NMR-põhine metaboolne analüüs ketoglutaraadi lisamise mõju kohta C2C12 müoblastidele erinevates energiaolekutes

Klõpsake siin, et hankida Cistanche vananemisvastaseid ja väsimust leevendavaid toidulisandeid

1. Sissejuhatus

Skeletilihas on inimkeha suurim organ, mis tagab normaalse elutegevuse.Pikaajaline treeningutreeningvõi patoloogilinel haiguste protsessid kutsuvad esile lihaskahjustusivõilihaste ebapiisav energiavarustus, sel ajal on lihasjõu ja -funktsiooni taastamine eriti oluline. Skeletilihaste hüpertroofia edendamiseks ja sportliku soorituse parandamiseks on kasutatud erinevaid toidulisandeid [1]. Orgaanilise süsiniku ja lämmastiku metabolismi ristumiskohana ja samaaegselt TCA tsükli kriitilise vaheühendina on -ketoglutaraat (AKG) näidanud pleiotroopset toimet lihaste jõudluse parandamiseks kliinilistes ja loomkatsetes [2–9]. Näiteks võib AKG vähendada soole limaskesta kahjustusi [8] ja põletikku [9], nõrgendadakolorektaalse vähi areng[4] ja maksafibroosi [5], soodustavad kasvu [6] ning vähendavad haigestumust javananemist edasi lükata[7]. Varasemad tööd on näidanud, et AKG lisamine võib leevendada lihaste kadu parenteraalse manustamisega patsientidel, kes läbivad puusaliigese täieliku asendamise [2], ning soodustada lihaste hüpertroofiat ja valkude sünteesi Akt/mTOR signaaliradade kaudu [10,11]. Duchenne'i lihasdüstroofia korral võib AKG lisamine PHD3/ADRB{5}}vahendatud raja kaudu ära hoida lihaste atroofiat ja düsfunktsiooni [12]. Meie eelmine töö näitas ka, et AKG lisamine võib oluliselt hõlbustada C2C12 müoblastide proliferatsiooni ja leevendada glükoosivabas söötmes kultiveeritud C2C12 müotorude atroofiat [13]. Arvestades, et glükoos on peamine energiaallikas skeletilihaste normaalsete füsioloogiliste funktsioonide säilitamiseks, sõltub AKG lisandite mõju lihaste jõudluse parandamiseks suurel määral skeletilihaste glükoositasemest. Skeletilihaste AKG-indutseeritud mõjude erinevused erinevate energiaseisundite vahel on ebaselged.

AKG osaleb aminohapete, vitamiinide ja vitamiinide sünteesisorgaanilised happedjaenergia metabolismorganismis, mis hõlmab AKG muundamist glutamaadiks glutamaadi dehüdrogenaasi toimel ja sellele järgnevat glutamaadi amideerimist ammoniaagiga glutamiinsüntetaasi toimel. AKG annab rakkude kasvuks energiat TCA tsükli ja oksüdatiivse fosforüülimise kaudu ning soodustab rakkude metabolismi ja signaaliülekannet, toimides rakumembraanil oma retseptoriga OXGR (G-valguga seotud retseptor) [14,15]. Veelgi enam, AKG võib reguleerida mitokondriaalset oksüdatiivset metabolismi ja soodustada lubavat epigeneetilist seisundit, vahendades varajast embrüonaalse raku oleku üleminekut ja sugurakkude arengut [16]. Lisaks võib treeningutest põhjustatud AKG stimuleerida oma retseptorit OXGR1 neerupealistes, et kontrollida termogeneesi ja triglütseriidide lagunemist rasvkoes ning avaldada kasulikku mõju ainevahetusele [17].

