Norwogoniin nõrgendab hüpoksiast põhjustatud oksüdatiivset stressi ja apoptoosi PC12 rakkudes

Rohkem informatsiooni:ali.ma@wecistanche.com

Abstraktne

Taust: Norwogoniin on looduslik flavoon, millel on skeleti struktuuris kolm fenoolset hüdroksüülrühma ja millel on suurepäraneantioksüdanttegevust. Siiski jääb norwogoniini neuroprotektiivne toime ebaselgeks. Siin uurisime norwogoniini kaitsevõimet PC12 rakkude hüpoksiast põhjustatud oksüdatiivsete kahjustuste eest. Meetodid: Rakkude elujõulisust ja apoptoosi uuriti vastavalt MTT testiga ja anneksiin V-FITC/PI värvimisega. Reaktiivsete hapnikuliikide (ROS) sisaldust mõõdeti DCFH-DA testiga. Laktaatdehüdrogenaas (LDH), malondialdehüüd (MDA) jaantioksüdantensüümi tasemed määrati kaubanduslike komplektide abil. Seotud geenide ja valkude ekspressiooni mõõdeti vastavalt reaalajas kvantitatiivse PCR ja Western blot analüüsiga. Tulemused: Leidsime, et norwogoniin leevendas hüpoksiast põhjustatud vigastusi PC12 rakkudes, suurendades rakkude elujõulisust, vähendades LDH vabanemist ja parandades muutusi raku morfoloogias. Norwogonin tegutses ka anantioksüdanteemaldades ROS-i, vähendades MDA tootmist, säilitades superoksiiddismutaasi (SOD), katalaasi (CAT) ja glutatioonperoksidaasi (GPx) aktiivsust ning vähendades HIF{0}} ja VEGF ekspressioonitasemeid. Lisaks takistas wogoniin raku apoptoosi, inhibeerides kaspaasi -3, tsütokroom c ja Baxi ekspressioonitasemeid, suurendades samal ajal Bcl-2 ekspressioonitaset ja Bcl-2/Bax suhet. Järeldused: Norwogoniin nõrgendab hüpoksiast põhjustatud vigastusi PC12 rakkudes, kustutades ROS-i, säilitadesantioksüdantensüüme ja inhibeerib mitokondriaalset apoptoosi rada.

Märksõnad: Norwogonin,Antioksüdantne aktiivsus, Hüpoksia, Oksüdatiivne stress, Apoptoos

Taust

Aeroobsed organismid vajavad energia tootmiseks hapnikku (O2). Hüpoksiat määratletakse kui ebapiisavat hapnikuvarustust koe rakufunktsiooni säilitamiseks ja see esineb sageli teatud füsioloogilistes olukordades, nagu kõrgel kõrgusel [1], ja paljudes patoloogilistes olukordades, nagu insult [2]. Aju on eriti tundlik hüpoksiast põhjustatud vigastuste suhtes, kuna selle hapnikutarbimine on rikas, küllastumata rasvhapete sisaldus on madal jaantioksüdantmahutavus [3]. Üha rohkem tõendeid on näidanud, et hüpoksia võib põhjustada ajule kahjulikke mõjusid [4–6].

Linlin Jing, Rongmin Gao, Jie Zhang, Dongmei Zhang, Jin Shao, Zhengping Jia ja Huiping Ma

Farmaatsia osakond, PLA 940. haigla ühise logistika tugijõud, Lanzhou 730050, Gansu, Hiina

Oksüdatiivset stressi ja apoptoosi peetakse kaheks hüpoksiast põhjustatud vigastuse soodustavaks teguriks [7, 8]. On teatatud, et hüpoksiaga kokkupuude suurendab rakusiseste reaktiivsete hapnikuliikide (ROS) tootmist, mis hõlbustab oksüdatiivset stressi. Liigne ROS, nagu superoksiidi anioon (O2−˙ ), vesinikperoksiid (H2O2) ja hüdroksüülradikaal (HO•), põhjustab struktuurseid ja funktsionaalseid rakulisi muutusi, rünnates lipiide, membraane, valke ja DNA-d, ning põhjustab seejärel rakukahjustusi. 9].

