Oleanoolhappe nanokiud nõrgestavad tahkete osakeste põhjustatud oksüdatiivset stressi keratinotsüütides

Lisateabe saamiseks võtke ühendust oscar.xiao@wecistanche.com-ga

Abstraktne:Õhus levivad tahked osakesed (PM) on üks õhusaaste näitajatest ning ühtlasi ka peamine nahas oksüdatiivset stressi põhjustav tegur. Oleanoolhape (OA), looduslik terpenoidühend, pärsib tõhusalt PM-indutseeritud naha vananemist; OA-l on aga halb vees lahustuvus ja naha imendumine, mis piirab selle kasutamist ravimites ja kosmeetikas. Selle uuringu eesmärk oli valmistada oleanoolhappe nanokiud (OAnf) ja hinnata OA ja OAnf mõju PM-ga töödeldud keratinotsüütidele. Tulemused näitasid, et (dimetüülsulfoksiidis (DMSO) lahustatud OA) nõrgendas PM-indutseeritud reaktiivsete hapnikuühendite üleproduktsiooni, stressiga aktiveeritud proteiinkinaasi/Jun-aminoterminaalse kinaasi (SAPK/JNK) aktivatsiooni ning põletiku- ja nahaväljendusi. - vananemisega seotud valgud. Lisaks parandas OA nanokiudprotsess tõhusalt OA lahustuvust vees enam kui 99 000-kordselt, muutes selle füüsikalis-keemilisi omadusi, sealhulgas pindala suurenemist, osakeste suuruse vähendamist, amorfset transformatsiooni ja vesiniksidemete moodustumine abiainetega. OAnfi naha läbitungimisvõime oli pidevalt üle 10- korra kõrgem kui OA-l. Pealegi oli OAnf PBS-is lahustatuna suurepärane antioksüdantne, põletikuvastane ja naha vananemisvastane toime PM-is -töödeldud keratinotsüüte kui OA. Kokkuvõttes näitavad meie leiud, et OAnf võib olla paikselt manustatav antioksüdant, mis leevendab PM-i põhjustatud nahaprobleeme.

Märksõnad:tahked osakesed; oleanoolhape; nalnofiber; antioksüdant; põletikuvastane; Vananemisvastane

1. Sissejuhatus

Õhusaaste on nüüdseks rahvatervise probleem kogu maailmas. Tehnoloogia arenedes kogunevad atmosfääri erinevad kahjulikud ained, sealhulgas gaasid, keemilised ained, bioloogilised saasteained ja osakesed, mis mõjutavad tugevalt inimeste elu ja tervist. Tahked osakesed (PM), õhusaasteainete indikaator, on mitmesuguste orgaaniliste ühendite, bioloogiliselt saadud materjalide ja tahkete osakeste süsiniku tuumade kombinatsioon[1]. PM satuvad kopsudesse sissehingamisel ja vereringesse, põhjustades süsteemseid terviseriske, nagu elundipõletikud ning südame-veresoonkonna ja hingamisteede haigused [2,3]. Lisaks võivad PM läbida nahabarjääri ja koguneda juuksefolliikulisse ning tungida korduva kokkupuute korral isegi pärisnahasse; Seetõttu on naha liigset kokkupuudet PM-ga seostatud naha välise vananemise, pigmentatsiooni muutuste, atoopilise dermatiidi, akne ja psoriaasiga [2,4]. Pikaajaline kokkupuude PM-ga kutsub esile keratinotsüütides reaktiivsete hapnikuliikide (ROS) ületootmise, mis käivitab mitu signaaliülekande rada, sealhulgas apoptoosi rada, mitogeen-aktiveeritud proteiinkinaasi (MAPK) teed ja põletik. Tsükloksügenaasi-2 (COX-2), tuumori nekroosifaktori (TNF-a) ja interleukiini-1 (IL-1) ekspressiooni suurenemist täheldatakse tavaliselt keratinotsüütides, mis puutuvad kokku PM.Lisaks aktiveerib PM ka maatriksi metalloproteinaase (MMP) ja põhjustab naha elastsuse kaotust ja vananemist [5].

Lisateabe saamiseks klõpsake siin

Looduslikke tooteid on pikka aega kasutatud tõhusate kosmeetikatoodete koostisainetena. Oleaanhape (OA, 3 -hydroxyolean-12-en-28-oicacid), viietsükliline triterpenoidne ühend, esineb laialdaselt taimedes, puuviljades ja köögiviljades [6]. OA on hästi tuntud oma maksa kaitsva toime poolest, nagu näiteks kemikaalide põhjustatud ägeda maksakahjustuse ja fibroosi/tsirroosi vähendamine krooniliste maksahaiguste korral [6,7]. Lisaks on varasemad uuringud näidanud, et OA-l on antioksüdant, vähivastane, põletikuvastane, diabeedivastane ja antimikroobne toime [8] Kim et al. näitas, et OA võib vähendada põletikueelse tsütokiini (TNF-a, IL-6) ja naha vananemisvalgu (MP-1) ekspressiooni PM-ga töödeldud keratinotsüütides [9]. Kuid OA füüsikalis-keemilised omadused muudavad selle vees lahustumise keeruliseks, mis piirab selle kasutamist ravimites, toidus ja kosmeetikas.

