Lõhnatud glutatioonist mikronõelaplaastrid naha valgendamiseks

Abstraktne:

Glutatioon on looduslik vananemisvastane aine, mis takistab valgu tioolide oksüdeerumist reaktiivsetest hapnikuliikidest. Farmaatsiatööstuses on vähendatud glutatiooni (GSH) laialdaselt kasutatud naha valgendamiseks, kuna see suudab inhibeerida türosinaasi.

Kuid selle halb läbilaskvus ja ebameeldiv lõhn piiravad selle kasutamist naharakendustes. Siin kirjeldame GSH-ga laetud lahustuvat mikronõela (MN) plaastrit, mis on valmistatud hüaluroonhappega (HA), mis võimaldab paremat läbitungimist läbi naha ja vähendab GSH ebameeldivat lõhna. HA valiti lõhnatute GSH lahuste valmistamiseks ja seda kasutati MN valmistamisel GSH kandjana. Kuni 10 protsenti GSH-d sisaldavast MN-i moodustavast lahusest valmistatud GSH-ga laetud MN (GSH-MN) massiivid näitasid head mustri ühtlust ja sobivaid mehaanilisi omadusi naha sisestamiseks. GSH-MN-id, mille laadimisvõime on 17,4 protsenti, lahustuvad 10 minuti jooksul pärast sea nahka sisestamist ja vabastavad laetud GSH-d oksüdeerimata. See uus lähenemisviis ühendab funktsionaalseid biopolümeere, et vähendada iseloomulikku GSH lõhna ja täiustatud transdermaalset manustamist, mis põhineb MN-tehnoloogial, et parandada naha läbitungimist ilma valuta. Usume, et see tehnika võib laiendada GSH kasutamist paljudes kosmeetikavaldkondades.

Valgendamiseks avastasime, et Cistanche on väga hea valgendava toimega ja Cistanche fenüületanooli glükosiidide ekstraktil on märkimisväärne allareguleeriv toime naha melaniini sünteesi peamise kiirust piirava ensüümi türosinaasi aktiivsusele. Aktiivne toime võib vähendada melaniini graanulite sisaldust nahas (Yang Jianhua et al. West China Pharmaceutical Journal, 2010, 25(05):533-535); uuris Cistanche deserticola viit peamist fenüületanoolglükosiidi monomeeri ja puhastatud Cistanche deserticola benseeni. Leiti, et etanoolglükosiidide üldmõju melaniini graanulite sisaldusele esmaselt kultiveeritud inimese naha melanotsüütides avaldab olulist pärssivat toimet naha melaniini sünteesile; skaneeriti Cistanche deserticola fenüületanoolglükosiidide ultraviolettspektrit ja leiti, et see suudab UVA ja UVB piirkondades ultraviolettkiirgust tõhusalt absorbeerida (Yang Jianhua et al. West China Pharmaceutical Journal, 2011, 26(3):{{9 }}); uuriti Cistanche deserticola fenüületanoolglükosiidide antioksüdantset aktiivsust ja tulemused näitasid, et neil kõigil oli tugev puhastusvabadus. Alus aktiivne, on valgendav toime.

Cistanche tubulosa ostmiseks klõpsake siin

Märksõnad:

Glutatioon; ravimite transdermaalne kohaletoimetamine; hüaluroonhape; mikronõel; naha valgendamine.

1. Sissejuhatus

Glutatioon, looduslikult esinev -glutamüültsüsteinüülglütsiini tiooltripeptiid, mängib olulist rolli rakkude redoksreaktsioonides ning osaleb melaniini sünteesi pärssimises, kaitses reaktiivsete hapnikuliikide eest ja rakkude detoksifitseerimises [1,2]. Kui glutatioon esineb kehas nii oksüdeeritud kui ka redutseeritud kujul, siis redutseeritud glutatioon (GSH) on suure bioloogilise kasulikkusega ühend [3,4].

Näiteks võimaldab selle võime türosinaasi inhibeerimise kaudu pärssida melaniini sünteesi, seda kasutada kosmeetikatoodetes nahka valgendava ainena [5–7]. Lisaks võib GSH-d kasutada immuunsüsteemi tugevdajana, metallimürgistuse vastumürgina ja selliste haiguste nagu fibroos, glaukoom ja artriit ravis [8–11]. Kahjuks piiravad selle halb biosaadavus ja ebameeldiv lõhn GSH kasutamist kliinikutes vaatamata selle paljudele ravirakendustele.

Ravipeptiide manustatakse tavaliselt parenteraalselt, kasutades hüpodermilisi nõelu. Kuid see viis nõuab iga annuse manustamise korral arstiabi ja patsiendi ravisoostumus on süstimise ajal kogetud valu tõttu halb [12,13]. Kuigi GSH läbi naha manustamiseks on kasutatud paikset manustamist, piiravad selle kasutamist selle ebameeldiv lõhn ja võimetus läbida sarvkihti (SC, naha välimine barjäär) [14].

Hiljuti on meditsiinitöötajate suurt tähelepanu pälvinud minimaalselt invasiivne transdermaalse manustamise süsteem mikronõelte (MN) abil, eriti selliste bioaktiivsete ainete, nagu peptiidid ja valgud, kohaletoimetamiseks, mis on labiilsed seedetrakti pH suhtes ja vastuvõtlikud ensümaatilisele lagunemisele [15].

Olemasolevate GSH kohaletoimetamise meetoditega seotud piirangute ületamiseks nägime ette kiiresti lahustuvat MN plaastrit, mis valmistati biopolümeeride desodoreerimise teel, et parandada GSH efektiivsust ja patsiendi ravisoostumust. Biopolümeeride, nagu hüaluroonhape (HA) kõrge biosobivus ja häälestatavad füüsikalis-keemilised omadused muudavad need sobivateks kandidaatideks MN materjalidena [16, 17]. Lisaks võivad multifunktsionaalsete rühmadega biopolümeerid suhelda molekulidega pöörduvate ioonsete interaktsioonide, vesiniksidemete ja van der Waali jõudude kaudu, aidates seeläbi kaasa nende suurele kandevõimele ja headele adsorbeerivatele omadustele [18]. Kuna MN-i sisaldavate ravimite vabanemise kineetikat saab kontrollida kasutatud polümeeride lahustumise või lagunemiskiiruse kaudu, saab lahustuvaid MN-i platvorme kasutada ravimite püsivaks ja pikaajaliseks vabanemiseks transdermaalsel teel [19–22].