Antioksüdantide jaoks klõpsake Cistanches

Samal ajal hõlbustab ületoodetud ROS ka mitokondriaalse läbilaskvuse üleminekupooride (mPTP) avanemist [10] ja pro-apoptoosi valkude ülekandmist mitokondriaalsele välismembraanile, mis kutsub esile mitokondriaalsete membraanide depolarisatsiooni ja tsütokroom c vabanemise [11]. Need muutused põhjustavad lõpuks mitokondriaalset apoptoosi [12]. Seega arvatakse, etantioksüdandidvõime inhibeerida või kõrvaldada liigset ROS-i, võivad avaldada oma kaitsvat toimet oksüdatiivse stressi ja hüpoksiast põhjustatud apoptoosi nõrgenemise kaudu. Paljud uuringud on seda tõestanudantioksüdanttoidulisandid, nagu C-vitamiin [13], isoflavoon [8] ja nitroksiidi radikaalid [14], võivad piirata hüpoksiast põhjustatud vigastusi in vitro ja in vivo. Flavonoidid on suur ja mitmekesine kõikjal leiduvate taimede sekundaarsete metaboliitide klass. Neid peetakse alati suurepäraseks looduslikuksantioksüdantvõime eemaldada vabu radikaale ja pärssida lipiidide peroksüdatsiooni.

Praegu on sellele ühendite klassile üha rohkem tähelepanu pööratud nende kasuliku mõju tõttu inimeste tervisele. On näidatud, et flavonoididel on lai valik farmakoloogilisi toimeid, nagu põletikuvastane, antinotsitseptiivne ja neuroprotektiivne toime jne, mis kõik on tingitud nende antioksüdantsest toimest [15]. Paljud uuringud on näidanud, et flavonoididel on hüpoksiast põhjustatud ebaõnnestumise korral suurepärane kaitsev toime. Näiteks on rutiinil tugev neuroprotektiivne toime võrkkesta ganglionrakkude surma vastu, mis on põhjustatud hüpoksiast [16]. Hiljutine uuring näitab ka, et rutiin võib leevendada koobaltkloriidist põhjustatud hüpoksia kahjustusi, pärssides oksüdatiivset stressi ja apoptoosi H9c2 rakkudes [17]. Lisaks viitavad Liu jt, et nobiletiin (3',4',5,6, 7, 8-heksametoksüflavoon) nõrgendab müokardi I/R vigastust, aktiveerides H9c2 rakus Akt/GSK-3 raja [18]. Lisaks võib atsetsiin kaitsta roti kardiomüotsüüte ja H9C2 kardiomüoblaste hüpoksia/reoksügeenimise põhjustatud vigastuste eest nrf2 signaaliraja AMPK-vahendatud aktiveerimise kaudu [19].

Norwogoniin (5,7,8-trihüdroksüflavoon, joonis 1) on farmakoloogiliselt aktiivne flavoon, mis on eraldatud Scutellaria baicalensis Georgi (hiina keeles "Huang Qin") juurtest. See on traditsiooniline Hiina ravimtaim, mida kasutatakse gripi ja vähi raviks. [20, 21]. Siiski on norwogoniini bioloogilise aktiivsuse kohta piiratud uuringuid selle madala taseme tõttu looduslikes taimedes. Selle probleemi lahendamiseks on kirjeldatud mitmeid norwogoniini sünteesimeetodeid [22, 23].

Meie eelmine uuring kehtestas ka lihtsa meetodi norwogoniini saamiseks krüsiinist neljas etapis [24]. Need uuringud on positiivselt mõjutanud norwogoniini bioloogilise aktiivsuse edasist hindamist. Uuringud on näidanud, et norwogoniinil on antioksüdant [25], vähivastane [26, 27], viirusevastane [28] ja antimikroobne toime [29] ning see pärsib tsüaniidiga stimuleeritud ROS-i tootmist [30]. Siiski pole teada, kas norwogoniinil on kaitsevõime hüpoksiast põhjustatud vigastuste eest. Käesoleva uuringu eesmärk oli uurida norwogoniini kaitsvat toimet hüpoksiast põhjustatud oksüdatiivse stressi ja apoptoosi vastu PC12 rakkudes.