Ravimite kohaletoimetamise formulatsioonid, nagu polümeeripõhised nanokandjad, nt. posoome ja nanokiude kasutatakse tavaliselt toimeainete füüsikalis-keemiliste omaduste parandamiseks. Toimeainete kapseldamine abiainetega nendes ravimkoostistes võib suurendada nende lahustuvust vees ja naha imendumist ning vähendada potentsiaalset toksilisust ja nahaärritust. Nende hulgas on nanokiud nanosuuruses koostis, millel on suur pindala, madal tihedus ja suur pooride maht ning mida kasutatakse juba laialdaselt biomeditsiinis, mis võib vähendada suukaudsete ravimite mahtu, suurendada toimeainete stabiilsust, kontrollida. vabastada, parandada biosaadavust ja teha tehiskudesid [10]. Elektroketrus on levinud tehnoloogia, mida kasutatakse nanokiudude tootmiseks ja mis sobib hästi masstootmisega [1]. Seetõttu võib nanokiudude valmistamine elektroketrusprotsessi abil samaaegselt parandada biosaadavust. vees halvasti lahustuva toimeaine tootmistõhusust. Polüvinüülpürrolidoon (PVPK90) ja 2-hüdroksüpropüül- -tsüklodekstriin (HPBCD) on FDA poolt heaks kiidetud ühendid hüdrofoobsete farmatseutiliste toimeainete lahustamiseks ja kohaletoimetamiseks inimestele.cistanche kolesteroolVarasemad uuringud näitasid, et HPBCD ja PVPK90-ga valmistatud nanokiud parandasid oluliselt resveratrooli [12] ja plaaiõli [13] vees lahustuvust ja naha läbitungimist. Seega oli selle uuringu eesmärk kasutada PVPK90 ja HPBCD manustamiskandjatena oleanoolhappe nanokiudude (OAnf) valmistamiseks ning hinnata OA ja OAnf mõju PM-ga töödeldud keratinotsüütides.

Cistanche on vananemisvastane toime

Käesoleva uuringu eesmärk oli hinnata DMSO-s lahustatud OA bioloogilist toimet PM-indutseeritud keratinotsüütide kahjustustele. OA halvast vees lahustuvusest ülesaamiseks kasutasime oleanoolhappe nanokiudude (OAnf) valmistamiseks elektroketrusprotsessi abil kohaletoimetamise kandjatena PVPK90 ja HPBCD ning seejärel määrasime füüsikalis-keemiliste omaduste muutused töötlemata OA ja OAnf vahel, et selgitada vees lahustuvuse paranemist ja naha tungimine. OA nanokiudprotsessi järgse bioloogilise toime võrdlemiseks kasutati OAnfi ja OA antioksüdatiivse, põletikuvastase ja vananemisvastase toime hindamiseks PM-indutseeritud keratinotsüütide kahjustuse mudelit.

2. Materjalid ja meetodid

2.1.Materjalid

Oleanoolhappe hüdraat (OA) osteti ettevõttelt Tokyo Chemical Industry Co.,Ltd. (Tokyo, Jaapan). Polüvinüülpürrolidoon (Luviskol" K90 Powder, PVP) osteti ettevõttelt Wei Ming Pharmaceutical Mfg. Co., Ltd. Taipei, Taiwan. Hüdroksüpropüül-beetatsüklodekstriin (HPBCD) saadi ettevõttest Zibo Qianhui (Zibo, Hiina). Metanool ja dimetüül sulfoksiid (DMSO) osteti firmalt Aencore Chemical (Surrey Hills, Austraalia).Kõik rakukultuuride jaoks kasutatavad kemikaalid või reaktiivid olid bioloogilise puhtusega ja muud füüsikalis-keemilise määramise kemikaalid olid kõrgefektiivse vedelikkromatograafia (HPLC) kvaliteediga.

2.2.Rakkude elujõulisuse test

Toimeaine rakkude elujõulisuse määramine on levinud meetod, mida kasutatakse toimeainete õigete kontsentratsioonivahemike valimiseks, et hinnata nende bioloogilist aktiivsust. HaCaT keratinotsüüdid osteti firmalt Istituto Zooprofilattico Sperimen-tale della Lombardia edell'Emilia Romagna (Brescia, Itaalia). HaCaT rakke kultiveeriti DMEM-is (Himedia Laboratories, Mumbai, India), mis sisaldas 10 protsenti veise loote seerumit (Hazelton Product, Denver, PA, USA) ja 1 protsenti penitsilliini-streptomütsiini (Biological Indust-tries, Connecticut, NE , USA) ja HaCaT rakke inkubeeriti inkubaatoris (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) tingimustega 37 kraadi ja 5% COz. Testproovide ettevalmistamiseks lahustati OA ja OAnf vastavalt DMSO-s ja PBS-is ning seejärel lahjendati iga proov rakkude elujõulisuse määramiseks DMEM-is ilma veise loote seerumita. HaCaT rakud külvati 96-süvendiga plaatidele tihedusega 1 × 104 rakku/100 μL süvendi kohta 24 tundi. Seejärel sööde eemaldati ja rakke töödeldi OA ja OAnf erinevate kontsentratsioonidega vahemikus 5 kuni 80 uM seerumivabas DMEM-is 24 tundi. Katse ajal eemaldati töötlemiskeskkond ja igasse süvendisse lisati 150 µl 0,5 mg/ml MTT lahust. Pärast 3-tunnist inkubeerimist eemaldati MTT lahus ja iga süvendi purpursed formatsaani kristallid lahustati 100 uL DMSO-s. Seejärel mõõdeti iga süvendi neeldumine 550 nm juures, kasutades mikroplaadi spektrofotomeetrit (BioTek uQuant, Winoski, VT, USA). Rakkude elujõulisus arvutati järgmise valemiga:

2.3.Reaktiivsete hapnikuliikide (ROS) sisalduse määramine

PM (standardne võrdlusmaterjal, SRMB1649b) osteti riiklikust standardite ja tehnoloogia instituudist. See toode koguti 1976. ja 197. aastal Washingtonis, DC Made'is. Kokku 10 mg/ml PM-i suspendeeriti PBS-is ja seejärel töödeldi enne kasutamist 10 minutit ultraheliga. Kokku 1 × 10 pluss HaCaT keratinotsüüte kasvatati 96-süvendiga plaatidel 24 tundi 37 kraadi ja 5% CO2 tingimustes. Rakke töödeldi erineva kontsentratsiooniga OA-ga DMSO-s, OA-ga PBS-s ja OAnf-ga PBS-s 24 tundi vastavalt. Seejärel inkubeeriti neid 20 uM diklorodihüdrofluorestseiindiatsetaadi (DCFH-DA; Sigma, Tokyo, Jaapan) lahusega 30 minutit. Seejärel lisati igasse süvendisse 50 ug/cm2 PM ja inkubeeriti 1 tund. Pärast seda pesti rakke kaks korda PBS-iga ja iga proovi fluorestsentsi intensiivsust analüüsiti fluorestseeruva plaadilugeja abil (ergastus: 485 nm; emissioon: 528 nm) (BioTek, Winooski, VI, USA). ROS tootmine:

2.4. Western blot analüüs

Kokku 4 × 105 HaCaT keratinotsüüti kasvatati 6-süvendiga plaatidel 24 tundi. Seejärel töödeldi rakke OA või OAnf-ga seerumivabas söötmes 24 tundi, millele järgnes PM lisamine. Pärast erinevaid ajapunkte lüüsiti rakud RIPAlüüsi puhvriga (Merck Millipore, Burlington, MA, USA), seejärel tsentrifuugiti kiirusel 12, 000 p/min 10 minutit. Valgu kontsentratsiooni määramiseks kasutati BCA valgu analüüsi komplekti (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Seejärel eraldati valgud naatriumdodetsüülsulfaat-polüakrüülamiidi geelelektroforeesiga (SDS-PAGE) ja seejärel blotiti polüvinülideendifluoriidi (PVDF) membraanidele (Merck Millipore). Membraanid blokeeriti 1 tund ja pesti Tris-puhverdatud soolalahusega ( TBS) 1 protsendi Tween{16}}-ga. Membraane inkubeeriti primaarsete antikehadega 4 kraadi juures üleöö. Selles uuringus kasutatud esmased antikehad olid tsüklooksügenaas-2 (COX-2), maatriksi metalloproteinaas-9 (MMP-9), metalloproteinaasi kudede inhibiitor-1 (TIMP-1), stressiga aktiveeritud proteiinkinaas/Jun-aminoterminaalne kinaas (SAPK/JNK) (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA), GAPDH (Santa Cruzi biotehnoloogia, Dallas, TX, USA), maatriksi metalloproteinaas-1 (MMP-1) (Proteintech Group, Rosemont, IL, USA), p380, rakuvälised reguleeritud proteiinkinaasid (ERK) ja tuumafaktor kappa-kergeahel. aktiveeritud B-rakkude (NF-kB) võimendaja (Merck Millipore, Burlington, MA, USA). Järgmisena lisati sekundaarsed antikehad 1 tunniks toatemperatuuril ja reageeriti täiustatud kemiluminestsentsreaktiividega (ECL; Thermo Fisher Scientific). Sisekontrollina kasutati GAPDH vastaseid antikehi. Iga valgu ekspressiooni analüüsiti Touch Imageri abil (e-BLOT; Shanghai, Hiina) ja ekspressioon kvantifitseeriti ImageJ abil.

2.5. Oleanoolhappe nanokiudude (OAnf) valmistamine

OAnfid tsentrifuugiti erinevate OA:PVP:HBPCD suhetega (1:8:5, 1:8:10 ja 1:8:20). Elektrotsentrifuugimislahus valmistati järgmiselt: 25 mg OA-d lahustati 5 ml metanoolis, lisati HPBCD ja segati magnetsegistiga, et saada selge lahus; seejärel lisati kohe PVPK90 ja segu segati 1 tund.cistanche deserticola kõrvaltoimedNanokiud kooti FES-COS elektroketrusseadmega (Falco Tech Enterprise Co., Taipei, Taiwan) järgmistel tingimustel: 10 ml süstal nõela siseläbimõõduga 0. Elektriketramiseks kasutati 22 mm; voolukiirus reguleeriti väärtusele 0,2 ml/h; rakendatud pinge määrati 12 KV; tipu-koguja vahe oli 10 cm. Pärast elektriketrusprotsessi koguti nanokiud alumiiniumfooliumi abil. Äsja sünteesitud nanokiud pandi suletud kilekotti ja säilitati niiskuskindlas konteineris.

2.6. Kõrgfektiivne vedelikkromatograafia (HPLC) oleanoolhappe analüüs

HPLC analüüsisüsteem (LaChrom Elite L{{0}}, Hitachi, Tokyo, Jaapan) koosnes L-2130 pumbast, L-2200 automaatsest proovivõtturist ja L{{3 }} ultraviolettkiirguse nähtav (UV-vis) detektor. Analüüsi kolonn oli Mightysil RP-18 GP kolonn (250 × 4,6 mm id., 5 um). Liikuv faas koosnes metanoolist ja 0,1% jää-äädikhappe lahusest fikseeritud vahekorras (95:5; w/v). Liikuva faasi voolukiirus oli 1 ml/min ja UV-detektori tuvastuslainepikkuseks määrati 215 nm. Oleanoolhappe neeldumispiik ilmnes 7, 5 minuti pärast. Oleanoolhappe kalibreerimiskõver näitas head lineaarset （r =0.999） vahemikus 0.01-100 ug/mL.

2.7. OAnfi morfoloogia, kiu läbimõõt ja osakeste suuruse mõõtmine

Erinevad nanokiudude proovid kaeti plaatinaga ioonkattega (E{{0}}, HITACH, Tokyo, Jaapan); tingimus määrati 10 mA 120 s hiljem. Iga proovi morfoloogiat ja kuju jälgiti skaneeriva elektronmikroskoobiga (Hitachi S4700 Hitachi, Tokyo, Jaapan). Iga proovi läbimõõt arvutati image j tarkvara abil. OAnfi osakeste suuruse mõõtmiseks kasutati Zetasizer 3000HS analüsaatorit (Malvern, Worcestershire, UK). OA ja OAnf osakeste suurust mõõdeti vastavalt kontsentratsioonidel 1 mg/ml ja 0,1 mg/ml.cistanche dosage redditLisaks jälgisime transmissioonielektronmikroskoobi (TEM, JEM{{0}}EXII instrument, JEOL Co., Tokyo, Jaapan) abil ka OAnfi morfoloogia ühtlust pärast vees lahustamist. Uuritavas proovis reguleeriti 1 ug/ml OA-d deioniseeritud vees ja seejärel tilgutati vaskvõrku ning seejärel tilgutati kohe 0,5% (mass/maht) fosfovolframhapet. Pärast kuivatamist pandi iga proov vaatlemiseks TEM-i.