Siin kirjeldame uut lähenemisviisi GSH tõhusaks ja lõhnatuks transdermaalseks manustamiseks, kasutades desodoreeritud biopolümeeridest valmistatud lahustuvaid MN plaastreid. Pärast mitmete biopolümeeride sõelumist lõhnatute GSH preparaatide jaoks valiti HA MN materjaliks ja seda kasutati GSH-ga laetud MN plaastrite valmistamiseks. HA MN-idesse laaditud GSH kogusel määrati optimaalne melanogeenne toime ja madalam tsütotoksilisus, mida kinnitasid tsütotoksilisuse ja türosinaasi inhibeerimise uuringud. GSH-ga koormatud HA MN (GSH-HA MN) massiive hinnati nende ühtlase tekstuuri, geomeetria, soovitud mehaanilise tugevuse ja nahka läbistava võime järgi. Pärast GSH-HA MN plaastrite paigaldamist looma nahakoele uuriti nende lahustumisvõimet ja ravimi vabastamise mustreid.

2. Materjalid ja meetodid

2.1. Materjalid

Vähendatud glutatioon (GSH), želatiin (seanahast), 3-(4,5-dimetüültiasool-2-üül)-2, 5- difenüültetrasooliumbromiid (MTT) ja kojic hape (KA) osteti firmalt Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA), naatriumhüaluronaat (100 k, HA) osteti firmalt SNVIA (Busan, Korea). Kondroitiinsulfaat (CS) osteti ettevõttelt Wako Chemicals (Osaka, Jaapan). -Melanotsüüte stimuleeriv hormoon (-MSH) osteti ettevõttest TOCRIS (Bristol, UK) ja apoptoosi tuvastamise komplekt, milles kasutati FITC (fluorestseiini isotiotsüanaat) märgistatud anneksiin V, osteti ettevõttelt BD Biosciences (Bedford, MA, USA). Vedel eelpolümeer (Sylgard 184A) ja kõvendi (Sylgard 184B) polüdimetüülsiloksaani (PDMS) vormimiseks osteti ettevõttelt Dow Corning (Midland, MI, USA). Kõiki kemikaale kasutati ilma täiendava puhastamiseta. Seanahk (karvad eemaldatud) hangiti kohalikust lihapoest ja seda hoiti kuni katsetes kasutamiseni temperatuuril –20 ◦C.

2.2. Rakukultuur

Inimese keratinotsüüdid (HaCaT rakud) ja hiirest pärinevad melanoomi rakuliinid (B16F10), mida kasutati in vitro uuringutes, saadi ATCC-st (Manassas, VA, USA). Rakke kasvatati GSH-vabas DMEM söötmes (Hyclone, Logan, UT, USA), millele oli lisatud 10 protsenti veise loote seerumit (FBS, Hyclone), 2 mM glutamiini (Sigma-Aldrich), 100 U/mL penitsilliini (Hyclone), ja 100 ug/ml streptomütsiini (GenDEPOT, Barker, TX, USA) temperatuuril 37 ◦C niisutatud atmosfääris 5% CO2-ga.

2.3. Lõhna testid

Biopolümeeride vähendavat mõju GSH lõhnale kasutati lõhna hindamise meetodil [4]. Biopolümeeri (naatriumhüaluronaat, želatiin ja kondroitiinsulfaat) kogus fikseeriti 1 0 massiprotsenti kogulahuses ja GSH-d segati erinevates kontsentratsioonides (1.0 protsenti , 2.{101} {9}} protsenti , 2,5 protsenti ja 5,0 massiprotsenti) deioniseeritud (Di) vees. Pärast 30-minutilist segamist lõhnas 10 vabatahtlikust koosnev testpaneel biopolümeeri ja GSH segu sisaldavat lahust. Segaproovide väävlilõhna võrdlemisel kasutati võrdlusalusena ilma biopolümeerita GSH lahust.

Igal vabatahtlikul paluti näidata, kuidas ta tajub segatud lahuse lõhna, kasutades järgmist 5-punktiskaalat: 1: lõhnata, 2: äratuntav lõhn, 3: kergesti märgatav lõhn, 4: tugev lõhn ja 5: intensiivne lõhn. .

2.4. Gaaskromatograafia (GC) mõõtmised

Hindamistulemuste põhjal kvantifitseeriti vabanenud H2S kogus kõigi GSH-HA preparaatide puhul gaasikromatograafiaga (Shimadzu, Tokyo, Jaapan), kasutades impulssraami fotomeetrilist detektorit (PFPD) [23,24]. 1% , 2,5% ja 5% (massi järgi) GSH lahused segati 1 0% (massi järgi) HA-ga ja 1 ml süstiti 10 ml pruuni vaakumviaali. Viaali hoiti 1 tund ahjus temperatuuril 40 ◦C ja seejärel võeti välja. Tekkinud gaas (100 µL) koguti süstla abil ja süstiti Shimadzu GC-sse, mis oli varustatud PFPD-ga. Peamiste väävliühendite eraldamine saavutati 30 m × 0,25 mm id klaaskolonnis (DB-1, J&W) temperatuuril 90 ◦C ja kandevoolu (lämmastik) 1 ml/min. Tuvastamis- ja süstimistemperatuurid olid vastavalt 250 ja 150 ◦C. H2S kogust mõõdeti standardsete proovide abil. PFPD tundlikkus oli H2S puhul 10 ppb. Kinnitati, et kõigi proovide andmed jäävad standardkõvera vahemikku.