meetodid

Materjalid ja reaktiivid

Norwogoniin (puhtus 98 protsenti või suurem) sünteesiti meie varem teatatud meetodil [24]. Rutiin (puhtus 96 protsenti või suurem) osteti ettevõttelt Ci Yuan Biotechnology Co., Ltd. (Xian, Shannxi, Hiina). Norwogoniin ja rutiin lahustati steriilses dimetüülsulfoksiidis (DMSO), säilitati -20 kraadi juures ja lahjendati rakukultuurisöötmes vahetult enne kasutamist. Dulbecco modifitseeritud Eagle'i sööde (DMEM), veise loote seerum (FBS), streptomütsiin ja penitsilliin osteti ettevõttelt Solarbio co., Ltd. (Peking, Hiina).

Malondialdehüüdi (MDA), laktaatdehüdrogenaasi (LDH), superoksiiddismutaasi (SOD), katalaasi (CAT) ja glutatioonperoksidaasi (GPx) komplektid saadi Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute'ist (Jiangsu, Hiina). 2',7'-dikloriidhüdrofluorestseiindiatsetaat (DCFH-DA) ja (3-(4,5-dimetüültiasool-2-üül)-2,5- difenüültetrasoolium bromiid) tetrasoolium (MTT) saadi firmalt Sigma-Aldrich Co (St. Louis, MO, USA). Primaarsed antikehad hüpoksiaga indutseeritava faktori-1 (HIF-1), vaskulaarse endoteeli kasvufaktori (VEGF), B-rakulise lümfoomi-2 (Bcl-2), Bcl{{17 }} seotud X-valk (Bax), kaspaas-3, tsütokroom C ja -aktiin osteti ettevõttelt Abcam (Cambridge, UK). Sekundaarsed antikehad saadi firmalt ZsBio Company (Peking, Hiina).

Apoptoosi analüüsi komplekt saadi Beyotime'i Biotehnoloogia Instituudist (Jiangsu, Hiina). Kõik kemikaalid ja lahustid olid analüütilise puhtusega ning saadi Hiina kaubanduslikult tarnijalt. Rakukultuur PC12 rakud osteti Hiina Teaduste Akadeemia rakupangast (TCR 9, Shanghai, Hiina) ja neid hoiti DMEM-is 10% (maht/maht) FBS-i, 100 U/mL penitsilliini ja 100 U/ml streptomütsiiniga. temperatuuril 37 kraadi niisutatud inkubaatoris, mis sisaldab 5 protsenti CO2. Norwogoniini tsütotoksilisuse hindamiseks eelinkubeeriti PC12 rakke (passaaž 4–6) norwogoniini erinevate kontsentratsioonidega (10–8, 10–7, 10–6, 10–5, 10–4 mol/L). 1 tund ja seejärel kultiveeriti 24 tundi. Hüpoksiaga kokkupuude Raku hüpoksia vigastuse mudeli esilekutsumiseks allutati PC12 rakud hüpoksiakeskkonnale (1% O2, 5% CO2 ja 94% N2) 37 kraadi juures 24 tundi niisutatud kambris. Normoksilisi kontrollrakke kultiveeriti 37 kraadi juures 5% CO2 inkubaatoris 24 tundi.