2.8.OAnfi ravimite laadimise ja kapseldamise efektiivsus

Farmatseutilise protsessi toimivuse hindamiseks on väga oluline määrata manustamissüsteemi ravimi laadimise ja kapseldamise efektiivsus. Ravimi sisaldus arvutati OA nanokiududes sisalduva OA määratud sisalduse ja teoreetilise sisalduse protsendina. Ravimi laadimise määramiseks lisati 100 μL igast proovist 900 μL metanooli ja OA kontsentratsioon oli kus CoA on OAnfi OA kontsentratsioon, WoA on lisatud OA teoreetiline kogus, VoAnf on OAnf lahuse maht.

Kapseldamise efektiivsus näitab, kas nanokiud kapseldasid edukalt aktiivsed ühendid. OAnf proovid lahustati deioniseeritud vees ja lisati tsentrifugaalfiltritesse (Microcon YM-10, Millipore, Billerica, MA, USA) ning seejärel tsentrifuugiti kiirusel 12, 00 p/min 10 minutit jahutatud tsentrifuug (Centrifuge 5430R, Eppendorf, Hamburg, Saksamaa). Kapseldatud osa jäeti ülemisse torusse ja kapseldamata osa koguti alumisest torust molekulmassi erinevuse tõttu. Kapseldamata OA kogus tuvastati ülalmainitud HPLC meetodil. Kapseldamise efektiivsuse arvutamiseks kasutati järgmist võrrandit:

kus AoA on nanokiududesse lisatud OA (saadud söötmistingimustest) teoreetiline kogus ja Aunentrapped OA on kapseldamata OA kogus.

2.9.OAnf lahustuvus vees

Toores OA (1 mg) ja erineva vahekorraga OAnfi preparaadid (sisaldavad 1 mg oleanoolhapet) lahustati vastavalt 1 ml deioniseeritud vees ja seejärel töödeldi ultraheliga ultraheliseadmes (Branson 5510, Emerson Electric, St. Louis, MO, USA) 20 minutit. Iga proov filtriti läbi 0,45 um membraani (Pall Corporation, Washington, NY, USA) ja lahjendati 10- korda. Lahjendatud lahuseid analüüsiti HPLC abil ja oleanoolhappe koguse määramiseks kasutati standardkõverat, et võrrelda nende lahustuvust vees.

2.10. Kristallilisest amorfseks muundumise määramine

OA kristalse vormi, abiainete ja OAnf analüüsimiseks kasutati röntgendifraktomeetriat (Siemens D500, Karlsruhe, Saksamaa). Analüüs viidi läbi niklifiltriga Cu-Ka kiirgusega, kasutades pinget 40 kV ja voolu 25 mA. Skaneerimiskiirus oli 1 kraad/min ja skaneeritud nurkade vahemik oli 5 kraadist 50 kraadini. 2.11. OA ja abiainete vaheline molekulidevaheline interaktsioon

Toimeainete ja abiainete vahelise molekulidevahelise interaktsiooni kinnitamiseks kasutatakse tavaliselt Fourier' transformatsiooni infrapunaspektroskoopiat (FTIR) ja 1H tuumamagnetresonantsi (1H NMR). Oleanoolhape, PVP, HPBCD ja OAnfi erineva suhtega preparaadid segati vastavalt mördi abil kaaliumbromiidiga (KBr) mahusuhtes 1:9 ja pressiti tablettideks. Seejärel analüüsiti iga proovi FTIR spektrofotomeetriga (Perkin-Elmer 200 spektrofotomeeter, Perkin-Elmer, Norwalk, CT USA). Skaneerimisvahemik oli 400-4000 cm-4. Lisaks Iga proov lahustati 0,8 ml 99,8% DMSO-dg-s (Merck, St. Louis, MO, USA) ja analüüsiti JEOL Alpha 400 spektromeetriga (Nihon Denshi Co., Tokyo, Jaapan).

2.12. Oleanoolhappe ja selle nanokiudude tungimine nahale Ex vivo

See katse viidi läbi vastavalt Euroopa kosmeetikatoodete ja parfümeeriatoodete assotsiatsiooni (COLIPA) juhiste standardprotokollile. Franzi difusioonikambri süsteemi saab jagada ülemise doonorikambri ja alumise retseptorkambri klaasmahutiteks. Retseptorkambrisse pandi kokku 1,5 ml puhverlahust, mis sisaldas 0,14MNaCl, 2mMK-HPO4, 2mMK-HPO4, 0},4 mM KH2PO4 (pH 7,4), ja segati magnetpulgaga kogu aeg kiirusel 600 pööret minutis. eksperiment. Sea värske küljenahk saadi kohalikult lihunikult turult ja jahutati katseperioodi jooksul. Iga nahaproov lõigati 2 cm × 2 cm tükkideks ja asetati kahe kambri vahele nii, et sarvkiht oli ülespoole. Franzi difusioonikambrit hoiti 32 kraadi juures ringleva veevanniga.cistanche ekstrakti eelisedSeejärel lisati doonorkambrisse 1, 2 või 4 tunniks 200 µl 1 mg/ml OA või OAnf. Pärast seda eemaldati Franzi difusioonikambrist sea nahk ja sarvkiht saadi 15-kordse teibiga eemaldamise teel. Iga järelejäänud nahaproovi kuumutati kuumutuspadjaga 95 kraadini ning epidermis ja pärisnahk eraldati skalpelliga. Iga proov sukeldati metanooli ja töödeldi OA ekstraheerimiseks 1 tund ultraheliga ning oleanoolhappe sisaldus igas proovis määrati HPLC meetodil. 2.13. Statistiline analüüs

Kõik andmed esitati kui keskmine ± standardhälve (SD). Statistilist olulisust erinevate rühmade vahel analüüsiti dispersioonanalüüsi (ANOVA) abil Tukey post hoc testiga.p<0.05 indicated="" statistical="" significance.="">

3.1. Oleanoolhape võib pärssida põletikku, vananemist ja ROS/MAPK-de signaaliradasid PM-indutseeritud keratinotsüütide kahjustuse korral