2.5. Tsütotoksilisuse testid

GSH tsütotoksilisust hinnati MTT testi ja anneksiin V-FITC värvimise abil. Lühidalt, HaCaT rakke (rakkude arv: 1 × 104 ) töödeldi 0.1, 0.25, {{10}}.5-ga ja 1.0 mg/ml GSH-d DMEM söötmes. Pärast 24, 48 ja 72 tundi kestnud töötlemist lisati rakule 50 µL MTT lahust ja inkubeeriti 1 tund enne söötme aspireerimist. Pärast seda lisati 100 µL dimetüülsulfoksiidi (DMSO) ja elujõuliste rakkude protsendid arvutati, mõõtes MULTISKAN GO lugeja (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) neeldumist lainepikkusel 540 nm. Apoptoosi mõõdeti samaaegse värvimisega anneksiin V-FITC ja propiidiumjodiidiga (PI). HaCaT rakke (1 x 106 ui) töödeldi 0,1, 0,25, 0,5 ja 1,0 mg/ml GSH-ga. Pärast 72-tunnist töötlemist rakud koguti, trüpsiiniti, pesti külma PBS-ga ja värviti 1X sidumispuhvriga, mis sisaldas anneksiin V-FITC lahust ja PI-d. Seejärel inkubeeriti rakke toatemperatuuril 15 minutit pimedas. Värvitud rakke analüüsiti voolutsütomeetria abil 1 tunni jooksul. Nii apoptootilisi kui ka elusrakke analüüsiti Becton Dickinson FACSscan voolutsütomeetri ja BD FACSDiva tarkvara abil (BD Biosciences, San Jose, CA, USA).

2.6. Rakulise melaniini sisalduse ja türosinaasi aktiivsuse määramine

GSH kavandatud valgendavat toimet hinnati, mõõtes selle võimet inhibeerida türosinaasi aktiivsust. Lühidalt öeldes külvati hiirest pärinevad B16F10 melanoomirakud 6-süvendiga kultuuriplaadile kontsentratsiooniga 5.0 × 104 rakku süvendi kohta ja lasti ööseks kinnitamiseks. Rakke töödeldi {{10}} (tühi), 0,1, 0,25, 0,5 ja 1,0 mg/ml GSH ja 10 µM kojichappega ( KA) positiivse kontrollina 4 tundi ja seejärel stimuleeriti -MSH-ga (1 uM) 72 tundi, et indutseerida türosinaasi aktiivsust. Pärast söötme eemaldamist lahustati rakud 500 µL 1 N NaOH-s ja inkubeeriti 1 tund 60 °C juures melaniini lahustamiseks. Melaniinisisaldus määrati neeldumise mõõtmisega 405 nm juures. Türosinaasi aktiivsuse jaoks lüüsiti rakud 100 µl 50 mM naatriumfosfaatpuhvris (pH 6,5), mis sisaldas 5 µl 1 protsenti Triton X-100 ja 5 µL 0,1 mM fenüülmetüülsulfonüülfluoriidi. Pärast tsentrifuugimist 10,000 g (30 min, 4 ◦C) kanti supernatandid 20 µl l-3,4-dihüdroksüfenüülalaniiniga (l-DOPA) {{ 44}}süvendiga plaat ja neeldumist mõõdeti 492 nm juures temperatuuril 37 ◦C.

2.7. GSH-MN plaastrite valmistamine

Kuulikujulised GSH-MN massiivid (10 × 10 MNs/cm2) valmistati korduvkasutatava PDMS-vormiga 10-protsendilise HA vesilahuse lahustivalamise teel. erineva GSH kontsentratsiooniga lahused (0 protsenti , 1,0 protsenti , 2,5 protsenti ja 5,0 massiprotsenti). Kuulikujuliste õõnsustega negatiivsed PDMS-vormid kopeeriti mikrotöötlusega valmistatud metallist MN-massiividest [16]. MN-i moodustavad lahused (350 µL HA või HA/GSH lahuseid) pipeteeriti PDMS-vormi ja kuivatati temperatuuril 40 ◦C 12 tundi pärast degaseerimist vaakumis. Kuivatatud MN-massiivid eemaldati õrnalt vormist. Valmistatud MN-massiivide morfoloogiat iseloomustati digitaalse (AM413ZT, Dino-Lite, Taiwan) ja optilise (Eclipse TS100, Nikon, Jaapan) mikroskoopia abil. HA MN-e, mis sisaldasid 0, 1, 2,5 ja 5 mg/ml GSH-d, nimetati GSH0-HA MN, GSH1-HA MN, GSH2.5-HA MN ja GSH5-HA MN vastavalt.

2.8. Luumurdude testid

Üksikud HA MN-i ja GSH-ga laetud HA MN-id (GSH0-HA MN, GSH1-HA MN ja GSH2.5-HA MN) fikseeriti tsüanoakrülaatliimiga (Loctite 4{{). 7}}1, Loctite Corp, Dublin, Iirimaa), et kinnitada universaalse testimismasina (UTM, A&D 5000H, A&D Sales Corp, Daegu, Korea) alumisele käepidemele asetatud kinnitusnukk. Mehaanilise testeri ülemist käepidet nihutati aksiaalselt allapoole MN otsa suunas kiirusega 0,1 mm/min. Mõõtmisjõudu mõõdeti sondi nihke kiiruse funktsioonina ja väljendati njuutonites (N).

2.9. Naha sisestamise test

Naha sisestamise test viidi läbi, et kontrollida MN-ide läbitungimisvõimet, moonutuste tõenäolist ulatust ja võimalikku koe läbipaindumist selle sisestamise ajal. GSH0-HA MN, GSH1-HA MN ja GSH2.5-HA MN kinnitati tsüanoakrülaatliimiga UTM-i ülemise käepideme abil metallpinnale ja sisestati 10 mm/min jõudu väljalõigatud sea nahale (3 × 3 cm2, ~ 2 mm paksune), mis asetatakse mehaanilise testeri alusele [25]. Sea nahka kasutati pärast nahaaluse rasvakihi eemaldamist skalpelliga.