Et hinnata norwogoniini kaitsvat toimet hüpoksiast põhjustatud vigastuste eest, eelinkubeeriti PC12 rakke erinevate kontsentratsioonidega (10-8, 10-7, 10-6, 10-5 mol/). L) norwogoniini 1 tund enne hüpoksia ravi. Rakkude elujõulisus Rakkude elujõulisust mõõdeti MTT testiga, nagu eelnevalt kirjeldatud [31]. Lühidalt, PC12 rakud (1 × 105 rakku / ml) külvati 96 süvendiga kultuuriplaatidele. Seejärel lisati süvenditesse erinevates kontsentratsioonides norwogoniini. Kontrollsüvenditesse lisati võrdne kogus DMSO-d. DMSO lõppkontsentratsioon rakukultuurisöötmes on 0,1 protsenti. Pärast inkubeerimist normoksilistes või hüpoksia tingimustes lisati igasse süvendisse 10 μL MTT-d (5, 0 mg / ml), millele järgnes inkubeerimine 37 kraadi juures 4 tundi. Seejärel eemaldati MTT-ga supernatant ja formazaanprodukt lahustati 100 µl DMSO-s. Neeldumist mõõdeti SpectraMax i3 mikroplaadilugejaga (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) 570 nm juures. Tulemused väljendati kontrollrühma suhtelise protsendina. Klaasist katteklaasidele külvatud hematoksüliini ja eosiini (HE) värvivaid PC12 rakke inkubeeriti 24 tundi, enne kui neid töödeldi norwogoniiniga ülalkirjeldatud viisil.

Sööde eemaldati ja klaasist katteklaase pesti külma PBS-ga, seejärel fikseeriti metanooliga 10 minutit toatemperatuuril ja seejärel pesti kolm korda külma PBS-ga 5 minutit. Lõpuks värviti rakud vastavalt HE värvimisprotokollile [32]. Raku analüüsid viidi läbi OLYMPUS IX73 mikroskoobiga (100×), et kontrollida raku morfoloogilisi muutusi. Digitaalsed kujutised saadi kasutades mikroskoobiga ühendatud digitaalkaamerat DXM 1200 C (Nikon). ROS-i sisaldus Intratsellulaarne ROS-i tase PC12 rakkudes määrati DCFH-DA testiga [33]. Lühidalt, PC12 rakud (1 × 105 rakku/ml) külvati 6-süvendiga plaatidele. Pärast hüpoksiaga töötlemist pesti PC12 rakke PBS-ga ja inkubeeriti seejärel 10 μM DCFH-DA-d sisaldavas söötmes 30 minutit pimedas 37 kraadi juures. Rakke vaadeldi Olympuse ümberpööratud fluorestsentsmikroskoobiga (Tokyo, Jaapan) ja analüüsiti Bec ton Dickinson FACScan voolutsütomeetriga (BD Biosciences, CA, USA) ergastuslainepikkusega 488 nm ja emissioonilainepikkusega 525 nm. ROS tase väljendati suhtelise protsendina kontrollist. LDH leke, MDA sisaldus ja antioksüdantse ensüümi aktiivsus PC12 rakud (1 × 105 rakku / ml) külvati 90 mm tassi. Pärast ülalkirjeldatud hüpoksiaga töötlemist koguti igast tassist 50 μl kultuuri supernatanti ja LDH aktiivsus söötmes tuvastati kaubanduslike analüüsikomplektide abil (Jianchengi Biotehnoloogia Instituut, Nanjing, Hiina) ja väljendati U / ml. PC12 rakud koguti ja homogeniseeriti pärast kahekordset pesemist külma PBS-ga. Üldvalgu kontsentratsiooni mõõdeti BCA valguanalüüsi komplektiga. MDA sisaldus ja antioksüdantse ensüümi aktiivsus määrati kaubanduslike analüüsikomplektide abil (Jianchengi Biotehnoloogia Instituut, Nanjing, Hiina).

MDA sisaldus esitati kui nmol/mg valku. SOD, CAT ja GPx aktiivsused esitati U / mg valkudena. Rakkude apoptoos (Anneksiin-V/PI värvimine) Pärast hüpoksiaga töötlemist koguti PC12 rakud, pesti kaks korda külma PBS-ga ja suspendeeriti seejärel sidumispuhvriga. Rakke töödeldi anneksiin V-FITC ja PI lahusega, järgides tootja protokolli (Beyotime, Shanghai, Hiina). Andmete kogumine viidi läbi Becton Dickinson FACScan voolutsütomeetriga (BD Biosciences, CA, USA). Kvantitatiivne reaalajas PCR analüüs PC12 rakkude kogu RNA ekstraheeriti Trizol reagendiga (Takara, Dalian, Hiina) ja konverteeriti cDNA-ks, kasutades PrimeScript TM RT reaktiivikomplekti (AK4301,

