Vananemisvastaste omaduste ja mehhanismi võrdlev uuring: resveratrool ja kalorite piiramine

ABSTRAKTNE

Resveratrool ja kalorite piiramine (CR) on võimsad ravivõimalusedVananemisvastane. Siin on nende võrdlev mõjupikaealisusega seotud geenvaigistamise teabe regulaatorit (SIRT1) hinnati in vitro ja in vivo. Rakkude vananemismudeli loomiseks kasutati 2,2'-asobis(2-amidinopropaan) divesinikkloriidiga (AAPH) töödeldud IMR-90 rakke ja D-galaktoosiga (D-gal) ravitud rotte. kui anvananeva looma mudel. Resveratrool ja CR näitasid sarnaseidvananemisvastased tegevused, tõendabvananemise ja apoptoosi pärssimine ning kognitiivsete häirete ja oksüdatiivsete kahjustuste taastamine. Veelgi enam, nad võiksidtelomeraasi ülesreguleerimine(TE) tegevus,suurendada SIRT1 väljendeid, kahvlipea kast 3a (Foxo3a), SIRT1 (AROS) ja Hu antigeeni R (HuR) aktiivne regulaator, kuid vähendab p53 ja kustutatakse rinnavähi 1 (DBC1) taset. Siiski näitas 10 μM resveratrooli in vitro ja suure annuse rühmas in vivosuhteliselt tugevam vananemisvastane ja stimuleeriv SIRT1 taset kui CR. Kokkuvõtteks, resveratrool ja CR näitasid sarnaseidvananemisvastased tegevusedSIRT1 signaalimisel,mis viitab resveratrooli potentsiaalile CR-i mimeetikumina.

Cistanche'i vananemisvastase ravimtaimega tutvumiseks klõpsake siin

SISSEJUHATUS

Tervishoiu paranemine on viimastel aastakümnetel aidanud tõsta inimeste oodatavat eluiga ja seega suureneb eakate arv oluliselt. Kahjuks tähendab see endiselt kehva tervise või puude perioodide sagenemist. Praegu on enamikus arenenud riikides esile kerkimas mitmesugused vananemisega seotud haigused kui suurimad terviseohud. Kuigi meie geneetilist tausta pole veel võimalik muuta, on praegu esile kerkinud mitmesugused vananemisvastased strateegiad kui tervislikud eluviisid ja terapeutilised sekkumised, mille eesmärk on vähendada halva tervise riskitegurite esinemist [1].

CR, vähenenud kalorite tarbimine ilma alatoitluseta, on üks jõulisemaid sekkumisi, mis pikendavad mudelorganismide eluiga pärmist primaatideni [2]. See võib kaitsta bioloogiliste funktsioonide halvenemise eest, vähendada esinemissagedust ja lükata edasi mitmete vanusega seotud haiguste teket. Mehhanism, mille abil CR pikendab eluiga, hõlmab kasvu aeglustumist, keharasva vähenemist, neuroendokriinsete või immunoloogiliste muutuste edasilükkamist, DNA paranemisvõime suurenemist, muutunud geeniekspressiooni, suurenenud apoptoosi, kehatemperatuuri alandamist ja ainevahetuse kiiruse pärssimist ning oksüdatiivsete häirete leevendamist. stress [3]. CR-i vananemisvastast toimet on tugevalt seostatud sirtuiinide perekonna liikmete suurenenud taseme ja aktiveerumisega ning samuti muude molekulaarsete signaaliradadega, sealhulgas peroksisoomi proliferaatori poolt aktiveeritud retseptori G koaktivaatoriga- 1 (PGC{{). 6}}), adenosiinmonofosfaadiga aktiveeritud proteiinkinaasi (AMPK), insuliini/insuliini kasvufaktorit-1 ja rapamütsiini sihtmärki [1, 4]. Kuid enamik inimesi ei järgi sellist ranget toitumisprogrammi, eriti pikas perspektiivis. Seetõttu on viimaste uuringute eesmärk üha enam määrata kindlaks looduslike ja/või farmakoloogiliste CR-i mimeetiliste molekulide/ravi teostatavust ja tõhusust ilma toidutarbimist vähendamata [5].