Siiski on tehtud vähe uuringuid, et paljastada skeletilihaste AKG-indutseeritud metaboolsed muutused erinevates energiaseisundites ja nende aluseks olevad metaboolsed mehhanismid. Hiljuti on toidulisandite kasulike mõjude aluseks olevate molekulaarsete mehhanismide süstemaatiliseks selgitamiseks kasutatud metaboolset analüüsi. Geenide transkriptsiooni allavoolu produktidena toimivate metaboliitide vaheldumised võivad kajastada üldiseid metaboolseid muutusi intuitiivselt. Eriti sobivate meetoditena metaboliitide tasemete muutuste kvantitatiivseks tuvastamiseks biovedelikes, kudedes ja rakkudes on metaboolsetes analüüsides laialdaselt kasutatud kõrge eraldusvõimega 1H tuumamagnetresonantsi (NMR) spektroskoopiat. Märkimisväärne on see, et NMR-põhisel metaboolsel profiilil on mitmeid eeliseid, nagu kõrge reprodutseeritavus, kvantitatiivne mõõtmine ilma eelarvamusteta ja mugav proovide ettevalmistamine [18, 19]. Varem tegime NMR-põhiseid metaboolseid analüüse, et selgitada nii kreatiini lisamise mõju C2C12 müoblastidele [20] kui ka alanüülglutamiini lisamise mõju energiapuudusest kahjustatud müoblastidele [21].

2. Tulemused

2.1. C2C12 müoblastide proliferatsioon ja diferentseerumine AKG täiendusega

C2C12 müoblastirakud, mida kultiveeriti normaalses kasvusöötmes koos AKG-lisandiga ja ilma, rühmitati rühmadesse Nor-A ja Nor, samas kui madala glükoosisisaldusega kasvusöötmes koos AKG-lisandiga või ilma rühmitati madala glükoosisisaldusega kasvusöötmes ja madalaks. Kooskõlas eelmise uuringuga [10] näitasid Nor-A rakud AKG lisandiga kontsentratsioonis 2 mm märkimisväärselt suurenenud rakkude elujõulisust võrreldes Nor-rakkudega (joonis S1).

Seetõttu kasutati katsetes AKG kontsentratsiooni 2 mm, et hinnata AKG-st põhjustatud muutusi müoblastide proliferatsioonis ja diferentseerumises. Võrreldes Nor-rakkudega näitasid madalad rakud energiapuuduse tõttu oluliselt vähenenud proliferatsioonikiirust (joonis 1A). Kuigi AKG lisamine ei põhjustanud kahes energiaseisundis müoblastide märkimisväärselt erinevat morfoloogiat, ei suurendanud see mitte ainult madala glükoosisisaldusega söötmes kultiveeritud madalate rakkude proliferatsioonikiirust, vaid suurendas ka normaalses söötmes kultiveeritud Nor-rakkude proliferatsioonikiirust vastavalt varasemad uuringud [10,12]. Rakkude arv antud piirkonna kohta loendati nelja müoblastide rühma kohta (n=4 rühma jaoks): Nor, 563,8 ± 10,4; Nor-A, 624,0 ± 10,8; Madal, 493,8 ± 14,5; Madal A, 547,0 ± 11,7 (joonis 1B). Väärib märkimist, et Low-A rakkudel ei olnud Nor-rakkudest statistiliselt erinevat rakkude arvu, mis näitab, et AKG lisamine võib madala glükoosisisaldusega kultiveerimistingimustes taastada müoblastide rakkude arvu (joonis 1B).

Joonis 1, C2C12 müoblastide proliferatsiooni- ja diferentseerumisvõime normaalse kultuuri tingimustes ja madalal. glükoosikultuur. (A) Müoblastide morfoloogiad. (B) Lahtrite numbrid, mis vastavad paneelile A (n=4). (C) Rakkude elujõulisus võrreldes Nor-rakkudega, mida analüüsiti MTS-rakkude proliferatsioonitestiga (n=5). (D) MyoD1 ekspressioonid müoblastides, mida analüüsiti Western blot abil. GAPDH-vastast antikeha kasutati valgu koguse standardiseerimiseks igal rajal. (E) Paneelidele (D) vastav statistiline analüüs (n=4). * p < 0.{{10}}5,** p < 0,01, *** p < 0,001, **** p < 0,0001.

Lisaks viidi läbi MTS-analüüs, et kvantitatiivselt võrrelda nelja rakurühma proliferatsioonikiirust (joonis 1C). Madalatel rakkudel oli Nor-rakkudega võrreldes selgelt vähenenud proliferatsioonikiirus, mis näitab, et madala glükoosisisaldusega sööde kahjustas rakkude proliferatsiooni. Märkimisväärselt suurendas AKG lisamine Nor-A ja Low-A rakkude proliferatsioonikiirust Nor ja Low rakkude suhtes. Pange tähele, et Low-A rakkude proliferatsioonivõime oli madalam kui Nor-rakkudel, mis tähendab, et AKG lisamine taastas ainult osaliselt madala glükoosisisaldusega söötmes kultiveeritud rakkude proliferatsiooni.

