiliste protsesside säilitamiseks ja ka energia tootmiseks kõigis elusorganismides. Reaktiivsete hapnikuliikide (ROS) ja reaktiivsete lämmastikuliikide (RNS) radikaalid tekivad vastavalt hapniku ja lämmastiku molekulide normaalsest katabolismist. Tõsine oksüdatiivne stress põhjustab mitmesuguseid degeneratiivseid seisundeid, nagu DNA kahjustus, raku degeneratsioon ja kantserogenees. Need võivad põhjustada paljusid tervisekahjustusi, näiteksvananemine, südame-veresoonkonna haigused, vähk, tsirroos, ateroskleroos, diabeetja reumatoidartriit2-6, antioksüdandid on molekulid, mis püüavad kinni toidus või elussüsteemis tekkinud vabu radikaale ning aitavad ära hoida oksüdatiivsete kahjustustega seotud terviseseisundeid-9. Kuigi tugevate radikaalide püüdjatena on saadaval palju sünteetilisi antioksüdante, on mõned neist seotud mõningate soovimatute kõrvalmõjudega. Seda silmas pidades on toidu- ja farmaatsiatööstuses suurenenud huvi ja nõudlus looduslike antioksüdantide järele. Enamikku taime- ja seenepõhistest polüsahhariididest on teatatud oluliste kaitseainetena ROS11–21 vastu. Samuti on teatatud mitmesugustest mikroobsetest eksopolüsahhariididest (EPS), sealhulgas piimhappebakteritest (LAB), nende oluliste antioksüdantsete omaduste tõttu. Neid peetakse sünteetiliste alternatiivide jaoks ohutumaks. Viimastel aastatel on uuritud paljusid LAB-i EPS-e nende antioksüdantse potentsiaali ja oksüdatiivsete kahjustuste vältimise osas22,23. Weissella EPS-i antioksüdantset potentsiaali ja kaitsvat rolli on teatatud ka mitmesugustest Weissellast eraldatud EPS-idest, nagu Cistanche EPSWWC, W. confusa OF126, W. cibaria GA44, W. cibaria YB-1, W. confusa W4 ja W. cibaria SJ1424–29. In vivo antioksüdantseid omadusi saab uurida, kasutades erinevaid mudelsüsteeme, nagu rakuliinid30, C. elegans31, pärm32 ja hiired33. Varem on erinevaid ühendeid sõelutud nende potentsiaalsete antioksüdantsete omaduste suhtes, kasutades Saccharomyces cerevisiae pärmi geenide deletsiooni mutantide mudelisüsteemi 32, 34–37.

See uuring keskendubgalaktaan-EPS antioksüdantne potentsiaaltoodetud probiootilise tüve Cistanche KR780676 poolt India traditsioonilisest kääritatud toidust (Idli tainas)38,39. Selles artiklis skriinitakse galaktaan-EPS-i in vitro antioksüdantide potentsiaali suhtes, kasutades DPPH, lämmastikoksiidi ja hüdroksüülradikaalide eemaldamise teste ning in vivo antioksüdanti,anti-apoptootilinejavananemisvastased omadusedkasutades pärmi geenide deletsiooni mutantide mudelisüsteemi.

materjalid ja meetodid

Kõik kemikaalid, sealhulgas söötmelisandid, hangiti ettevõttelt Hi-Media Laboratories Pvt. Ltd., India ja DCF-DA (2,7-diklorodihüdrofluorestseiini diatsetaat) firmalt Sigma.

Mikroobikultuur.CistancheSelles uuringus kasutati India happelisest fermenteeritud toidust (Idli taignast) eraldatud KR780676, mis toodab galaktaani EPS-i.

EPS-i tootmise tuvastamine. W. confusa EPS-i tootmist täheldati koloonia tasandil. Lühidalt öeldes kultiveeriti tüve MRS-agaril (täiendatud 2% sahharoosiga). 48 tunni pärast 30 kraadi juures täheldati limasete/limaskeste kolooniate ilmumist. Galaktaani EPS tootmist kontrolliti täiendavalt skaneeriva elektronmikroskoopia (SEM) analüüsiga.