Resveratrool on taimne polüfenool, mida tavaliselt leidub erinevates taimedes, sealhulgas viinamarjade, marjade ja maapähklite nahas. Huvitav on see, et resveratrooli lisamine toidulisanditesse või toitudesse võib olla võimas terapeutiline võimalus vananemisvastaseks raviks ja mitmed aruanded näitavad, et resveratrooliga ravimisel on kasulikud toimed, mis on sarnased CR-ga [6], mis viitab resveratrooli potentsiaalile CR-i mimeetikumina. [4]. Hiljuti on näidatud, et resveratrool pikendab eluiga, suurendades oluliselt SIRT1 aktiivsust, mille tulemuseks on SIRT1 afiinsuse suurenemine nii NAD plusi kui ka atsetüülitud substraadi suhtes [7, 8], mis vastutab ka CR põhjustatud pikaealisuse eest. Kuigi resveratrooli ja CR-i on nende potentsiaalset kasu tervisele laialdaselt uuritud, on nende võrdleva mõju kohta vähe teada. Selles uuringus võrreldi resveratrooli ja CR vananemisvastast toimet in vivo ja in vitro, tuvastades SIRT1 rada.

TULEMUSED

Resveratrool ja CR vähendasid vananemisega seotud galaktosidaasi (SA -gal) värvumist AAPH-ga töödeldud IMR-90 rakkudes

Kasutades ära IMR-90 rakkude AAPH-indutseeritud vananemismudelit, testisime võimalikku mõju SA- -gal värvimisele. Nagu on näidatud joonisel fig 1, näitasid AAPH-ga töödeldud rakud laiemalt ja tugevamalt positiivset värvumist kui kontrollrakkudes ning kontrollrakkude positiivset värvumist oli suhteliselt vähe. Leiti, et resveratrooli (5 µM, 10 µM ja 20 µM) või CR-ravi tagab AAPH-indutseeritud vananemise korral märkimisväärse kaitse. Veelgi enam, kui võrrelda resveratrooli toimet CR-ga, ilmnes 10 μM resveratrooliga töödeldud rakkudel suhteliselt harvem SA- -Gal-positiivne värvumine kui CR-ravi korral. Seega näitasid need tulemused, et 10 μM resveratrool inhibeeris AAPH-indutseeritud vananemist tõhusamalt kui CR.

IMR- 90 rakkude skaneeriv elektronmikroskoopia analüüs

Skaneeriv elektronmikroskoopia uurimine andis mõned uued üksikasjad AAPH-ga töödeldud rakkude struktuuri kohta (joonis 2). Tavaline IMR-90 paistis tüüpilise fusiform kujuga täielikult laialivalguvate rakkudena. Enamik rakke sisaldas kahte kitsenevat protsessi ja neil oli vähe täppe. AAPH-ga töödeldud rakkudel oli laienenud ja lamenenud morfoloogia koos arvukate täppidega. Resveratrooli või CR-ga töödeldud IMR-90 proovide skaneeriva elektronmikroskoopiaga jälgimine pärast AAPH manustamist näitas, et kuigi mõningaid laike võis tuvastada, säilis tavaline fusiformne kuju koos täieliku levikuga.