Takara, Dalian, Hiina). HIF{0}}, VEGF, Bcl-2, Bax, kaspaas-3, tsütokroom C ja glütseraldehüüd-3-fosfaatdehüdrogenaasi (GAPDH) geeni kodeeriv cDNA amplifitseeriti kvantitatiivse reaal- aja PCR, kasutades 7300 reaalajas tuvastamise süsteemi (Applied Biosystems, CA, USA). Kasutatud praimerid on näidatud tabelis 1. PCR tsüklitingimused olid 95 kraadi 30 sekundi jooksul, millele järgnes 40 tsüklit 95 kraadi 5 sekundit ja 60 kraadi 31 sekundit. MRNA tasemed arvutati 2-ΔΔCt meetodi abil ja normaliseeriti GAPDH-ga, mis on võrdlusgeen. Western blot PC12 rakud koguti ja homogeniseeriti RIPA ainetega. Üldvalkude kontsentratsioon kvantifitseeriti, kasutades BCA valgu analüüsi komplekti. 30 ug proove lahutati 12-protsendilise SDS-PAGE elektroforeesiga ja kanti seejärel polüvinülideenfluoriidi (PVDF) membraanidele (Millipore, Billerica, MA, USA).

Membraanid blokeeriti 5% rasvavaba kuiva piimaga TBST puhvris 1 tund toatemperatuuril ja inkubeeriti primaarsete antikehadega: anti-HIF-1 (1:300, ab179483, Abcam, Ühendkuningriik), anti-VEGF (1:1000, ab46154, Abcam, UK), anti-Bcl-2 (1:1000, ab59348, Abcam, UK), anti-Bax (1:500, ab32503, Abcam, UK), anti kaspaas-3 (1:300, ab44976, Abcam, UK), anti-tsütokroom C (1:1000, ab13575, Abcam, UK) ja anti- -aktiin (1:2000, ab8227) , Abcam, UK) 4 kraadi juures üleöö. Seejärel pesti membraane ja inkubeeriti sekundaarsete antikehadega (1:2000, ZsBio, Peking, Hiina;) 1 tund toatemperatuuril. Immunoreaktiivsed ribad visualiseeriti täiustatud kemoluminestsentsi (ECL) reaktiivide abil. Ribade suhteline intensiivsus normaliseeriti aktiini sisekontrolli järgi ja analüüsiti Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, Inc., Bethesda, MD, USA) abil.

Statistiline analüüs

Tulemused väljendati keskmisena ± SD, mis saadi vähemalt kolmest sõltumatust katsest. Rühmadevahelisi erinevusi analüüsiti ühesuunalise dispersioonanalüüsi (ANOVA) abil, millele järgnes Student-Newman-Keulsi post hoc test. P-väärtust < 0,05="" peeti="" statistiliselt="">

Tulemused

Norwogonin kaitseb PC12 rakke hüpoksiast põhjustatud vigastuste eest

Esiteks, norwogoniini proliferatiivse aktiivsuse välistamiseks määrati MTT testi abil selle tsütotoksilisus normaalsetele PC12 rakkudele. Nagu on näha jooniselt 2a, ei muutunud rakkude proliferatsioon pärast ravi norwogoniiniga kontsentratsioonidel 1 × 10− 8 -1 × 10−5 mol/L (P > 0,05) oluliselt ). Rakkude elujõulisus vähenes aga oluliselt, kui norwogoniini kontsentratsiooni tõsteti 1 × 10–4 mol/L-ni (P < 0,05).="" tulemused="" näitasid,="" et="" norwogoniin="" ei="" avaldanud="" pc12="" rakkudele="" toksilisust="" ega="" proliferatiivset="" aktiivsust="" kontsentratsioonidel="" 1="" ×="" 10–="" 8="" -1="" ×="" 10–5="">