2.10. Lahustumiskatse

GSH2.{1}}HA MN kanti sea nahale (3 × 3 cm2) mitmel etteantud ajahetkel (3, 5, 7 ja 10 minutit). Pärast MN-plaastrite eemaldamist mõõdeti optilise mikroskoobi abil (Eclipse TS100, Nikon, Tokyo, Jaapan) MN-otste lahustunud kõrgust.

GSH2 löögimärgi kinnitamiseks.{1}}HA MN plaastrid lisati MN-ide valmistamiseks 1 ml 2,5 massiprotsendilisele GSH segalahusele 0,5 mg värvainet (rodamiini B). . Seejärel valmistati MN-massiivi valmistamine, kasutades värviga segatud lahust, kasutades sama ülalkirjeldatud meetodit. MN-massiividest moodustatud löögimärki, nende asukohta sea nahka translatsiooni ajal ja koe läbipainde astet analüüsiti digitaalse mikroskoobi all (AM413ZT, Dino-Lite, Taiwan). Kõiki muutusi MN-i morfoloogias pärast sisestamist uuriti optilise mikroskoobi all.

2.11. Laadimisvõimsus ja kapseldamise efektiivsus

HA MN-i laaditud GSH koguse määramiseks lõigati vastavalt GSH{{0}}HA MN ja GSH2.5-HA MN MN otsad ja lahustati täielikult PBS-is (pH 7,4). ) 24 tundi. GSH kogus MN otsikutes määrati 10 µL proovilahuse analüüsimisel kõrgsurvevedelikkromatograafia abil (HPLC, e2695, Waters, USA) SunFire C18 kolonnis (100Å, 5 µm, 4,6). × 250 mm, Waters). HPLC töötamisel kasutati atsetonitriilvett (5:95) ja 0,1% trifluoroäädikhapet (TFA) liikuva faasina voolukiirusega 0,8 ml/min. HPLC andmete põhjal arvutati laadimisvõime (LC) ja kapseldamise efektiivsus (EE) järgmiste võrrandite abil: Koormusvõime ( protsenti )=men mtot × 100 (1). Kapseldamise efektiivsus ( protsenti )=mehed min × 100 (2)

kus mehed esindavad kapseldatud ravimi kogust MN otsikutes, siis suurem osa on MN otsikute kogumass ja min tähistab ravimi kogust MN-i moodustavates lahustes [26].

2.12. In vitro GSH naha läbilaskvustestid

GSH2-st vabanenud redutseeritud GSH naha ex vivo läbitungimise kineetika uurimiseks.5-HA MN plaastrid viidi läbi staatilise difusiooni Franzi rakutestid, et arvutada ajast sõltuv GSH vabanemise kiirus GSH2 kaudu.{2}} {5}}HA MN-id ja selle difusioon läbi naha koos GSH-HA võrdluslahusega. GSH2.{8}}HA MN plaastrid ja 350 µL GSH2.5-MN valmistamisel kasutatud HA lahus kanti välja lõigatud Sprague-Dawley (SD) roti nahale (paksus ~2 mm) paigutatakse vastavalt Franzi difusioonikambri doonori- ja retseptorkambri vahele. Pärast GSH2.{15}}HA MN plaastrite sisestamist roti nahasse kanti ravimi kohaletoimetamise ajal MN-i alusele hüdrokolloidne kleepplaaster (NeoDerm Roll, EVERAID, Yangsan, Korea). Külgõlaga retseptorkamber täideti 22 ml värske PBS puhvriga (pH 7,4) ja seda hoiti temperatuuril 37 ◦C [27]. Üks milliliiter proovi võeti igal ajahetkel (0,5, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 36 ja 48 tundi) Franzi raku retseptorkambrist ja täideti uuesti võrdse koguse värske PBS-ga (pH 7,4). ). GSH2.{34}}HA MN plaastrid eemaldati roti nahalt 1 tunni pärast. MN otsast vabanenud ja läbi roti naha imbunud GSH kogust analüüsiti HPLC abil, kasutades ülalkirjeldatud protokolli. GSH tuvastati neeldumise mõõtmisega 385 nm juures ja ravimi kontsentratsiooni väljendati mg-des.

2.13. Statistiline analüüs

Kõik tulemused väljendatakse keskmisena ± standardhälbe (SD) ja analüüsitakse Studenti t-testi abil. Olulisuse tasemeks määrati p < 0,05.

3. Tulemused ja arutelu

3.1. Skriinimistestid desodoreeritavate polümeeride valimiseks

Lõhna intensiivsuse põhjal viidi punktianalüüs läbi skaalal 1–5, et hinnata H2S vabanemist vaba GSH ja GSH-biopolümeeri koostiste automaatsest lagunemisest. Katse viidi läbi, kaasates 10 juhuslikult valitud tervet vabatahtlikku kummastki soost. Tugevat lõhna seostati suurema vabanenud H2S kogusega ja vastupidi. Kõik želatiini (4,75 ± 0,2) ja CS-GSH (3,25 ± 0,95) kontsentratsioonid (1.{11}}–5.{14}} massiprotsenti) ravimvormide hind on kõrgem, samas kui HA-GSH (1,5 ± 0,35) oli madalam kui ainult GSH (2,75 ± 0,61; joonis 1a). Želatiin-GSH ja CS-GSH preparaatide kõrged hinded võrreldes ainult GSH-ga tulenesid lisaks vabanenud H2S lõhnale ka nende iseloomulikest lõhnadest.