Resveratrool ja CR vähendasid apoptoosi AAPH-ga töödeldud IMR-90 rakkudes

Fosfatidüülseriin rakkude pinnal, mida peeti varajases faasis apoptoosi tunnuseks, määrati PI / anneksiin V värvimistestiga (joonis 3). Apoptootilised rakud koosnevad nii anneksiin-V-FITC-ga värvitud varastest apoptootilistest rakkudest kui ka anneksiin-V-FITC ja PI-ga värvitud hilistest apoptootilistest või nekrootilistest rakkudest. Apoptootiliste rakkude populatsioon suurenes märkimisväärselt AAPH rühmas (34,54 protsenti), võrreldes negatiivse rühmaga (7,32 protsenti). Samas leiti, et resveratrooli (5 μM, 10 μM ja 20 μM) või CR-ravi vähendas AAPH-indutseeritud IMR-90 rakkudes apoptoosi. Lisaks vähendas ravi 10 μM resveratrooliga (11,58 protsenti) tõhusamalt AAPH-indutseeritud apoptoosi kui CR-ravi (16,78 protsenti).

Üldise välimuse ja kehakaalu muutus

Kogu katseprotsessi ajal manustati vananevatele mudelrottidele D-gal annuses 200 mg/kg iga päev ja täheldati üldist välimust. Võrreldes normaalsete kontrollrottidega muutusid D-gal mudelrühma rotid reageerimisel järk-järgult apaatseks, tuimaks ja aeglaseks; modellirühma omade juuksed kaotasid järk-järgult elastsuse ja muutusid rabedaks; nahk muutus õhukeseks, mitteelastseks ja vajus vähehaaval. Kuid samaaegne ravi resveratrooli või CR-ga D-gal-iga rottidel näitas ülaltoodud muutuste pöördumist võrreldes D-gal rühmaga. Raviperioodi jooksul katserühmade vahel kehakaalus erinevusi ei olnud, välja arvatud CR-rühm, kus kaal katse ajal peaaegu ei tõusnud (joonis 4).

Resveratrool ja CR parandasid SD-rottide ruumilist õppimist ja mälu

Rottide ruumilise õppimise ja mälu võimet hindasime Morrise veelabürindi testiga. Nagu on näidatud joonisel 5, suutsid kõik viis rühma ülesande edukalt õppida, mida tõendab järk-järgult vähenenud põgenemislatentsus ja suurenenud ujumiskiirus 4-päevase kohanavigatsioonifaasi jooksul. Analüüsides kahesuunalise ANOVA meetodiga, ilmnesid olulised erinevused nii keskmises põgenemislatentsuses kui ka ujumiskiiruses treeningpäevade vahel (F(3,138)=41.660, P < 0). 01; F(3,138)=10.013, P < 0.01) ja ravi vahel (F(4,46) )=36.762, P < {{40}}.01; F(4,46)=20.102, P < 0,01, vastavalt), kuid päeva ja ravi vahel puudub koostoime (vastavalt F(12 138)=0,846, P > 0,05; F(12 138)=1,084, P > 0,05). Põgenemislatentsus D-gal rühmas oli märkimisväärselt pikem kui kontrollrühmas (P < 0,01) (post-hoc analüüs, joonis 5A). Samal ajal näitasid resveratrooli pluss D-gal rühma või CR pluss D-gal rühma kuuluvad rotid ülalmainitud muutused põgenemise latentsuses võrreldes D-gal rühmaga (P < 0,01) (joonis 5A) ja lühenesid märkimisväärselt põgenemisaega. latentsusaeg samale tasemele kontrollrühmaga. Sarnased tulemused saadi ka rottide ujumiskiiruse kohta (joonis 5B) ning resveratrooli pluss D-gal rühmas ja CR pluss D-gal rühmas olevate rottide ujumiskiirus suurenes märgatavalt võrreldes D-gal rühmaga (P < 0,01). ). Resveratrooli ja D-gal rühma suure annusega rottidel oli aga suhteliselt pikem põgenemislatentsus ja väiksem ujumiskiirus võrreldes CR pluss D-gal rühmaga.

Joonis 1: Resveratrooli ja kalorite piiramine vähendab SA- -gal värvumist AAPH-ga töödeldud IMR-90 rakkudes. AAPH-indutseeritud IMR{5}} rakke töödeldi kaloripiiranguga (CR) või resveratrooliga (RES) näidatud kontsentratsioonil 2 päeva. Suurendus oli 20×.