EPS-i ekstraheerimine. EPS-i ekstraheerimisprotsess viidi läbi vastavalt meetodile, mida on kirjeldanud Kavitake et al.38. Värske W. confusa inokulaat (10 protsenti) lisati 2-protsendilisele sahharoosiga tugevdatud MRS söötmele temperatuuril 30 kraadi 48 tunniks staatilistes tingimustes. Suspensiooni tsentrifuugiti sel viisil (12,000 x g 15 minutit), et eraldada biomass, ja täiendavalt töödeldi valguosade eemaldamiseks triklorohappehappega. Galaktaan-EPS sadestati jääkülma etanooliga (kolmekordne maht), tsentrifuugiti (19 200 x g 15 minutit) ja saadud EPS lahustati Milli-Q vees. Toor-EPS dialüüsiti 12–14 kDa (48 tundi, 4 kraadi) juures ja külmkuivatati lüofiliseerimisega 48 tundi.

Galaktaani EPS in vitro antioksüdantsed omadused. Galaktaani DPPH test viidi läbi vastavalt Ye et al.9 varasemale aruandele ja eemaldamisaktiivsuse protsent (protsent) arvutati järgmise võrrandi abil.

kus Ao ja As on vastavalt kontrolli (pime, ilma EPS-ita) ja proovi neeldumine. Galaktaani lämmastikoksiidi (NO) radikaali püüdmise test viidi läbi vastavalt Sreejayani jt 40 järgi ja arvutati järgmise võrrandi järgi:

kus Ao on kontrolli neeldumine (tühi, ilma EPS-ita) ja As on neelduvus EPS-i juuresolekul. Galaktaani EPS-i puhul mõõdeti vähendavat võimsust, nagu on teatanud Ye et al.9. Neelduvus loeti 700 nm juures ja taandavat potentsiaali näitab reaktsioonisegu kõrge neeldumisvõime. Positiivse kontrollina kasutati askorbiinhapet (Vc). Galaktaani EPS hüdroksüülradikaale püüdvat aktiivsust hinnati nii, nagu on kirjeldanud Yang et al.41. Neelduvus loeti 536 nm juures ja puhastusprotsent arvutati järgmiselt:

kus A proov on proovi neelduvus, pimekatse on neelduvus proovi ja H2O2 lahuse puudumisel ning kontroll A on neelduvus proovi puudumisel

Galaktaani EPS in vivo antioksüdantsed omadused pärmi mutantsete tüvede puhul.

Pärmi, S. cerevisiae, BY4741 metsiktüüpi (WT) (MATa his3∆:leu2∆:met15∆:ura3∆) ja geenideletsiooni mutanttüved hangiti firmast Thermo Fisher Scientific, USA. Mutantide valimiseks kasvatati pärmitüvesid pärmi peptoondekstroosi (YPD) söötmes, millele oli lisatud 200 µg/ml genetitsiini (G418 sulfaat) või ilma. YPD tahke sööde valmistati 2% Bacto agari lisamisega YPD vedelale söötmele42.

EPS-i mõju pärmi kasvule. Eksponentsiaalselt kasvavat metsiktüüpi (WT) pärmikultuuri (ligikaudu 1 × 104 rakku) töödeldi mikrosüvendi plaadil erinevate kontsentratsioonidega (0–400 ug/ml) EPS-iga ja lõppmaht viidi 200-ni. μL YPD puljongiga. Kultuuri inkubeeriti 18 tundi 30 kraadi juures, millele järgnes seerialahjendus ja levitamine YPD agarplaatidele. Plaate inkubeeriti 30 kraadi juures 2 päeva ja loendati kolooniaid moodustavad ühikud (CFU) ning elujõulisust väljendati protsentides CFU43.

Oksüdatiivse stressi biomarkerite mõõtmine. Eksponentsiaalselt kasvavaid pärmi WT rakke töödeldi 2 tundi 300 ug/ml EPS-ga või ilma. Kümme rakke eksponeeriti 1 mM H2O2-ga 1 tund 30 kraadi juures loksutisinkubaatoris ja töödeldi SOD aktiivsuse ja lipiidide peroksüdatsioonitasemete mõõtmiseks varasemates aruannetes kirjeldatud meetodil 44–46.

EPS-i antioksüdantne omadus S. cerevisiae geenideletsiooni mutantides.