Hiljem hinnati lõhnaskooride põhjal vabanenud H2S (ppm-des) kvantitatiivselt GC abil GSH-HA preparaadi jaoks erinevates kontsentratsioonides. Leiti, et vabanenud H2S kogus on minimaalselt 1.0 protsenti ja 2,5 protsenti (0,55 ± 0.01 ja {{13} }.49 ± 0.03 ppm) ja maksimaalselt 5.0 protsenti (1.03 ± 0.{{27} }1 ppm) GSH-d preparaadis. Kõikide kontsentratsioonide puhul leiti, et väärtused olid väiksemad kui ainult GSH puhul (0,59 ± 0.03, 0,75 ± 0,04 ja 1,15). ± 0,05 vastavalt 1,0 protsenti, 2,5 protsenti ja 5 protsenti GSH-st; joonis 1b). Selle tulemuse põhjuseks oli see, et HA-s sisalduv asendatud Na plus reageerib GSH tioolrühmaga reaktsioonivalemi kaudu, mis on näidatud lisajoonisel S1. Kinnitati, et lõhna vähenemise põhjustas H2S tootmise vähenemine (täiendav joonis S1) [28, 29]. Need tulemused näitavad, et HA-l on želatiini ja CS-ga võrreldes parem deodorant, mistõttu valiti see käesolevas uuringus MN-ide valmistamiseks. Kuna HA maksimaalset desodoreerimisvõimet vabanenud H2S puhul täheldati 1,0 protsendi, 2,5 protsendi ja 5,0 protsendi GSH-HA preparaatide puhul (joonis 1b), valiti MN-de valmistamiseks need kolm kontsentratsiooni.

3.2. GSH mõju tsütotoksilisusele ja türosinaasi aktiivsusele

MTT testi kasutati selleks, et teha kindlaks, kas GSH on HaCal suhtes tsütotoksiline. Fluorestsents-aktiveeritud rakusorteerija (FACS) analüüs viidi läbi, kasutades anneksiin V, mis spetsiifiliselt ja tugevalt tuuleb rakupinna PI-le, et kinnitada, kas täheldati apoptootilist või nekrootilist rakusurma (30GSH-ga töötlemine0 .2-1.0 mg/mL ei muutnud oluliselt elujõuliste rakkude osakaalu 72 °C juures võrreldes vehiikuliga töödeldud rakkudega (joonis 2a). GSH tsütotoksilist toimet HaCaT rakkudele ei kinnitanud vool. tsütomeetria analüüs anneksiin V abil. HaCaT rakkude kokkupuude 0, 0,1, 0,25, 0,5 või 1 mgmL GSH-ga 72 tunni jooksul põhjustas kontsentratsioonist sõltuv apoptoosi esilekutsumine (joonis 2b, c) GSH-ga kokkupuude ei põhjustanud apoptootiliste rakkude arvu olulist suurenemist (7,90 pluss 1.02-13,99 pluss 0,37 protsenti ) ja elusrakkude osakaalu vähenemine (88,38 pluss 1.02-80,81 pluss 0,67 protsenti) võrreldes kandjaga töödeldud rakkudega (4,85 pluss 0,72 protsenti ja 90,47 pluss 0,93 protsenti apoptootiliste ja vastavalt elusrakud; joonis 2b, c). Need tulemused viitavad sellele, et GSH ei ole toksiline inimese keratinotsüütidele ja seda võib ohutult kasutada inimese nahal.

Türosinaas on melaniini sünteesi eest vastutav ensüüm. GSH valgendavat toimet hinnati nii melaniini tootmise pärssimise määra kui ka türosinaasi kiirust piirava ensüümi aktiivsuse mõõtmisega melanogeneesis. B16F10 rakke töödeldi eelnevalt 10 uM KA ja GSH-ga (0,1–1,0 mg/ml) 4 tundi ja seejärel stimuleeriti -MSH-ga (1 uM) 72 tundi. GSH-ravi pärssis oluliselt -MSH-ga indutseeritud melaniini tootmist (joonis 3a). Selle leiuga vähenes -MSH-indutseeritud türosinaasi aktiivsus (345,60 ± 18,29 protsenti GSH-ravi puudumisest) märkimisväärselt 207-ni.{22}} ± 2,78 protsenti 1 mg/ml GSH-ga ravimisel (joonis 3b).

3.3. GSH-ga koormatud HA MN-ide valmistamine ja nende mehaanilised omadused

GSH kohaletoimetamiseks läbi naha minimaalselt invasiivsel viisil valisime HA MN-materjaliks, lähtudes selle võimest vähendada H2S, mida kinnitasid punktitestid ja gaasikromatograafilised andmed (joonis 1). HA-d ja GSH-d sisaldavaid MN-i moodustavaid lahuseid kasutati GSH-ga laetud HA MN-i (GSH-HA MN) massiivide valmistamiseks. Massiivid valmistati lahustivalu meetodil, kasutades kuulikujuliste õõnsustega PDMS-vormi. GSH-MN massiividel (100 MNs/cm2) oli ühtlane muster kõrgusega 770 ± 5 µm, aluse läbimõõduga 172,25 ± 2,5 µm ja otsa läbimõõduga 7,8 ± 2,5 µm nurgaga 40° ± 2. (Joonis 4a). MN-i geomeetria määrati kindlaks, et tagada SC-kihi tungimine ja GSH transdermaalne kohaletoimetamine minimaalse veresoonte või neuronaalse kahjustusega, et vältida valu ja kapillaaride verejooksu manustamiskohas. GSH-HA MN-ide ühtsed omadused saadi, kui MN-id valmistati 2,5 protsenti GSH-d sisaldavate MN-i moodustavate lahuste abil, kuid GSH kõrge kontsentratsiooniga (5 protsenti) valmistamisel täheldati mõningaid painutatud MN-e (täiendav joonis S2).

GSH-HA MN-ide mehaanilisi omadusi uuriti tihendusrežiimis. UTM-i alumisele pinnale tsüanoakrülaatliimiga kinnitatud üksik MN suruti aksiaalselt kokku tasapinnalise metallplaadiga, mis oli kinnitatud masina ülemise käepideme abil kiirusega 0,1 mm/min (joonis 4a–c) . Läbilaskvusjõud ehk jõud, mis on vajalik selleks, et materjal kaotaks oma elastsuse, määrati väärtuseks 0,25, 0,39 ja 0,4{{1{{17 }}}} N hälbega ±0.03 GSH0-HA MN, GSH1-HA MN ja GSH2 jaoks.5-HA MN-id vastavalt (joonis 4d). Sisestamisjõud leiti olevat 0,36 ± 0.003, 0,39 ± 0,015 ja 0,37 ± 0,005 GSH0-HA MN-ide, GSH{{30 }}HA MN-id ja GSH2.{32}}HA MN-id. Leiti, et nii voolavusjõud kui ka sisestusjõud on piisavad MN-ide sisestamiseks sea nahka ilma luumurdude, moonutuste või koe läbipaindeta.