Joonis 2: IMR-90 rakkude skaneeriv elektronmikroskoopia analüüs. AAPH-indutseeritud IMR-90 rakke töödeldi kaloripiiranguga (CR) või resveratrooliga (RES) näidatud kontsentratsioonil 2 päeva. Suurendus oli 6000×.

Joonis 3: Resveratrool (RES) ja kalorite piiramine (CR) vähendasid apoptoosi AAPH-ga töödeldud IMR-90 rakkudes. Rakud värviti anneksiin V-FITC/PI-ga ja analüüsiti voolutsütomeetria abil. FL1 kanalit kasutati anneksiin-V-FITC värvimise tuvastamiseks ja FL2 kanal oli PI värvimiseks

Ruumilise sondi faasis (joonised 5C ja 5D) võis näha, et D-gal rühmas esines platvormide ületamise märkimisväärne vähenemine võrreldes kontrollrühmaga (P < 0.{{6} }1). Huvitaval kombel paranes rottide keskmine platvormi ületamiste arv pärast resveratrooli või CR-i manustamist märkimisväärselt, võrreldes D-gal rühma omaga (P <0,01). Siiski ületasid resveratrooli ja D-gal rühma suurtes annustes rotid platvormi sagedamini kui CR pluss D-gal rühma kuuluvad rotid.

Need tulemused näitasid, et vananevatel mudelrottidel olid ruumilise õppimise ja mälu häired, samas kui resveratrooli või CR-ravi võib taastada D-gal manustamisest põhjustatud vanusega seotud kognitiivse kahjustuse. Lisaks näitasid suure resveratrooli annusega ravitud vananevad mudelrotid käitumises suhteliselt tõhusamalt kui CR-ga ravitud rotid.

Resveratrooli ja CR mõju SOD, T-AOC, MDA ja lipofustsiini tasemele vananevatel rottidel

SOD, T-AOC, MDA ja lipofustsiini tasemeid rottidel hinnati, et kinnitada, kas resveratrooli ja CR vananemisvastast toimet vahendas D-gal manustamisest põhjustatud oksüdatiivse stressi leevendamine. Tabelis 1 on näidatud SOD, T-AOC ja MDA tasemed seerumis, maksas ja ajus normaalsetel ja vananevatel rottidel. Kokkupuude D-gal-ga vähendas oluliselt SOD ja T-AOC taset, kuid suurendas MDA taset seerumis, maksas ja ajus võrreldes kontrollrühmaga (P < 0,05). Resveratrooli või CR-i samaaegne ravi D-gal-ga rottidel põhjustas MDA taseme aktiivsuse languse, kuid suurendas SOD ja T-AOC tasemeid võrreldes D-gal rühmaga. Kuid võrreldes CR-raviga näitasid tulemused, et resveratrooli suure annuse manustamine oli suhteliselt parem.

Joonis 4: Resveratrooli ja kaloripiirangu mõju D-gal-ga ravitud rottide kehakaalule katse ajal. Kõik väärtused väljendati keskmisena ± SD. NG, negatiivne kontrollrühm; MG, mudeli kontrollrühm; RESL, madala annusega resveratrooli rühm; RESH, suur annus resveratrooli rühma; CR, kaloripiirangu rühm.

Joonis 5: Resveratrooli ja kaloripiirangu mõju D-gal-ga töödeldud rottide käitumisele Morrise veelabürindiga. (A) Latentsuste võrdlus platvormiga 4 koolituspäeva jooksul. Iga hiirega tehti 4 katset päevas. (B) Ujumiskiiruse võrdlus 4 treeningpäeva jooksul. (C) Nende ülesõiduplatvormide arvu võrdlus, millelt platvorm sondi proovimiseks eemaldati. (D) Tüüpiline ujumisrada proovikatses. Kõik väärtused väljendati keskmisena ± SD. * P < 0.05, **P < {{10}},01 võrreldes negatiivse kontrollrühmaga; # P < 0,05, ##P < 0,01 võrreldes mudeli kontrollrühmaga. NG, negatiivne kontrollrühm; MG, mudeli kontrollrühm; RESL, madala annusega resveratrooli rühm; RESH, suur annus resveratrooli rühma; CR, kaloripiirangu rühm.