Eksponentsiaalselt kasvavaid pärmi WT ja antioksüdandipuudulike mutanttüvede (sod1∆, sod2∆, tsa1∆, cta1∆, ctt1∆, glr1∆ ja yhb1∆) kultuure töödeldi 300 ug/mL EPS-ga, millele järgnes EPS. 1 mM H2O2 1 tund. Seeriaviisiliselt lahjendatud rakud jaotati YPD agarplaatidele, inkubeeriti 2 päeva 30 °C juures ja arvutati elujõulisus. Punktanalüüsi jaoks lahjendati kultuure seeriaviisiliselt 10-voltides, millest 4 μL märgiti YPD agarplaatidele ja inkubeeriti 30 kraadi juures 2 päeva ning pildistati43,47. ROS-i tuvastamine ja mõõtmine. Eksponentsiaalselt kasvavaid WT- ja antioksüdandipuudulikke mutantseid tüvesid (sod1∆, sod2∆, tsa1∆, cta1∆ ja ctt1∆) töödeldi eelnevalt EPS-iga või ilma EPS-iga 2 tundi ja eksponeeriti 1 mM H2O2-ga 1 tund 30 kraadi juures. Rakupelleteid pärast tsentrifuugimist kiirusel 5000 pööret minutis 5 minutit pesti kaks korda PBS puhvriga, suspendeeriti uuesti 200 µL PBS-is ja inkubeeriti 20 µM DCF-DA-ga pimedas 15–20 minutit toatemperatuuril. Vahetult pärast inkubeerimist pesti rakke kaks korda PBS-ga, paigaldati slaididele ja vaadeldi Olympus Ix71 fluorestsentsmikroskoobi all 40x objektiivi all, kasutades sinist filtrit. ROS-i kvantifitseerimiseks resuspendeeriti DCF DA värvitud rakud pärast pesemist 200 µl PBS-is ja DCF fluorestsentsi intensiivsust mõõdeti spektrofluoromeetriga ergastuse maksimumi ja emissiooni lainepikkustel 495/529 nm. Fluorestsentsühikud joonistati iga töödeldud ja töötlemata kultuuri suhtes ja võrreldi 48, 49.

Galaktaani anti-apoptootiline toime.

Punkt- ja CFU-testid. Eksponentsiaalselt kasvanud WT ja anti-apop tootilise puudulikkusega mutantseid (pep4∆ ja fs1∆) rakke töödeldi eelnevalt EPS-ga ja inkubeeriti koos vastavate töötlemata kontrollidega 2 tundi. CFU loendamiseks töödeldi kultuure EPS-ga või ei töödeldi neid 2 tundi ja inkubeeriti 0,5 mM H2O2-ga 1 tund. Iga seeriaviisiliselt lahjendatud kultuur kanti YPD agarplaatidele ja inkubeeriti 30 kraadi juures 2 päeva ning rakkude elujõulisust väljendati protsentides CFU. Punktanalüüsi jaoks lubati kultuure seeriaviisiliselt lahjendada, millele järgnes määrimine YPD agarplaatidele 1 mM H202-ga või ilma. Plaate inkubeeriti 30 kraadi juures 2 päeva ja pildistati47.

EPS-i apoptootilise markeri tuvastamine

kasutades pärmi mutantseid tüvesid. Et täiendavalt kinnitada EPS-i päästvat toimet pärmirakkudele pärmis vesinikperoksiidi poolt indutseeritud apoptootilise rakusurma eest, uuriti apoptoosimarkerite suhtes WT ja anti-apoptootilise puudulikkusega mutanttüvesid (pep4∆ ja fs1∆). Eksponentsiaalselt kasvavaid WT, pep4∆ ja fs1∆ rakke töödeldi või ei töödeldi 300 µg/ml EPS-ga 2 tundi ja seejärel eksponeeriti 1 tund 1 mM H2O2-ga. Nii töödeldud kui ka töötlemata rakud värviti akridiinoranži ja etiidiumbromiidiga (AO / EB) ning vaadeldi fluorestsentsmikroskoobi all kromatiini kondenseerumist50, 51. DAPI värvimiseks fikseeriti töödeldud ja töötlemata rakud 4% paraformaldehüüdiga ja inkubeeriti 1 ug/ml DAPI-ga 5–10 minutit pimedas toatemperatuuril. Rakud paigaldati slaididele pärast PBS-iga pesemist ja neid vaadeldi Olympus IX71 fluorestsentsmikroskoobiga (UV-filter, 40-kordne objektiiv) tuuma fragmenteerumise suhtes52,53.

EPS-i vananemisvastane toime kronoloogilise eluea testiga.