Bioloogilise aktiivsuse hindamiseks sobiva kontsentratsioonivahemiku leidmiseks määrati DMSO-s lahustatud OA tsütotoksilisus inimese HaCaT keratinotsüütide rakkudes, kasutades MTT testi. Nagu on näidatud joonisel 1A, seostati 40 ja 80 μM OA-d 32–16 protsendilise rakkude elujõulisusega. OA puhul alla 20 μM oli rakkude ellujäämise määr endiselt üle 85 protsendi. Need tulemused näitasid, et OA-l kontsentratsioonis 5-20 μM ei ole inimese HaCaT keratinotsüütidele tsütotoksilist toimet (joonis 1A). Sellest lähtuvalt uuriti OA-d kontsentratsioonis 5-20 uM, et uurida selle antioksüdantset ja saastevastast toimet PM-indutseeritud keratinotsüütide kahjustuse korral. Hiljuti on paljud uuringud näidanud, et PM on tavaline õhusaasteaine, mis põhjustab ROS-i ületootmist ja sellele järgnevat nahasüsteemi kahjustust oksüdatiivse stressi, sealhulgas lipiidide peroksüdatsiooni, valkude karbonüülimise ja DNA mutatsiooni kaudu [14-16]Nagu on näidatud Joonis fig 1B, PM-ravi suurendas oluliselt ROS-i tootmist võrreldes töötlemata rühmaga (lk<0.05).in contrast,="" pretreatment="" with="" oa="" effectively="" decreased="" pm-induced="" ros="" overproduction="" in="" a="" dose-dependent="" manner=""><0.05).there-fore, these="" results="" suggested="" that="" oa="" possessed="" antioxidant="" activity="" to="" prevent="" pm-induced="" oxidative="" stress="" by="" reducing="" the="" ros="" overproduction.="" in="" addition,="" ros="" overproduction="" after="" pm="" exposure="" can="" activate="" the="" phosphorylation="" of="" mapks="" proteins,="" including="" p-erk,="" p-p38,="" and="" p-jnk,="" triggering="" the="" protein="" expressions="" of="" inflammation="" and="" aging[17,18]the="" present="" study="" also="" found="" that="" pm="" treatment="" can="" increase="" the="" expression="" of="" inflam-matory="" proteins="" (cox-2="" and="" nf-kb),skin="" aging-related="" proteins="" (mp-1,mmp-9="" and="" timp-1),and="" phosphorylation="" of="" erk,jnk,="" and="" p38=""><0.05). our="" present="" results="" also="" demonstrated="" that="" oa="" at="" 10="" and="" 20="" um="" significantly="" inhibited="" the="" protein="" expression="" of="" nf-kb="" and="" cox-2="" when="" compared="" with="" the="" pm="" treatment="" group="" (p=""><0.05)(figure 1c)furthermore,="" oa="" pretreatment="" also="" effectively="" reversed="" pm-induced="" alteration="" on="" mmp-1="" and="" timp-1="" expression=""><0.05) but="" had="" no="" effect="" on="" mmp-9(figure="" 1d).="" we="" further="" de-termined="" the="" effects="" of="" oa="" treatment="" on="" phosphorylation="" of="" mapks="" during="" pm="" exposure,="" and="" our="" results="" indicated="" that="" oa="" could="" inhibit="" the="" phosphorylation="" of="" jnk=""><05), but="" had="" no="" effect="" on="" erk="" or="" p38="" (figure="" 1e).="" according="" to="" the="" above="" results,="" when="" dissolved="" in="" dmso,="" oa="" displayed="" good="" skin-protective="" activity="" and="" could="" ameliorate="" pm-induced="" ros="" overproduction,="" jnk="" activation,="" and="" inflammatory="" and="" skin-aging="" protein="" expression="" in="">

3.2. Oleanoolhappe nanokiud suurendasid tooroleanoolhappe vees lahustuvust ja naha läbitungimist, parandades füüsikalis-keemilisi omadusi

3.2.1.Oleanoolhappe ja selle nanokiudude pinnamorfoloogia

SEM-i vaatlusel oli HPBCD välimus sfääriline ja poorne abiaine ning selle suurus oli umbes 20 kuni 50 μm (joonis 2A). PVPK90 on abiaine, millel on ebaregulaarsed hulknurksed osakesed ja osakeste suurus on üle 60 um (joonis 2B). .Toores oleanoolhape on ebakorrapäraselt ümmargune teraline pulber, mille suurus on 3-60 um. Joonisel fig 2D-F on näidatud oleanoolhappe erinevate massisuhete keskmine kiu läbimõõt: HPBCD:PVPK90 olid vastavalt 174,83 ± 19,53 nm, 219,23 ± 18,93 nm ja 403,17 ± 32,99 nm. Leiti, et HPBCD (18) suurem suhe :20) tõi kaasa suurema kiu läbimõõduga OAnf (tabel 1).

3.2.2.Vees taastatud OAnf osakeste suurus ja morfoloogia

Vees lahustunud OAnfi (OA:PVP:HPBCD, 1:8:20) osakeste kuju ja osakeste suuruse jälgimiseks näitas OAnfi kujutis transmissioonielektronmikroskoobi (TEM) all. et oleanoolhappe osakesed olid sfäärilised ja ühtlaselt vees dispergeeritud (joonis 3). Osakeste suurust kinnitas ka osakeste suuruse laseranalüsaator (tabel 2). OA ja OAnfi osakeste suurused olid vastavalt 5079,50±384,87 nm ja 302,37 ± 11,91 nm. OA ja OAnfi polüdisperssuse indeksid (PDI) olid vastavalt 1,63 ± 0, 21 ja 0, 32 ± 0, 02. Need tulemused näitavad, et elektriketrusprotsess vähendas tõhusalt OA osakeste suurust ühtlase osakeste jaotusega ja suurendas pindala.