.Müogeense diferentseerumise 1 (MyoD1) valgu ekspressiooni kasutatakse tavaliselt rakkude diferentseerumisvõime iseloomustamiseks. Seega võrdlesime kvantitatiivselt MyoD1 ekspressioone nelja rakurühma vahel (joonis 1D). Madalad rakud näitasid Nor-rakkudega võrreldes oluliselt vähenenud diferentseerumisvõimet. Märkimisväärne on see, et AKG täiendamine suurendas nii normaalses söötmes kui ka madala glükoosisisaldusega söötmes kultiveeritud rakkude diferentseerumisvõimet, mida näitab MyoD1 ekspressiooni suurenemine Nor-A ja Low-A rakkudes umbes 30 protsenti. Nimelt ei näidanud Low-A rakud statistiliselt oluliselt erinevat MyoD1 ekspressiooni Nor-rakkudest, mis viitab AKG lisamise suurele efektiivsusele madala glükoosisisaldusega söötmes kultiveeritud rakkude diferentseerumisvõime taastamisel.

Lisaks analüüsisime C2C12 müoblastide nelja rühma müotoru diferentseerumisvõimet. Müotorud moodustati normaalses ja madala glükoosisisaldusega diferentseerumissöötmes kultiveeritud müoblastide liitmisel AKG lisandiga või ilma. Joonis S3). C2C12 müotorude morfoloogiad näitasid, et madala glükoosisisaldusega kultuur kahjustas rakkude müotoru diferentseerumisvõimet ja AKG lisamine võib soodustada nii normaalses söötmes kui ka madala glükoosisisaldusega söötmes kultiveeritud müoblastide müotoru diferentseerumist.

2.2. C2C12 müoblastide vesiekstraktide NMR spektrid

Tüüpilised 850 MHz 1H NMR spektrid registreeriti vesiekstraktidel, mis saadi C2C12 müoblastide Nor, Nor-A, Low ja Low-A rühmadest (joonis 2A). Kokku määrati 34 metaboliiti ja võeti kokku tabelis S1. Metaboliitide resonantsi määramine kinnitati 2D 1H-13C HSOC ja 1H-H TOCSY spektrite abil (joonised S4 ja S5). NMR-spektrite visuaalne kontroll näitas, et müoblastide kultiveerimine AKG-lisandiga põhjustas rakusisese AKG märkimisväärse akumuleerumise Nor-A ja Low-A rakkudes (joonis 2B).

Joonis 2. Keskmised 850 MHz lH tuumamagnetresonantsi (NMR) spektrid, mis on registreeritud C2C12 müoblastide Nor, Nor-A, Low ja Low-A rühmadest saadud vesiekstraktidel. (A) Nelja rühma keskmiste NMR spektrite võrdlus. Vertikaalsed skaalad hoiti kõigis 1H NMR spektrites konstantsena. Veepiirkond (4.{7}}.2 ppm) eemaldati (B) α-ketoglutaraadi (AKG) piikide lokaalsed võimendatud piirkonnad. Sinine/roheline/kollane/punane joon: spektripiirkonnad Nor/Nor-A/Low/Low-A rühmadest. AKG, a-ketoglutaraat; PC, O-fosfokoliin; GPC, sn-glütsero-3-fosfokoliinUDP-glükoos, uridiindifosfaatglükoos: CTP, sn-glütsero-3-fosfokoliin; NAD pluss, nikotiinamiidadeniindinukleotiid AXP adeniinmono/di/trifosfaat.