Pärmi metsiktüüpi ja antioksüdandipuudulikke mutantseid (sod2∆, tsa1∆ ja ctt1∆) kultuure kasvatati statsionaarse faasi saavutamiseks ja inkubeeriti koos EPS-iga või ilma kronoloogilise eluea (CLS) analüüsi jaoks. Iga tüve ellujäämine arvutati erinevate ajavahemike järel 0 kuni 30 päeva. Rakkude elujõulisust väljendati CFU protsentides nii töödeldud kui ka töötlemata kultuuride puhul54,55. Statistiline analüüs. Kõik katsed viidi läbi kolmes korduses (± SD) ja neid analüüsiti statistiliselt, kasutades IBM SPSS 20 tarkvara ühesuunalises ANOVA mudelis. Tukey HSD võrdlustest (lk<0.05) was used to measure the significance level. 

Tulemused ja arutelu Kääritatud toiduainetest eraldatud piimhappebakterid (LAB) on viimastel aastatel pälvinud toidutehnoloogide tohutut tähelepanu nende tõestatud probiootiliste omaduste tõttu. India kääritatud toiduainetest eraldatud bakterite hulgas on Lactobacillus spp., Lactococcus spp., Leuconostoc spp. ja mida vähem uuritud Weisella spp. Nagu teisedki kasulikud LAB-id, on meie laboris kääritatud idli-taignast eraldatud Cistanche tüvi KR780676 teatatud potentsiaalse probiootikumikandidaadina39. Varasemates aruannetes on seda galaktaani iseloomustatud kui lineaarset homopolüsahhariidi ning samuti on seda uuritud selle füüsikalis-keemiliste, funktsionaalsete ja emulgeerivate omaduste suhtes 38, 56–58. Samuti oleme teatanud, et W. confusa KR780676 rakkudel ja rakkude supernatantidel oli tugev antioksüdantne toime39. W. confusa KR780676 EPS-i tootmist täheldati 2-protsendilise sahharoosiga rikastatud MRS-agarplaadil, inkubeeriti 48 tundi (joonis 1A-i), mis näitas Weissella limaseid kolooniaid ja seda kinnitati täiendavalt SEM-pildil (Weissella kolooniast) näitab galaktaan-EPS-i olemasolu koos rakkudega (joonis 1A-ii). Samm-sammult EPS-i tootmine on esitatud joonisel 1B oleva pildilise kujutisega.

Galaktaani EPS in vitro antioksüdantsed omadused. Nagu on näidatud joonisel fig 2A, on DPPH eemaldamisaktiivsus kontsentratsioonist sõltuv, eemaldamisaktiivsus suurenes galaktaani kontsentratsiooniga. Askorbiinhappe poolmaksimaalne efektiivne kontsentratsioon (IC50) oli 8,8 µg/ml, samas kui galaktaan EPS oli 450 µg/ml. 1,1-difenüül-2-pikrüülhüdrasüül (DPPH) on stabiilne vaba radikaal, mis delokaliseerib paardumata elektronid molekuli kui terviku vastu, takistades seega molekulide dimeriseerumist ja tulemuseks on sügavvioletne värv59. Kui DPPH lahust lisatakse erinevatele galaktaani kontsentratsioonidele (50 kuni 500 µg/mL), põhjustab see kontsentratsiooni suurenedes violetse värvuse vähenemist. Antioksüdandid, reageerides DPPH elektroniga, muutub DPPH sügavvioletne värvus helelillaks; ja värvi intensiivsus sõltub substraadi antioksüdantsest aktiivsusest60. Galaktaanil oli 60-protsendiline DPPH eemaldamise potentsiaal, mis on suurem kui endofüütilise bakteri Paenibacillus polymyxa EJS EPS-l-3 (<45.40%)33.

Lämmastikoksiid tekib naatriumnitroprussiidi lagunemisel vesilahuses pH väärtusel 7,2. Nitraat ja nitrit tekivad aeroobsetes tingimustes, kui lämmastikoksiid seondub hapnikuga61. Nagu on näidatud joonisel 2B, on galaktaanil potentsiaal vähendada lämmastikoksiidi teket naatriumnitroprussiidist, kuna poolmaksimaalsest efektiivsest kontsentratsioonist (IC50) on 138 µg/mL, samas kui standardne askorbiinhape oli 11 µg/ml. Nagu on näidatud joonisel 2C, on EPS-i vähendav võimsus positiivses korrelatsioonis selle kontsentratsiooniga suurenevas järjekorras. Standard (askorbiinhape) näitas suuremat redutseerimisvõimet kui galaktaan EPS, mis oli kooskõlas Ye et al.9. Galaktaani vähendav toime näitab potentsiaalset antioksüdantset aktiivsust. Kui galaktaan-EPS-i lisatakse kaaliumferritsüaniidi [K3Fe (CN)6], redutseeritakse selles sisalduvad antioksüdandid kaaliumferritsüaniidiks [K4Fe(CN)6]

Joonis 2. Galaktaani in vitro antioksüdantsed omadused. (A) DPPH radikaale püüdev aktiivsus, (B) lämmastikoksiidi test, (C) redutseeriva võimsuse test ja (D) galaktaan-EPS hüdroksüülradikaale püüdev aktiivsus.