3.2.3. Oleanoolhappe nanokiudude ravimi laadimine, kapseldamise tõhusus ja vees lahustuvus

Nagu on näidatud tabelis 3, olid OA laadimisprotsendid erinevates abiainete suhetes vastavalt 72,36 ± 10,45%, 84,23 ± 3,62% ja 98,19 ± 4,82%. Tulemused näitasid, et HPBCD suurem suhe näitas paremat ravimi laadimise efekti. Kõikide preparaatide kapseldamise efektiivsus oli suurem kui 95 protsenti, mis näitas, et PVPK90 ja HPBCD kapseldasid tõhusalt OA. Lisaks oli OAnfi vees lahustuvus erinevate abiainete vahekordadega 296,14 ± 57,75 ug/mL, 395,87 ug/mL, 777. ja vastavalt 998,7±58,32 ug/ml.cistanche tšingis-khaanNeed tulemused näitasid, et HPBCD suurenemine preparaadis suurendas järsult toores OA lahustuvust vees. Seevastu toor-OA vees lahustuvust ei saanud määrata, kuna see oli HPLC-meetodis alla tuvastamispiiri (0,01 ug/mL). See tulemus näitas, et 1:8:20 OAnf-i vees lahustuvus paranes rohkem kui 1000-korda võrreldes töötlemata OA-ga. Seega kasutati järgmistes uuringutes PM-indutseeritud keratinotsüütide kahjustuse mudelis bioloogilise aktiivsuse määramiseks 18:20 OAnf.

3.2.4.Oleanoolhappe ja selle nanokiudude kristalne muutumine

Toores OA, abiainete ja selle nanokiudude röntgendifraktsiooni (XRD) mustrid on näidatud joonisel 4. Toores OA-l oli skaneerimisnurga 5 kraadi -20 kraadi juures mitu kõrge intensiivsusega iseloomulikku difraktsioonipiiki, mis näitab, et toores OA oli kristalne ühend. Teisest küljest ei ole PVPK90 ja HPBCD difraktsioonimustritel ilmseid iseloomulikke difraktsioonipiike. Lisaks kadusid töötlemata OA puhul elektriketruse töötlemisel täielikult kõik töötlemata OA iseloomulikud difraktsioonipiigid, mis näitas, et töötlemata OA olemus OA muudeti kristalsest amorfseks (joonis 4). Nende tulemuste põhjal võime järeldada, et toores oleanoolhape kapseldati pärast nanokiudprotsessi edukalt HPBCD-sse ja kapseldati PVPK90-ga.

3.2.5. Molekulidevahelise vesiniksideme moodustumine oleanoolhappe ja abiainete vahel

Toores OA ja HPBCD molekulidevaheline interaktsioon PVPK90-ga määrati FTIR-spektroskoopia abil ja tulemused on näidatud joonisel 5. FTIR-spekter näitas selgelt töötlemata OA mitme keemilise funktsionaalrühma neeldumist, sealhulgas neeldumisriba 3463 cm{{ 3}} (——OH venitusvibratsioon),1696 cm-1 (——C=O venitusvibratsioon) ja 1462 cm-l (—CHz venitusvibratsioon)(joonis 5). Kui OA, PVPK90 ja HPBCD kompleksiti nanokiudude moodustamiseks, nihkus nende keemiliste funktsionaalrühmade neeldumine ilmselgelt madalamale neeldumisele. Need leiud viitasid molekulidevahelistele vesiniksideme interaktsioonidele OA ja HPBCD vahel PVPK90-ga. Lisaks kasutati käesolevas uuringus ka 'H NMR-i, et kinnitada OA ja abiainete molekulidevahelist interaktsiooni. Toores OA 1HNMR spekter (joonis 6C) näitas karboksüülsignaali 812 ppm juures (H28), topeltseotud prootoneid 85,15 ppm (H12), hüdroksüprootoni signaali 83,38 ppm (H3) ja metüülprootoneid (81 ppm). , näitas OA nanokiudude HNMR-spekter, et OA karboksüülsignaal kadus ja topeltseotud, hüdroksü- ja metüülprootonite keemilised nihked nihkusid ilmselgelt ülespoole (joonis 6). Need tulemused näitasid molekulidevaheliste vesiniksidemete moodustumist OA ja abiainete vahel, mis toetas OA edukat kapseldamist HPBCD ja PVPK90 poolt.

3.2.6. Tooroleanoolhappe ja selle nanokiudude in vitro läbitungimine nahka

Paikselt manustatava preparaadi bioloogiline aktiivsus sõltub enamasti naha imendumisest. Toores OA ja selle nanokiudude läbitungimine nahka määrati in vivo seanahast. Nagu on näidatud joonisel 7, on madalam OA sisaldus（<5 μg/cm2）was="" detected="" in="" the="" epidermis="" and="" dermis="" after="" 1,2,="" and="" 4h="" of="" topical="" administration,="" and="" these="" results="" also="" indicated="" that="" raw="" oa="" could="" not="" penetrate="" the="" skin="" in="" a="" time-dependent="" manner.="" the="" result="" showed="" that="" the="" skin="" absorption="" of="" raw="" oa="" was="" extremely="" poor.="" by="" contrast,="" the="" nanofiber="" formulation="" dramatically="" increased="" the="" content="" of="" oa="" in="" the="" epidermis="" and="" dermis="" with="" 19.63="" ug/cm2,31.56="" ug/cm2,and="" 45.27="" ug/cm2="" after="" 1,2,and="" 4h="" of="" topical="" administration,="" respectively.="" these="" results="" demonstrated="" that="" the="" oanf="" formulation="" significantly="" increased="" skin="" absorption="" when="" compared="" with="" the="" raw="" oa="" topical="" administration=""><>

3.3. Mittetsütotoksilistes kontsentratsioonides oleanoolhappe nanokiududel oli parem saastevastane toime, parandades antioksüdantset, põletikuvastast ja vananemisvastast toimet