2.3. Mitme muutujaga andmete analüüs raku ainevahetuse profiilide uurimiseks

Lisaks teostasime C2C12 müoblastide nelja rühma metaboolse profiili koostamiseks NMR spektriandmete mitme muutujaga andmeanalüüsi. Esmalt koostasime kolm järelevalveta PCA mudelit kahe esimese komponendiga (PC1, PC2), et saada ülevaade rühmitamise suundumustest ja paljastada metaboolsed erinevused müoblastide rühmade vahel. ThePCA skoori graafikud näitavad, et madala glükoosisisaldusega söötmes kultiveeritud rakkude metaboolne profiil erines selgelt normaalses söötmes kultiveeritud rakkude metaboolsest profiilist (joonis 3A) ja AKC täiendamine muutis oluliselt nii normaalses söötmes kui ka kultiveeritud rakkude metaboolseid mustreid. madala glükoosisisaldusega söötmes (joonis 3B, C). Kuid metaboolne erinevus Nor-A ja Nor rühmade vahel oli suurem kui Low-A ja Low rühmade vahel, mis tähendab, et AKG lisamise mõju müoblastide metaboolsele profiilile sõltub suuresti rakkude energiaseisundist.

Joonis 3. HNMR spektrite mitme muutujaga analüüsid registreeriti vesiekstraktidel, mis saadi Nor, Nor-A, Low ja Low-A rühma C2C12 müoblastidest. (AC) PCA skoori graafikud madala ja Nor rühmade, Low-A ja Low rühmade Nor-A ja Nor rühmade kohta; (DF) OPIS-DA skoorib madala ja Nor rühmade (R2: 0.999, 02: 0.996), madala-A ja madala rühmade (R2: 0.918: 02: 0.761), Nor-A ja Nor rühmad (R2: 0,927: 02: 0,838). Ellipsid näitavad 95-protsendilist usalduspiiri.

Lisaks koostasime kolm juhendatud OPLS-DA mudelit, et illustreerida nelja müoblastide rühma metaboolset eraldumist (joonis 3D-F). Nagu oodatud, maksimeerisid OPLSDA mudelid metaboolseid erinevusi nelja rühma vahel, reserveerides korrelatsiooniga ortogonaalse muutuja teabe ja filtreerides välja korrelatsioonita ortogonaalse muutuja teabe. Lisaks viisime läbi juhuslikud permutatsioonitestid (n=200), et hinnata OPLS-DA mudelite usaldusväärsust (joonis S6), mis näitavad kehtestatud OPLS-DA mudelite kehtivust.

2.4. Diferentsiaalsete ja oluliste metaboliitide identifitseerimine

Metaboliitide tasemete kvantitatiivseks võrdlemiseks nelja C2C12 müoblastide rühma vahel arvutasime tuvastatud metaboliitide suhtelised tasemed nende suhteliste integraalide põhjal (tabel S2). AKG lisamine suurendas dramaatiliselt intratsellulaarset AKG taset Nor-A ja Low-A rühmades, kuid ei muutnud oluliselt Nor- ja Low rühmas. Tegime Studenti t-testi, et tuvastada diferentseeritud metaboliidid kriteeriumiga p < 0,05 (joonis 4). Võrreldes Nor vs. Low tuvastati 29 erinevat metaboliiti (joonis 4A), sealhulgas 18 võimendatud metaboliiti (leutsiin, isoleutsiin, valiin, atsetaat, glutamaat, glutamiin, metioniin, aspartaat, lüsiin, kreatiin, PC (O-fosfokoliin)tauriin, türosiin , fenüülalaniin, histidiin, NAD plus , formiaat, AXP) ja 11 keeldusid Metabost. litid (glutatioon, püroglutamaat, fosfokreatiin, beeta-alaniin, GPC, glükoos, glütsiin, atsetaat, treoniin, GTP, UDP-glükoos). Madala A-väärtusega ja madala identifitseerimisega diferentseeritud metaboliitide võrdlus (joonis 4B), sealhulgas 7 suurenenud metaboliiti (etanool, AKG-beeta-alaniin, PC, tauriin, glütsiin ja GTP) ja 3 vähenenud metaboliiti (glutamiin, lüsiin ja müoinositool). Nor-A ja Nor võrdluses tuvastati 18 erinevat metaboliiti (joonis 4C), sealhulgas 6 ülesreguleeritud metaboliiti (AKG, püroglutamaat, glutamiin, lüsiin, glükoos, laktaat) ja 12 allareguleeritud metaboliiti (alaniin, atsetaat, glutatioon metioniin, fosfokreatiin, PC, müoinositool, glütsiin, treoniin, GTP, UDP-glükoos ja AXP).