Galaktaani hüdroksüülradikaale püüdev aktiivsus on näidatud joonisel 2D. Galaktaan näitas kõrgeima aktiivsusena 41,93 protsenti, samas kui standardi järgi sama kontsentratsiooni (1 mg/ml) puhul 58,10 protsenti. Tulemuste suundumus on kooskõlas varasemate aruannetega Lactobacillus plantarum C88 (85,21 protsenti EPS-i kontsentratsiooniga 4 mg/ml)62 ja Paenibacillus polymyxa EJS-3 (68,55 protsenti EPS-i kontsentratsiooniga 1 mg/ml)63. Võrreldes standarditega näitas galaktaan 72,16-protsendilist efektiivsust, samas kui Lactobacillus plantarum C8862 ja Paenibacillus polymyxa EJS{19}} EPS-i efektiivsus oli vastavalt 95,19 ja 68,55 protsenti.

Galaktaani EPS in vivo antioksüdantsed omadused pärmimudelis. Varasemad aruanded on näidanud LAB64-st tuletatud EPS-i erinevaid tervist edendavaid bioloogilisi omadusi, nagu antiproliferatiivne, haavandivastane, kolesteroolitaset alandav, antioksüdantne, põletikuvastane ja immunomoduleeriv toime. Selles vaates on oluline hinnata EPS-i üksikasjalikku antioksüdantset toimet, mis võiks toetada nende prebiootilist ja/või probiootilist potentsiaali, peamiselt soolestiku homöostaasi säilitamiseks oksüdatiivse stressi leevendamise kaudu. Raku antioksüdantide mehhanism mängib olulist rolli vältimatu ROS-i leevendamisel, mis tekib oluliste raku metaboolsete radade kaudu. Tasakaalustamatus raku kaasasündinud antioksüdantide kaitse ja tekitatud ROS vahel võib olla rakkudele väga kahjulik. Tõsine oksüdatiivne stress põhjustab potentsiaalset kahjustust raku elutähtsatele komponentidele, valkudele, nukleiinhapetele ja lipiidimolekulidele, mis omakorda mõjutab paljusid olulisi signalisatsiooniteid ja kutsub esile apoptoosi. On näidatud, et antioksüdantide tarbimine toiduga vähendab rakukahjustuse markerite, nagu ROS-i tasemed, ROS-vahendatud DNA kahjustused, apoptoos ja raku transformatsioon, esinemissagedust, mis vähendab veelgi vanusega seotud häirete esinemissagedust65 Mikroobsed EPS-id, nagu ksantaan ja levanid. on näidanud antioksüdantset toimet vastavalt in vitro testides (DPPH ja hüdroksüülradikaali testid)5 ja inimese maovähirakkude BGC-823 vastu66. Eelnevalt hindasime selles uuringus W. confusa KR780676-st eraldatud galaktaan-EPSi antioksüdantset, antiapoptootilist ja vananemisvastast toimet, kasutades mudelorganismina pärmi Saccharomyces cerevisiae BY4741.

EPS-i mõju pärmi kasvule. Erinevate EPS-i kontsentratsioonidega töödeldud metsiktüüpi pärmirakkudel ei ilmnenud kasvudefekte, mis kinnitavad, et galaktaan ei põhjustanud tsütotoksilisust ega kasvuhäireid ühelgi kontsentratsioonil vahemikus 0 kuni 400 ug/ml (joonis 3A). ). Rakud, mida töödeldi 300 ug/ml või suurema galaktaani kontsentratsiooniga, näitasid oluliselt suuremat kasvu, mis näitab, et galaktaanil oli pärmi kasvu stimuleeriv toime.