3.4. GSH-HA MN-ide in vitro lahustumistestid

Biopolümeeri lahustumisaeg määrab iga preparaadi puhul ravimi vabanemise mustri ja toime alguse. GSH vabanemiseks kuluva aja ennustamiseks sisestati sea nahka üks MN (GSH, 5-HA), mis on struktuurilt sarnane inimese nahaga. Mikroskoopiline analüüs näitas MN-ide ajast sõltuvat lahustumist. Pärast GSH-MN-ide nahale kandmist 12 minutiks lahustusid MN-otsad täielikult, mis käivitas selle kiire vabanemise mustri (joonis 5a, b). GSH 5-HA MN plaastrite nahale tungimise kinnitamiseks kanti sea nahale 20 N 1 minuti jooksul rodamiinvärviga laetud MN plaastrid (1,5 x 1,5 cm). Pärast värviga laetud MN-plaastrite eemaldamist täheldasime igale nõelale vastavat värvilaikude massiivi, mis kinnitas GSH 5-HA MN-ide sisestamist nahka (joonis 5c).

Laadimisvõime viitab ravimi maksimaalsele kogusele, mida saab manustamiskandjale allutada, ja määrab selle laadimise efektiivsuse. GSH-HA MN plaastrite laadimisvõime määratletakse kui laetud ravimi (GSH) mass MN-otstes jagatuna GSH-HA MN-otsikute kogumassiga. Laadimise efektiivsuse kontrollimiseks lõigati GSH-ga laetud MN-otsad ja lahustati PBS-is (pH 7,4) ning otsikutesse laaditud GSH kogust analüüsiti HPLC-ga. GSH laadimiskogus 100 MN otsas oli {{10}},29 ± {{20}}.03 mg ja 0,56 ± 0,03 mg vastavalt GSH1-HA MN plaastritele ja GSH2.{16}}HA MN plaastritele. Arvestades GSH-MN otsikute kogumassi (100 MN, 2 ± 0,2 mg), oli kandevõime 11,26 ± 1,24 protsenti ja 21,33 ± 1,13 protsenti, samas kui kapseldamise efektiivsus oli 8,36 ± 0,92 protsenti ja 6,3 protsenti. GSH1-HA MN ja GSH2.5-HA MN vastavalt (tabel 1). Sarnased väärtused HA: GSH massisuhte (10:1 või 10:2,5) MN-i moodustavates lahustes ja GSH laadimisvõime vahel MN-plaastrites viitavad GSH ühtlasele jaotusele MN-plaastris.

3.5. GSH-HA MN plaastrite ex vivo naha läbilaskvuse test

GSH vabanemise alguse ja kestuse hindamiseks GSH-st 5-HA MN-idest viidi Franzi rakuuuring läbi 48 tunni jooksul, asetades SD-roti nahk simuleeritud füsioloogilistesse tingimustesse (joonis 6). GSH 5-HA MN-id näitasid alguses suhteliselt kiiret lineaarset vabanemise kineetikat12 tundi, millele järgneb aeglane vabanemiskiirus aja jooksul.

Läbi naha läbinud GSH kogus pärast MN-i manustamist oli katse esialgse 12 tunni jooksul ~ 1, 4 mg ja 48 tunni jooksul oli see ~ 1, 6 mg. Tarniti GSH kogus, mis oli suurem kui MN otsikutes laaditud kogus. See kogus ei sisalda mitte ainult GSH2-sse laetud GSH-d.{7}}HA MN otsikud, vaid ka ravimimahutina aluskihis sisalduvat GSH-d. Seevastu GSH-HA lahust manustati aeglaselt väikestes kogustes (~0,2 mg), kuna GSH läbis nahka halvasti. Kuna inimese kasvuhormooni transdermaalne manustamine, kasutades karboksümetüültselluloosist ja trehaloosist valmistatud MN-e, näitas pärast MN-i manustamist lühikest tmax-i (~ 30 min) ja näitasid sarnaseid farmakokineetilisi profiile subkutaanse süstimise omaga [19], siis GSH-HA plaaster koos kiire veega. imendumisomadused oleksid rakendatavad süsteemse GSH kohaletoimetamise korral. In vitro uuringu põhjal inhibeeris ravi 1 mg/ml GSH-ga oluliselt melaniini tootmist ja türosinaasi aktiivsust. Arvestades interstitsiaalse vedeliku väikest mahtu (~150 µL/cm2) nahas [31], võib HA MN plaastrite kaudu lokaalselt manustatud GSH (1,6 mg GSH/1 cm2 MN plaaster) toimida MN lahustumisprotsessis antioksüdandina. Kuna MN-i laaditud GSH vabanemiskineetikat saab kontrollida MN-materjali ristsidumise tihedusega [32, 33], oleks paisuv MN-platvorm kasulik GSH efektiivseks kohaletoimetamiseks minimaalsete kõrvalmõjudega.

4. Järeldused

Deodoriseerimisvõime (skooriväärtus) ja GC tulemuste põhjal valisime HA, et töötada välja biolagunevad MN plaastrid GSH lõhnatu transdermaalse manustamise jaoks. HA varjas GSH ebameeldivat lõhna tõhusamalt kui želatiin ja CS. HA-MN-i plaaster (GSH2.{2}}HA) oli piisavalt vastupidav, et tungida läbi naha kahjustamata. Leiti, et GSH vabanemine HA-MN-i plaastritest (GSH1-HA ja GSH25-HA) oli teatud aja jooksul ühtlane, nagu näitasid vastavad katsed. Tsütotoksilised ja türosinaasi inhibeerivad uuringud näitasid, et GSH kontsentratsioon 1 mg/ml on naha valgendamiseks ohutu ja tõhus. Kokkuvõttes on selles uuringus väidetud eksperimentaalsete andmete põhjal tõestatud välja töötatud HA MN plaastrite kui paljulubava platvormi teostatavust GSH või kahjulike või vastuvõetamatute organoleptiliste omadustega ravimite transdermaalseks manustamiseks.