Joonis 4. Diferentsiaalsete metaboliitide suhteline intensiivsus tuvastati nelja C2C12 müoblastide rühma paaripõhise võrdluse põhjal. (A) madal vs ei; (B) Madal-A vs. madal; (C) Nor-A vs. Nor. * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0,001, **** p < 0,0001.n { {13}} iga rühma kohta.

Lisaks kasutasime OPLS-DA mudeleid oluliste metaboliitide tuvastamiseks kriteeriumiga VIP> 1 (joonis 5). Nor-A vs. Nor, Nor vs Low, Low-A vs Low OPLS-DA mudelite põhjal tuvastati kokku 12, 10 ja 10 olulist metaboliiti.

Joonis 5. Oluliste metaboliitide VIP-skoorid tuvastati nelja C2C12müoblastide rühma paaripõhise võrdluse põhjal. (A) madal vs ei; (B) Madal-A vs. madal; (C) Nor-A vs. Nor. Punane/sinine font tähistab metaboliidi suurenenud/vähenenud taset.

Tuvastatud oluliste metaboliitide ja erinevate metaboliitide kombinatsioon andis iseloomulikud metaboliidid (tabel 1). Madal ja Nor, Madal-A vs. Madal ja Nor-A vs. Paaripõhised võrdlused tuvastasid vastavalt 10, 6 ja 10 iseloomulikku metaboliiti, mis näitab, et AKG lisamise mõju müoblastidele oli tihedalt seotud energiaga. rakkude seisund.

2.5. Oluliselt muutunud ainevahetuse tuvastamine

Rajad Teostasime metaboolsete radade analüüsi, et tuvastada oluliselt muutunud metaboolsed rajad (olulised rajad), mis põhinevad C1C12 müoblastide nelja rühma paaripõhisel võrdlusel tuvastatud metaboliitide tasemetel (joonis S7; tabel 2 ja tabel S3). Nor vs. Low analüüs tuvastas 11 olulist rada: (1) alaniini, aspartaadi ja glutamaadi metabolism; (2) glütsiini, seriini ja treoniini metabolism; (3) glutatiooni metabolism; (4) D-glutamiini ja D-glutamaadi metabolism; (5) tärklise ja sahharoosi metabolism; (6) beeta-alaniini metabolism; (7) Tauriini ja hüpotauriini metabolism; (8) fenüülalaniini metabolism; (9) Fenüülalaniini, türosiini ja trüptofaani biosüntees; (10) Nikotinaadi ja nikotiinamiidi metabolism; (11) Histidiini metabolism. Seda olulist rada seostati energia metabolismi, oksüdatiivse stressi ja TCA tsükli anaplerootilise vooluga.

Nor-A vs Nor analüüs tuvastas ainult esimesed viis olulist rada 1–5, välja arvatud ülejäänud kuus rada 6–11. Madala ja madala taseme analüüs tuvastas erinevalt ainult kuus olulist rada: esimesed neli rada 1–4, mida jagasid Madal vs. Nor, Nor-A vs. Ei võrdlused; kaks rada 6–7, mida jagab Madal ja Nor. Pange tähele, et AKG lisamine ei muutnud märkimisväärselt 5. rada (tärklise ja sahharoosi metabolism) madala glükoosisisaldusega söötmes kultiveeritud rakkudes, kuid häiris kahte teist rada (beeta-alaniini metabolism ning tauriini ja hüpotauriini metabolism). Iseloomulike metaboliitide AKG-st põhjustatud muutuste visualiseerimiseks projitseerisime need metaboliidid metaboolsele kaardile, mis põhines Kyoto geenide ja genoomide entsüklopeedia (KEGG) andmebaasil (joonis 6). KEGG-d on laialdaselt kasutatud ühe peamise andmeallikana metaboolsete võrkude rekonstrueerimiseks ja see toob esile olulised metaboolsed teed. Nii muutunud iseloomulikud metaboliidid kui ka oluliselt muutunud metaboolsed rajad annavad uue ülevaate molekulaarsetest mehhanismidest, mis on aluseks AKG lisamise mõjule C2C12 müoblastidele.