Järgmistes pärmitüvedega katsetes kasutatakse galaktaani kontsentratsiooni 300 ug/ml. Galaktaan vähendab SOD ensüümi aktiivsust. Pärast galaktaan-EPS-i tugevat in vitro antioksüdantset aktiivsust kontrolliti selle mõju SOD aktiivsusele pärmi WT-rakkudes. Meie tulemused (joonis 3B) näitavad, et H2O2-ga töötlemisest põhjustatud oksüdatiivne stress põhjustas H2O2--ga töödeldud WT-rakkude SOD aktiivsuse järsu tõusu võrreldes töötlemata rakkudega. Seevastu WT-rakkude eeltöötlemine galaktaaniga, millele järgnes kokkupuude H2O2-ga, vähendas SOD aktiivsust umbes kaks korda võrreldes ainult H2O2-ga töödeldud rakkude omaga, mis näitab, et galaktaan aitab pärmirakkudel toime tulla superoksiidi radikaalidest põhjustatud oksüdatiivse toimega. stress47,67.

Oksüdatiivne stressperoksiidtöötlusega indutseeritud aktiveerib superoksiidi ensüümi ja SOD aktiivsuse taseme muutus on raku oksüdatiivse stressi taseme otsene mõõt. Selles uuringus kasutati NBT redutseerimismeetodit, kus NBT on superoksiidi radikaali tootmise indikaator. NBT redutseerimise pärssimine on SOD otsene mõõt. Kuna SOD konkureerib NBT-ga superoksiidi radikaalide pärast, mis tekivad riboflaviini eksponeerimisel nähtavale valgusele hapniku ja metioniini juuresolekul, mis on elektronidoonor. Superoksiid redutseerib NBT sinise värvi produktiks, formazaniks, mida saab kolorimeetriliselt mõõta 560 nm juures.

Varasemad aruanded näitavad, et LAB EPS on in vitro testides ning käärsoolevähi rakuliinides ja in vivo mudelites avaldanud kontsentratsioonist sõltuval viisil antioksüdantset toimet. EPS-i võime ROS-i eemaldada võib olla tingitud nende erinevatest keemilistest rühmadest68. On näidatud, et teised Bacillus amyl liquefacientist pärinevad EPS-id (500 µg/ml) mõjutavad oluliselt SOD aktiivsust ja kaitsevad HepG2 rakke H2O2 68 poolt indutseeritud oksüdatiivse stressi eest. Sarnaselt näitas L. plantarum'i EPS kontsentratsioonist sõltuvat mõju SOD aktiivsusele Caco2 rakkudes H2O2--indutseeritud oksüdatiivse stressi vastu69. Meie tulemused, mis on kooskõlas nende aruannetega, näitavad, et galaktaan-EPS-i eeltöötlus hävitab H2O2-ga töötlemise indutseeritud superoksiidi radikaalid pärmi WT-rakkudes.

EPS vähendab rakkude lipiidide peroksüdatsiooni. Malondialdehüüd (MDA) on enim uuritud raku lipiidide peroksüdatsiooni biomarker, mis näitab oksüdatiivse stressi taset. MDA on keemiliselt stabiilne, väga reaktiivne dialdehüüd ja võib kergesti seonduda valkude, nukleiinhapete ja lipoproteiinidega. See on väga mutageenne ja võib oluliselt mõjutada nende biomolekulide biokeemilisi omadusi, mis on kahjulik erinevatele signaaliradadele70. MDA taseme tõus on ROS-i indutseeritud koekahjustuse näitaja ja selle suurenenud taset tuvastatakse mitme inimese patoloogia puhul46. Selles uuringus hinnati MDA tasemeid, et uurida, kuidas EPS-i eeltöötlus mõjutab H2O2 poolt põhjustatud lipiidide peroksüdatsiooni pärmi WT-rakkudes. Tulemused näitasid EPS-iga eeltöödeldud rakkude MDA taseme umbes 15--kordset vähenemist, võrreldes nendega, mis olid eksponeeritud ainult H2O2-ga, nagu on näidatud joonisel 3C.