Sarnaselt DMSO-s lahustatud OA-ga vähendas PBS-is 40 uM ja 80 uM lahustatud OAnf HaCaT rakkude elujõulisust vastavalt 14,1 protsendini ja 5,6 protsendini (joonis 8A). Seetõttu hinnati 10 uM OAnfi täiendavat antioksüdantset ja saastevastast aktiivsust, et mõista, kas OA ja selle nanokiududel on võime pärssida PM-i põhjustatud ROS-i liigset tootmist. Joonis 8B näitab, et OAnf 10 uM juures vähendas märkimisväärselt PM-indutseeritud ROS-i ületootmist. Samuti arvutasime välja ROS-i tootmise inhibeerimise kiiruse, et võrrelda antioksüdantset aktiivsust PBS-s lahustatud OA ja OAnf vahel. Kümme mikromolaarset OA-d PBS-is inhibeerisid 28,3 protsenti ROS-i tootmist ja OAnf saavutas 97,6-protsendilise inhibeerimise (joonis 8B). Need tulemused näitasid, et OAnf-l oli PM-indutseeritud oksüdatiivse stressi korral keratinotsüütides parem antioksüdantne toime kui OA-l PBS-is. Lisaks võrreldi ka PM-indutseeritud keratinotsüütide kahjustuse põletikuvastast toimet. Eeltöötlemine toor-OA-ga PBS-is ei suutnud inhibeerida PM-indutseeritud NF-KB ja COX-i valgu ekspressiooni-2 Seevastu eeltöötlemine OAnf-ga PBS-is vähendas oluliselt NF-i ekspressiooni. kB ja COX{23}} PM-ga töödeldud rakkudes (lk<0.05).these results="" supported="" that="" oanf="" in="" pbs="" had="" better="" anti-inflammatory="" activity="" than="" raw="" oa="" in="" pbs="" (figure="" 8c).then,="" we="" also="" compared="" their="" anti-skin-aging="" activity.="" pretreatment="" with="" oa="" in="" pbs="" had="" no="" effects="" on="" pm-induced="" mmp-1="" or="" timp-1="" alteration.="" however,="" oanf="" in="" pbs="" could="" reduce="" the="" expression="" of="" mmp-1="" and="" rescue="" the="" expression="" of="" timp-1="" when="" compared="" with="" the="" pm-induced="" keratinocytes="" damage="" group=""><0.05)(figure 8d).these="" findings="" indicated="" that="" oanf="" possessed="" better="" anti-skin-aging="" properties="" than="" raw="" oa="" in="" pbs.="" finally,="" we="" analyzed="" the="" phosphorylation="" of="" erk,="" jnk,="" and="" p38="" to="" confirm="" the="" regulation="" of="" mapks="" signaling.="" figure="" 8e="" showed="" that="" the="" treatment="" of="" raw="" oa="" in="" pbs="" could="" not="" downregulate="" pm-induced="" phosphorylation="" of="" these="" mapks="" protein.="" however,="" pretreatment="" with="" oanf="" only="" reduced="" pm-induced="" phospho-jnk="" (p-jnk)="" expression="" but="" had="" no="" effect="" on="" p-erk="" and="" p-p38="" (figure="" 8e).the="" percentage="" changes="" of="" protein="" expression="" induced="" by="" oa="" in="" dmso,="" oa="" in="" pbs,and="" oanf="" in="" pbs="" are="" summarized="" at="" table="" 4.="" oanf="" in="" pbs="" markedly="" reversed="" pm-induced="" protein="" alterations,="" which="" was="" barely="" observed="" in="" oa="" in="" the="" pbs="" group.="" in="" addition,="" the="" effects="" of="" oanf="" in="" pbs="" were="" comparable="" to="" the="" equivalent="" amount="" of="" oa="" in="" dmso,="" which="" indicated="" that="" the="" electrospinning="" process="" increased="" the="" water="" solubility="" of="" oa="" without="" altering="" its="" bioactivities.="" accordingly,="" oanf="" effectively="" inhibited="" the="" expressions="" of="" inflammatory="" proteins="" and="" skin-aging="" proteins="" and="" downregulated="" the="" mapks="" signaling="" pathway="" in="" pm-induced="" keratinocytes="">

4. Arutelu

Viimasel ajal on õhukvaliteedi indeksi hindamisel üheks olulisemaks näitajaks saanud tahkete osakeste kontsentratsiooni jälgimine õhus. Nahk on inimese suurim immuunorgan ja PM liigne kokkupuude võib kahjustada naha funktsioone. Jin et al. näitas, et erinevat tüüpi PM ei püsinud mitte ainult epidermise väliskihis, vaid tungis ka spinosumi kihti ja juuksefolliikulisse [14]. Pikaajaline kokkupuude liigse PIA-ga põhjustab naha barjääri düsfunktsiooni ja on seotud paljude nahahaigustega, nagu atoopiline dermatiit, psoriaas, akne ja vananemine [19,20]. Dijkhoff et al. näitas selgelt, et PM võib vallandada eksogeense ja endogeense ROS-i moodustumise, mille tulemuseks on oksüdatiivse stressi progresseerumine, sealhulgas lipiidide peroksüdatsioon, valkude oksüdatsioon, mitokondriaalne düsfunktsioon, DNA kahjustus, põletiku aktiveerimine ja vananemisprotsessi kiirenemine [15]. Seetõttu on PM-indutseeritud ROS-i ületootmise vastu võitlemine hea strateegia ja esimene valik oksüdatiivse stressi kahjustuste vältimiseks PM-i üleekspositsiooni ajal. Varasemad uuringud on samuti näidanud, et antioksüdantravi, nagu difloretohüdroksükarmalool [21], dieckol [22], Opuntia humifusa ekstrakt [23] ja hapukirsi ekstrakt [24], võivad tõhusalt nõrgendada PM-indutseeritud keratinotsüütide düsfunktsiooni. Meie tulemused näitasid ka, et OA DMSO-s võib vähendada PM-indutseeritud ROS-i tootmist ja vältida PM-i kahjustusi. Lisaks on NF-kB üldlevinud ja indutseeritav transkriptsioonifaktor, mis reguleerib põletikueelsete valkude, nagu COX-2 ekspressiooni, mis mängivad olulist rolli paljudes nahahaigustes. Meie tulemused mainisid, et OA võib vähendada PM-indutseeritud NF-kB aktivatsiooni, et pärssida põletikulise valgu COX-2[25] ekspressiooni. Peale selle võib MAPK-de signaaliülekande aktiveerimine suurendada AP-1 ekspressiooni. ja viib parlamendiliikmete transkriptsioonilise reguleerimiseni[18]. Selles uuringus suutis OA pärssida nahka vananeva valgu MP-1 ekspressiooni ja suurendada naha vananemisvastase valgu TIMP-1 ekspressiooni, et vältida PM-indutseeritud keratinotsüütide vananemist. Meie kordustulemused näitasid ka, et OA pärssis tõhusalt JNK fosforüülimist. Seetõttu võib OA pärssida PM-indutseeritud nahapõletikku ja vananemist, vähendades ROS/JNK signaalirada PM-indutseeritud keratinotsüütide kahjustuste korral.