Tabel 1: Antioksüdantide staatus iga rühma rottide kudedes ja veres

Märkus. Väärtused olid keskmised ± SD. * P < {0}}.05, **P < 0.01 võrreldes kontrollrühmaga (kõik rühmad); # P < 0,05, ##P < 0,01 võrreldes mudelirühmaga (CR-rühm ja RES-rühm); ∆P < 0,05, ∆∆P < 0,01 võrreldes CR rühmaga (RES rühm). NG, negatiivne kontrollrühm; MG, mudeli kontrollrühm; RESL, madala annusega resveratrooli rühm; RESH, suur annus resveratrooli rühma; CR, kaloripiirangu rühm.

on suhteliselt parem. Lipofustsiini akumuleerumine on aju vananemise üks kõige järjekindlamaid tunnuseid. Nagu on näidatud joonisel 6, ilmnes D-gal-ga ravitud rottidel lipofustsiini taseme oluline tõus võrreldes kontrollrühmaga (P < 0.01). Resveratrooli ja CR-ravi vähendas aga lipofustsiini akumuleerumist vananevate rottide ajukoores võrreldes D-gal-ga ravitud rottidega (P < 0,01). Lisaks ei olnud resveratrooli pluss D-gal rühma ja CR pluss D-gal rühma vahel erinevusi (P > 0,05).

Resveratrool ja CR suurendasid telomeraasi aktiivsust vananevatel rottidel

Hindasime resveratrooli ja CR mõju telomeraasi aktiivsusele maksas ja ajukoes (joonis 7). Meie tulemused näitasid, et ravil ei olnud olulist mõju telomeraasi aktiivsusele maksakudedes (P > 0.05). Kuid telomeraasi aktiivsus vähenes D-gal manustamise rühmas võrreldes kontrolliga (P < 0,05). Samal ajal võivad resveratrool või CR telomeraasi aktiivsust D-gal manustamisel pluss resveratrooli või CR-i ravirühmas üles reguleerida. Veelgi enam, resveratrooli rühma ja CR rühma vahel ei olnud erinevusi (P> 0, 05).

Joonis 6: Resveratrooli ja kaloripiirangu mõju lipofustsiini tasemele vananevatel rottidel. Kõik väärtused väljendati keskmisena ± SD. * P < 0.05 võrreldes negatiivse kontrollrühmaga; # P < 0,05 võrreldes mudeli kontrollrühmaga. NG, negatiivne kontrollrühm; MG, mudeli kontrollrühm; RESL, madala annusega resveratrooli rühm; RESH, suur annus resveratrooli rühma; CR, kaloripiirangu rühm.

Resveratrool ja CR suurendasid AAPH-indutseeritud SIRT1 mRNA ekspressiooni Et uurida SIRT1 rolli resveratrooli ja CR-i ravis, uuriti SIRT1 mRNA ekspressioonitasemeid IMR-90 rakkudes ja kudedes kvantitatiivse reaalajas RT-ga. PCR. Tulemused näitasid, et AAPH vähendas oluliselt SIRT1 mRNA ekspressiooni IMR-90 rakkudes. Resveratrool ja CR võisid tõhusalt taastada SIRT1 mRNA ekspressioonitasemeid AAPH-ga töödeldud rakkudes ning 10 μM resveratrooli oli optimaalne kontsentratsioon SIRT1 mRNA ekspressiooni stimuleerimiseks IMR-90 rakkudes (P < 0,01; joonis 8)