Varem on näidatud, et L. plantarum C88 EPS vähendab H2O2-ga töötlemisest põhjustatud MDA taset annusest sõltuval viisil (50–200 ug/ml) Caco2 rakkudes, mis näitab, et peroksiidist põhjustatud soolerakkude membraanikahjustus saab leevendada EPS69 lisamisega (zhang 2013). Lisaks vähendas 500 ug/ml B. amyloliquefaciens'i EPS oluliselt H2O2-indutseeritud MDA-d HepG2 rakkudes71. Meie tulemused H2O2-indutseeritud MDA taseme kohta pärmirakkudes ja selle olulise vähenemise kohta pärast rakkude eeltöötlemist galaktaan-EPS-iga näitavad, et töötlemine galaktaan-EPS-iga vähendab raku ROS-indutseeritud lipiidide peroksüdatsiooni ja võib omakorda kaitsta rakud peroksiidradikaalide põhjustatud koekahjustuste eest ja aitavad säilitada raku terviklikkust

katsed. * esindab P<0.0001 a signifcant increase/decrease in EPS+ H2O2 treated samples compared to those treated with H2O2 alone.

Galaktaan kaitseb pärmi antioksüdantsete geenide mutante oksüdatiivse stressi all. Galaktaani antioksüdantse võime hindamiseks töödeldi erinevaid antioksüdantsete geenidefitsiitsete pärmseente mutante (millel puuduvad erinevad oksüdatiivse stressi vastuse geenid) galaktaaniga ja seejärel eksponeeriti neid subletaalsele H2O2 42 annusele. SOD (sod1∆ ja sod2∆), katalaasi (cta1∆ ja ctt1∆), tioredoksiinperoksüdaas (tsa1∆), glutatioonreduktaas (glr1∆) ja lämmastikoksiidi oksidoreduktaasi (yhb1∆) mutandid, kui neid töödeldakse H2O2-ga. näitas madalat elulemust (sod1∆ 10,8 protsenti , sod2∆ 13,17 protsenti , tsa1∆ 13,55 protsenti , cta1∆ 15,34 protsenti , ctt1∆ 17,06 protsenti , glr1∆ 27,37 protsenti vastu W.7.318 protsenti ja yhb∆ 3,7 protsenti. Seevastu galaktaani eeltöötlusega suurenes tolerantsus oksüdatiivse stressi suhtes kõigil antioksüdantgeenide puudulikkusega mutantidel ja nende elujõulisus suurenes oluliselt (sod1∆ 78,43 protsenti, sod2∆ 59,96 protsenti, cta1∆ 87 protsenti, ctt1∆ 817 protsenti ∆ 72,73 protsenti, glr1∆ 75,26 protsenti ja yhb1∆ 82,41 protsenti), nagu on näidatud joonisel 4A. Need tulemused viitavad sellele, et galaktaan suudab tõhusalt eemaldada H2O2 poolt indutseeritud vabu radikaale mutantidel, millel puuduvad spetsiifilised oksüdatiivse stressi vastuse geenid, ja kaitseb rakke oksüdatiivse stressi eest. Sarnast kaitset täheldati punktanalüüsis, kus galaktaan päästis mutandid oksüdatiivse stressi eest ja suurendas elujõulisust, nagu on näidatud joonisel 4B.