Täiendavad materjalid:

Joonis S1: naatriumhüaluronaadi mõju lõhna vähendamisele, joonis S2: GSH5 -HA MN massiivi kujutised.

Autori kaastööd:

Kontseptualiseerimine, YL, Y.-SJ ja SYY; metoodika, YL, SHK, K.-YS ja SK; Andmete kureerimine, CK ja HL; Kirjutamine – algne mustand, YL, SK, SYY; arvustus ja toimetamine, SK, Y.-SJ, K.-YS ja SYY; Järelevalve, SYY Kõik autorid on käsikirja avaldatud versiooni läbi lugenud ja sellega nõustunud.

Rahastamine:

Seda uurimistööd toetas Korea Riiklik Uurimisfond (NRF), mida rahastas teadus- ja IKT-ministeerium (NRF-2018R1A4A1025623), ning riiklik loomeuuringute algatusprogramm Korea riikliku uurimisfondi (NRF) kaudu. rahastab teaduse, IKT ja tulevikuplaneerimise ministeerium (NRF-2017R1D1A3B03035360).

Huvide konfliktid:

SYY on patendi leiutaja, mis on litsentsitud ettevõttele (SNVIA), mis arendab lõhnatuid GSH kosmeetikatooteid. Seda võimalikku huvide konflikti haldab Pusani riiklik ülikool.

Viited

1. Forman, HJ; Zhang, H.; Rinna, A. Glutatioon: Ülevaade selle kaitsvatest rollidest, mõõtmisest ja biosünteesist. Mol. Asp. Med. 2009, 30, 1–12. [CrossRef].

2. Hayes, JD; McLellan, LI Glutatioon ja glutatioonist sõltuvad ensüümid esindavad koordineeritult reguleeritud kaitset oksüdatiivse stressi vastu. Vaba Radik. Res. 1999, 31, 273–300. [CrossRef].

3. Rahman, I.; Kode, A.; Biswas, SK Assay glutatiooni ja glutatiooni disulfiidi tasemete kvantitatiivseks määramiseks ensümaatilise ringlussevõtu meetodil. Nat. Protoc. 2006, 1, 3159. [CrossRef].

4. Yano, H. Oksüdeeritud ja redutseeritud glutatiooni võrdlus riisitaina leiva valmistamise omadustes. J. Food Sci. 2012, 77, C182–C188. [CrossRef] [PubMed].

5. Weschawalit, S.; Thongthip, S.; Phutrakool, P.; Asawanonda, P. Glutatioon ja selle vananemisvastane ja melanogeenne toime. Clin. Kosmeetika. Uurige. Dermatol. 2017, 10, 147. [CrossRef] [PubMed].

6. Villarama, CD; Maibach, HI Glutatioon depigmenteeriva ainena: ülevaade. Int. J. Cosmet. Sci. 2005, 27, 147–153. [CrossRef] [PubMed].

7. Arjinpathana, N.; Asawanonda, P. Glutatioon suukaudse valgendajana: Randomiseeritud topeltpime platseebokontrollitud uuring. J. Dermatol. Ravida. 2012, 23, 97–102. [CrossRef] [PubMed].

8. Droge, W.; Breitkreutz, R. Glutatioon ja immuunfunktsioon. Proc. Nutr. Soc. 2000, 59, 595–600. [CrossRef] [PubMed].

9. Patrick, L. Elavhõbeda mürgisus ja antioksüdandid: Osa 1: Glutatiooni ja alfa-lipoehappe roll elavhõbeda mürgistuse ravis. Altern. Med. Rev. 2002, 7, 456–472.

10. Chen, JZ; Kadlubar, FF Uus vihje glaukoomi patogeneesile. Olen. J. Med. 2003, 114, 697–698. [CrossRef].

11. Hassan, MQ; Hadi, RA; Al-Rawi, ZS; Padron, VA; Stohs, SJ Glutatiooni kaitsesüsteem reumatoidartriidi patogeneesis. J. Appl. Toksikool. 2001, 21, 69–73. [CrossRef] [PubMed].

12. Seong, KY; Seo, MS; Hwang, DY; O'Cearbhaill, ED; Sreenan, S.; Karp, JM; Yang, SY Isekleepuv kuulikujuline mikronõela plaaster insuliini kontrollitud transdermaalseks manustamiseks. J. Kontroll. Väljaanne 2017, 265, 48–56. [CrossRef] [PubMed].

13. Jin, J.; Zhu, LL; Chen, M.; Xu, HM; Wang, HF; Feng, XQ; Zhu, XP; Zhou, Q. Ravimi manustamisviisi optimaalne valik seoses intravenoosse, intramuskulaarse ja subkutaanse süstimisega. Patsient eelistab. Adherence 2015, 9, 923–942. [PubMed].

14. Bouwstra, JA; Honeywell-Nguyen, PL; Gooris, GS; Ponec, M. Nahabarjääri struktuur ja selle moduleerimine vesikulaarsete preparaatide abil. Prog. Lipid Res. 2003, 42, 1–36. [CrossRef].

15. Jiskoot, W.; Randolph, TW; Volkin, DB; Middaugh, CR; Schöneich, C.; Winter, G.; Friess, W.; Crommelin, DJ; Carpenter, JF Valkude ebastabiilsus ja immunogeensus: takistused süstitavate valgu manustamissüsteemide kliiniliseks rakendamiseks püsiva vabanemise tagamiseks. J. Pharm. Sci. 2002, 101, 946–954. [CrossRef].

16. Liu, S.; Jin, MN; Quan, YS; Kamiyama, F.; Katsumi, H.; Sakane, T.; Yamamoto, A. Hüaluroonhappest valmistatud uudsete mikronõela massiivide väljatöötamine ja omadused ning nende kasutamine insuliini transdermaalsel manustamisel. J. Kontroll. Väljaanne 2012, 161, 933–941. [CrossRef].