Meie teadmiste kohaselt on toimeainete halb lahustuvus vees seotud madala biosaadavusega, mis piirab nende kasutamist meditsiinis, toiduainetööstuses ja kosmeetikatööstuses [26,27]. On hästi teada, et vees halvasti lahustuvatel ühenditel on mitmeid ühiseid füüsikalis-keemilisi omadusi, nagu näiteks liiga suur osakeste suurus, madalam pind, lipofiilne struktuur ja kristalne vorm [28]. Meie tulemused näitasid ka, et töötlemata OA-l olid need füüsikalis-keemilised omadused, sealhulgas suur osakeste suurus (5079,50±384,87 nm), 3-60 um ebakorrapärane graanulite pulber väiksema pindalaga (joonis 2C) ja ilmne kristalne vorm. Need tulemused näitasid, et OA lahustuvus vees oli madalam kui 0,01 ug/mL ja selle võib klassifitseerida praktiliselt lahustumatuks toimeaineks vastavalt Ameerika Ühendriikide farmakopöa (USP) vees lahustuvuse klassifikatsioonile[29]. Kui neid puudusi ei suudeta lahendada, on OA aktiivsus nahal oluliselt piiratud. Käesolevas uuringus kasutati edukalt kandjatena PVPK90 ja HPBCD, kasutades OAnfi valmistamiseks elektriketrusprotsessi. Vees lahustuvuse parandamine on peamine indeks, mida kasutatakse optimaalse ravimkoostise kinnitamiseks, ja meie tulemused näitasid, et OA:PVPK90:HPBCD 1:8:20 juures oli parim vees lahustuvus See näitas, et OAnf suurendas tõhusalt tooraine vees lahustuvust. OA sõltuvalt HPBCD suhtest. Samamoodi on varasemad uuringud näidanud, et suurem tsüklodekstriini suhe suurendab preparaadi kapseldamisvõimet ning suurendab oluliselt kurkumiini [30], resvera-trooli [12], tümooli [31] vees lahustuvust ja bioloogilist aktiivsust. , ja difenokonasool[32]. Lisaks võrreldi käesolevas uuringus ka töötlemata OA ja selle nanokiudude füüsikalis-keemilisi omadusi, et selgitada välja OA vees lahustuvuse parandamise mehhanismid. Selles uuringus toodetud OA nanokiud olid kõik ühtlase nanosuurusega filamendid. Osakeste suuruse analüüsi tulemustes mainiti ka seda, et vees taastatud OAnf näitas nanosuuruses osakesi, millel oli parem jaotus homogeensus. Need tulemused näitasid, et OAnf pindala oli suurem kui toores OA-l. Lisaks võib molekulidevahelise vesiniksideme moodustumine aktiivsete ühendite ja kandjate vahel aidata kaasa vees lahustuvuse paranemisele. OAnfi FTIR ja HNMR spekter näitas, et toores OA kapseldati tõhusalt HPBCD-sse ja moodustas PVPK90-ga stabiliseeritud nanokiudstruktuuri, moodustades molekulidevahelise vesiniksideme OA ja HPBCD/PVPK90 vahel. Toimeaine amorfseks vormiks muudetud kristalne vorm oli samuti vees lahustuvuse paranemise näitaja. OAnfi XRD muster näitas, et toores OA kristalliline struktuur muudeti pärast nanokiudude moodustumist amorfseks struktuuriks. Sarnast tulemust täheldati ka mitmete nanokiududesse laetud toimeainete puhul [12,30]. Kokkuvõttes parandas nanokiudpreparaat tõhusalt toores OA lahustuvust vees, parandades füüsikalis-keemilisi omadusi, sealhulgas osakeste suuruse vähendamist, pindala suurenemist, vesiniksidemete moodustumist kandjatega ja amorfset muundumist.

Antioksüdante sisaldavad paikselt manustatavad preparaadid on efektiivsed epidermisesse ja pärisnahasse toimetamiseks, et neutraliseerida PM-indutseeritud oksüdatiivset stressi, põletikku ja naha vananemist [33]. Naha imendumise teadmiste põhjal on sarvkiht kiirust piiravaks teguriks, mis piirab toimeainete läbitungimist ja imendumist nahka, mille tulemusena väheneb bioloogiline aktiivsus [34]. In vitro naha läbitungimise tulemus näitas, et OAnf läbis sarvkihi kergemini ja kiiremini kui toores OA ning jäi suures koguses epidermisesse ja pärisnahasse. See tulemus kinnitas, et OAnf võib tõhusalt parandada toores OA imendumist nahas. Järgmiseks, et teha kindlaks, kas OAnfil oli parem saastevastane toime kui toores OA-l, kasutati selles uuringus nende bioloogilise aktiivsuse võrdlemiseks PM-indutseeritud keratinotsüütide kahjustuste mudelit. Meie tulemused näitasid, et OAnf-l PBS-is oli parem saastevastane toime kui toores OA-l, sealhulgas vähenes ROS-i ületootmine, vähenes põletikulise valgu ekspressioon (COX-2 ja NF-kB) ja naha vananemisvalk (MP-1), suurenenud naha vananemisvastase valgu ekspressioon (TIMP-1) ja allareguleeritud JNK fosforüülimine. Seetõttu võib OAnf olla paikselt manustatav preparaat kui antioksüdant, et vältida PM-indutseeritud keratinotsüütide kahjustusi.

Kokkuvõttes parandas OAnf oma füüsikalis-keemilisi omadusi, et lahendada toor-OA halb lahustuvus vees, ja parandas oluliselt ka toor-OA naha imendumist. OAnfil oli PM-indutseeritud keratinotsüütide kahjustuste korral parem antioksüdantne, põletikuvastane ja vananemisvastane toime. Sellest tulenevalt soovitame OAnfi kasutada nahahooldustootena või ravimvormina, et vältida PM-indutseeritud nahakahjustusi tulevikus.

See artikkel on välja võetud ajakirjast Antioxidants 2021, 10, 1411. https://doi.org/10.3390/antiox10091411 https://www.mdpi.com/journal/antioxidants