Rakud arendatakse koos ensümaatiliste antioksüdantsete kaitsesüsteemidega, et taluda endogeenset oksüdatiivset stressi, mida põhjustab erinevate füsioloogiliste reaktsioonide tekitatud ROS, mis muidu avaldaks raku heaolule kahjulikku mõju. Varasemad aruanded ja meie tulemused selles uuringus viitavad sellele, et EPS on võimeline eemaldama ROS-i ja parandama rakkude elujõulisust. Meie tulemused pärmi oksüdatiivse stressivastuse mutantsete tüvedega viitavad sellele, et galaktaan-EPS-ravi hävitab nii tsütosoolseid kui ka mitokondriaalseid superoksiidi radikaale, mis on indutseeritud H2O2-ga töötlemisega, mida tõendab vastavalt pärmi sod1∆ ja sod2∆ mutantsete tüvede elujõulisuse suurenemine. SOD-d on rakkudes esmased ensümaatilised antioksüdantide kaitsemehhanismid endogeense ja eksogeense oksüdatiivse stressi vastu ning nende geenide mutatsioonid on seotud vähi ja degeneratiivsete häiretega. Samuti näitab cta1∆ ja ctt1∆ (katalaasi mutandid) antioksüdantide päästmine EPS-ravi abil, et ravi galaktaan-EPS-iga pakub kaitset H2O2 indutseeritud peroksisomaalse ja tsütosoolse oksüdatiivse stressi eest. Katalaas vastutab vesinikperoksiidi rakkude detoksikatsiooni eest ja selle puudust seostatakse vanusega seotud häirete tekkega. TSA1, tioredoksiinperoksidaas, on nii ribosoomidega seotud kui ka vaba tsütoplasmaatiline valk, mis vabastab rakud vesinikperoksiidi stressist. Aruanded näitavad, et TSA1 omab rolli ka oksüdatiivse DNA kahjustuse parandamisel. Meie tulemused näitavad, et EPS-ravi päästab pärmi tsa1∆ rakud peroksiidist põhjustatud stressist. Imetajate peroksiredoksiinidel on positiivne mõju rakkude kasvule, ainevahetusele ja immuunfunktsioonidele. Nende puudus põhjustab raku kõrgenenud oksüdatiivset stressi, mis mõjutab olulisi signaaliülekandeteid ja on seotud neurodegeneratiivsete häirete, pahaloomuliste kasvajate ja põletikuliste haigustega 72. Glutatiooni antioksüdantide mehhanism on veel üks esmavaliku ensümaatiline antioksüdantide kaitsesüsteem, mis rakkudes esineb oksüdatiivse stressi ületamiseks. GLR1 on imetajate glutatioonreduktaasi pärmi homoloog, lokaliseerub nii tsütosoolis kui ka mitokondrites73. Glr redutseerib oksüdeeritud glutatiooni (GSSH) redutseeritud glutatiooniks (GSH) ja mängib rolli GSH taseme säilitamisel rakkudes, mis omakorda detoksifitseerib superoksiidi ja hüdroksiidi radikaale, kaitstes seega rakke oksüdatiivse stressi eest74. Meie tulemused näitavad pärmi glr1∆ kõrget tundlikkust H2O2 suhtes, mida leevendas eeltöötlemine galaktaan-EPS-iga, mis viitab sellele, et galaktaan-EPS võib kaitsta rakke, millel puudub GLR1 oksüdatiivse stressi eest. Huvitaval kombel on glutatioonreduktaasi puudulikkust seostatud vananemise ja vanusega seotud metaboolsete, degeneratiivsete ja kardiovaskulaarsete häiretega 75, 76. Nagu on näidatud joonisel 4A, kaitses yhb1∆ galaktaan EPS ka H2O2 stressi eest, mis viitab sellele, et galaktaan EPS kaitseb rakke, millel puudub YHB1 oksüdatiivse stressi eest. Pärm YHB1 on lemmik hemoglobiin, mis väidetavalt kaitseb rakke lämmastikoksiidi stressi77 ja oksüdatiivse stressi78 eest. Tõendid näitavad, et YHB1 inimese homoloog näib päästvat rakud alfa-sünukleiini toksilisusest, mis on Parkinsoni tõve biomarker79. Need varasemad leiud ja meie tulemused viitavad sellele, et EPS võib soodustada rakkude ellujäämist degeneratiivsete häirete tekke vastu.

ROS-i taseme hindamiseks pärmi mutantides galaktaani olemasolu ja puudumisega H2O2 stressi all, jälgiti pärmirakke fluorestsentsmikroskoobi all ja rakusisene oksüdatsioonitase arvutati spektrofluoromeetriga 47, 48. Ainuüksi H2O2-ga töödeldud pärmimutantidel oli rohkem rohelisi fluorestseeruvaid rakke võrreldes galaktaaniga eeltöödeldud mutantidega. (Joonis 4C). DCF-i fluorestsentsi intensiivsus suurenes ligikaudu 60 protsenti, samas kui galaktaani eeltöötlemisel vähenes see H2O2--ga töödeldud pärmi mutantides ligikaudu 30 protsendini võrreldes WT ja vastava kontrolliga (joonis 4D). Nii mikroskoopilised kui ka spektrofotomeetrilised tulemused näitavad suurenenud ROS-i taset rakkudes, millel puuduvad spetsiifilised antioksüdantsed geenid võrreldes vastavate kontrollidega. Galaktaaniga eeltöödeldud ja seejärel H2O2-ga kokku puutunud kultuurid näitasid väiksemat fluorestsentsi võrreldes galaktaaniga eeltöödeldud kultuuridega, mis viitab sellele, et galaktaan vähendas ROS-i induktsiooni H2O2 ekspositsiooni pärmi mutantsetes rakkudes ja soodustab rakkude ellujäämist. Kõigis ülaltoodud katsetes, kui rakke pesti enne H2O2 lisamist, ei ilmnenud olulist päästmist (täiendavad andmed), mis viitab sellele, et galaktaani ROS-i eemaldamine on tingitud pigem otsesest eemaldamisest söötmes kui intratsellulaarsest toimest.