17. Wang, C.; Jah, Y.; Hochu, GM; Sadeghifar, H.; Gu, Z. Enhanced vähi immunoteraapia PD1-vastase antikeha mikronõelaga plaastri abil. Nano Lett. 2016, 16, 2334–2340. [CrossRef].

18. Dassanayake, RS; Acharya, S.; Abidi, N. Biopolümeeripõhised materjalid polüsahhariididest: omadused, töötlemine, iseloomustus ja sorptsioonirakendused. Advanced Sorption Process Applications; Edebali, S., toim.; IntechOpen: London, Suurbritannia, 2018; lk 1–24.

19. Lee, JW; Choi, SO; Felner, EI; Prausnitz, MR Lahustuv mikronõelaplaaster inimese kasvuhormooni transdermaalseks manustamiseks. Väike 2011, 7, 531–539. [CrossRef].

20. Donnelly, RF; Singh, TRR; Garland, MJ; Migalska, K.; Majithiya, R.; McCrudden, CM; Kole, PL; Mahmood, TMT; McCarthy, HO; Woolfson, AD Hüdrogeeli moodustavad mikronõela massiivid ravimite transdermaalse manustamise parandamiseks. Adv. Funktsioon. Mater. 2012, 22, 4879–4890. [CrossRef].

21. Kim, JD; Kim, M.; Yang, H.; Lee, K.; Jung, H. Piiskade kaudu sündinud õhu puhumine: uudne lahustuvate mikronõelte valmistamine. J. Kontroll. Väljaanne 2013, 170, 430–436. [CrossRef].

22. Kim, H.; Seong, KY; Lee, JH; Park, W.; Yang, SY; Hahn, SK Biolagunev mikronõelaplaaster, mis annab antigeense peptiid-hüaluronaadi konjugaati vähi immunoteraapiaks. ACS Biomater. Sci. Eng. 2019, 5, 5150–5158. [CrossRef].

23. Du, X.; Song, M.; Rouseff, R. Uute maasika väävli lenduvate ainete tuvastamine ja muutused küpsemise ajal. J. Agric. Food Chem. 2011, 59, 1293–1300. [CrossRef] [PubMed].

24. Boczkaj, G.; Kaminski, M.; Przyjazny, A. Protsessi juhtimine ja oksüdatsioonijärgsete heitvee oksüdatsioonikineetika uurimine, kasutades gaasikromatograafiat impulssleegi fotomeetrilise detekteerimisega (GC-PFPD). Ind. Chem. Res. 2010, 49, 12654–12662. [CrossRef].

25. Davis, SP; Landis, BJ; Adams, ZH; Allen, MG; Prausnitz, MR Mikronõelte sisestamine nahka: sisestamisjõu ja nõela murdumisjõu mõõtmine ja ennustamine. J. Biomech. 2004, 37, 1155–1163. [CrossRef] [PubMed].

26. Chandrasekharan, A.; Hwang, YJ; Seong, KY; Park, S.; Kim, S.; Yang, SY Happega töödeldud vees lahustuv kitosaan, mis sobib mikronõelaga intrakutaanseks manustamiseks. Pharmaceutics 2019, 11, 209. [CrossRef] [PubMed].

27. Kim, B.; Seong, KY; Sina, mina; Selvaraj, V.; Yim, SG; O'Cearbhaill, ED; Jeong, U.; Yang, SY puutetundliku toimega transdermaalne manustamisplaaster naha läbitungimise kvantitatiivseks kontrollimiseks. Sens. Täiturmehhanismid B Chem. 2018, 256, 18–26. [CrossRef].

28. Jensen, GA; Adams, DF; Stern, H. Vesiniksulfiidi ja metüülmerkaptaani absorptsioon lahjendatud gaasisegudest. J. Õhusaaste. Kontroll Assoc. 1966, 16, 248–253. [CrossRef].

29. Onda, K.; Takeuchi, H.; Kobayashi, T.; Yokota, K. Vesiniksulfiidi ja süsinikdioksiidi samaaegne imendumine naatriumhüdroksiidi vesilahustes. J. Chem. Eng. Jpn. 1972, 5, 27–33. [CrossRef].

30. Kabakov, AE; Gavai, VL Rakusurma ja ellujäämise testid. In Chaperones; Humana Press: New York, NY, USA, 2018; lk 107–127.

31. Samant, PP; Prausnitz, MR Nahast interstitsiaalse vedeliku proovide võtmise mehhanismid mikronõela plaastri abil. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2018, 115, 4583–4588. [CrossRef].

32. Yang, SY; O'Cearbhaill, ED; Sisk, GC; Park, KM; Cho, WK; Villiger, M.; Bouma, BE; Pomahac, B.; Karp, JM Bio-inspireeritud punduv mikronõelliim kudedega mehaaniliseks lukustamiseks. Nat. Commun. 2013, 4, 1702. [CrossRef].

33. Migdadi, EM; Courtenay, AJ; Tekko, IA; McCrudden, MT; Kearney, MC; McAlister, E.; McCarthy, HO; Donnelly, RF hüdrogeeli moodustavad mikronõelad suurendavad metformiinvesinikkloriidi transdermaalset manustamist. J. Kontroll. Väljalase 2018, 285, 142–151. [CrossRef] [PubMed].

Yechan Lee 1, Sujeet Kumar 1, Sou Hyun Kim 2, Keum-Yong Seong 1, Hyeseon Lee 1, Chaerin Kim 1, Young-Suk Jung 2* ja Seung Yun Yang 1,*

1 Biomaterjaliteaduse osakond, elu ja tööstuse lähenemise instituut, Pusan ​​National University, Miryang 50463, Korea.

2 Farmaatsiakolledž, Pusani riiklik ülikool, Busan 46241, Korea.

Saabunud: 31. detsember 2019; Vastu võetud: 22. jaanuar 2020; Avaldatud: 27. jaanuaril 2020

For more information:1950477648nn@gmail.com