Seejärel uurisime norwogoniini kaitsvat toimet hüpoksiast põhjustatud PC12 rakkude vigastuste vastu. Nagu on näidatud joonisel 2b, vähenes rakkude elujõulisus hüpoksia rühmas võrreldes kontrollrühmaga 58,71 protsendini (P < 0.01).="" võrreldes="" hüpoksiaraviga="" eeltöödeldud="" 1="" ×="" 10−8,="" 1="" ×="" 10−7="" ja="" 1="" ×="" 10−6="" mol/l="" norwogoniini="" annusest="" sõltuva="" kaitstud="" pc12-ga="" rakud="" hüpoksiast="" põhjustatud="" vigastuste="" vastu,="" taastades="" rakkude="" elujõulisuse="" vastavalt="" 58,71="" protsendilt="" 62,79="" protsendile="" (p="">< 0,05),="" 66,68="" protsendile="" (p="">< 0,01)="" ja="" 69,88="" protsendile="" (p="">< 0,01).="" eeltöötlusel="" 1="" ×="" 10-6="" mol/l="" rutiiniga="" oli="" samuti="" kaitsev="" toime,="" suurendades="" oluliselt="" rakkude="" elujõulisust="" 63,78="" protsendini="" võrreldes="" hüpoksiaraviga.="" 1="" ×="" 10-5="" mol/l="" norwogoniiniga="" eeltöödeldud="" elujõulisus="" vähenes="" 63,43="" protsendini,="" mis="" on="" siiski="" oluliselt="" kõrgem="" kui="" hüpoksia="" rühmas="" (p=""><0,05). need="" tulemused="" näitasid,="" et="" norwogoniin="" näitas="" märkimisväärset="" tsütokaitset="" kontsentratsioonidel="" 1="" ×="" 10–="" 8="" -1="" ×="" 10–5="" mol/l="" ja="" kõige="" tõhusam="" kontsentratsioon="" on="" 1="" ×="" 10–6="" mol/l.="" seejärel="" kasutati="" seda="" annust="" järgmistes="" katsetes="" optimaalse="">

Norwogoniini kaitsevõimet kontrolliti ka morfoloogiliste muutustega. Nagu on näidatud joonisel 2c, kasvasid hüpoksiaravita PC12 rakud hästi korrapärase kujuga (fusiform), ühtlase suurusega. Pärast hüpoksiaga kokkupuudet ilmnesid PC12 rakkudel kokkutõmbumine, ümar kuju, desquamatsioon ja vähenenud rakkude tihedus. Enne hüpoksiaga kokkupuudet norwogoniini või rutiiniga töödeldud rakud kasvasid paremini, deskvamatsioonirakkude arv vähenes ja raku kuju taastus normaalselt. Lisaks kinnitas norwogoniini kaitsevõimet LDH leke, mis on seotud rakumembraani terviklikkuse kadumisega. Nagu on näidatud joonisel 2d, suurenes LDH aktiivsus söötmes märkimisväärselt pärast hüpoksiaga kokkupuudet (P <>

Eeltöötlemine norwogoniini või rutiiniga vähendas dramaatiliselt LDH leket, mis viitab sellele, et norwogoniin ja rutiin taastasid rakumembraani terviklikkuse. Norwogoniin inhibeerib hüpoksiast põhjustatud oksüdeerivat stressi PC12 rakkudes. ROS ja MDA on hüpoksiast põhjustatud rakulise oksüdeeriva stressi kaks olulist näitajat. Nagu on näidatud joonistel 3a ja 3b, täheldati PC12 rakkudes pärast hüpoksiaga kokkupuudet oluliselt suurenenud ROS-i ja MDA sisaldust. Norwogoniini või rutiini eeltöötlus pärssis oluliselt ROS-i ja MDA tootmist.

Antioksüdantseid ensüüme, nagu SOD, CAT ja GPx, peetakse peamiseks kaitsesüsteemiks rakkude oksüdatiivse stressi vastu. Nagu on näidatud joonistel 3c-e, inhibeeris hüpoksiaga kokkupuude oluliselt SOD, CAT ja GPx aktiivsust PC12 rakkudes. Ravi norwogoniini või rutiiniga muutis need muutused ja taastas antioksüdantsete ensüümide aktiivsuse. Kõik need tulemused näitasid, et norwogoniin kaitses PC12 rakke hüpoksiast põhjustatud oksüdatiivse stressi eest.