Nlrc3 knockout hiirtel ilmnesid pärast HTNV nakatumist neerupatoloogilised muutused

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Hantaani viirus (HTNV) nakatab inimesi ja põhjustab hemorraagilist palavikkuneeru-sündroom(HFRS). HFRS-i hästi iseloomustatud loommudelite väljatöötamine võib kiirendada vaktsiinikandidaatide ja raviainete testimist ning pakkuda kasulikku vahendit HFRS-i patogeneesi uurimiseks. Kuna NLRC3-l on mitu immunoregulatoorset rolli, uurisime Nlrc3-/- hiirte vastuvõtlikkust HTNV-nakkuse suhtes, et luua uus HFRS-i mudel. Nlrc3-/- hiirtel tekkis kaalulangus,neerude hemorraagia,ja tuubulite laienemine pärast HTNV-nakkust, võttes kokku paljud inimese HFRS-i kliinilised sümptomid. Veelgi enam, nakatunud Nlrc3-/- hiirtel oli suurem viiruskoormus seerumis, põrnas ja neerudes kui metsiktüüpi C57BL/6 (WT) hiirtel ning mõnel neist ilmnes rohkem hematoloogilisi häireid ja olulisi patoloogilisi muutusi mitmes elundis kui WT hiirtel. Meie tulemused näitavad, et HTNV-ga nakatunud Nlrc3-/- hiirtel võivad tekkida kliinilised sümptomid ja patoloogilised muutused, mis sarnanevad HFRS-iga patsientidele, mis viitab uuele mudelile kandidaatvaktsiinide ja ravimite patogeneesi uurimiseks ja testimiseks.

Märksõnad:HFRS, HTNV, NLRC3, neeruverejooks, neerutuubulite laienemine

SISSEJUHATUS

Hemorraagiline palavik koosneeru-sündroom (HFRS) kujutab endast ägedat interstitsiaalset nefropaatiat pärast hantaviiruste zoonootilist ülekandumist närilistelt inimestele. Haigus esineb peamiselt Aasias ja Euroopas (1, 2). Kõige levinumad HFRS-i põhjustavad patogeenid on Dobrava viirus (DOBV), Puumala viirus (PUUV), Souli viirus (SEOV) ja Hantaani viirus (HTNV), millest igaüks põhjustab erineva raskusastmega HFRS-i. Haiguse tunnused on erinevad Põhja- ja Lõuna-Ameerikas, kus hantaviiruse infektsioon põhjustab hantaviiruse kopsusündroomi (HPS), peamiselt Andide viiruse (ANDV) ja Sin Nombre viiruse (SNV) poolt (3).

HFRS esineb kõrge palaviku, hüpotensiooni,neerupuudulikkus ja hemorraagia(4). Selle võib jagada viieks kliiniliseks etapiks: palavikuline, hüpotensiivne šokk, oliguurne, diureetikum ja taastuv. HTNV infektsiooni ägeda episoodiga, mis põhjustab HFRS-i, kaasneb sageli trombotsütopeenia, leukotsütoos, aneemia, seerumi kreatiniini ja maksaensüümide aktiivsuse tõus (5). Neid kliinilisi sümptomeid ja tunnuseid saab osaliselt seletada asjaoluga, et HTNV ründab peamiselt neere ja kutsub esile neerukahjustuse, mida iseloomustab äge tubulointerstitsiaalne nefriit, millega kaasneb põletikuliste rakkude infiltratsioon (6), mis kahjustab seetõttu mitmeid teisi organeid (7).

Närilised on hantaviiruste loomulikud reservuaarid, mis nakatavad loomi püsivalt haigusi põhjustamata (8). Nende väljaheited, nagu sülg, uriin ja väljaheited, muutuvad potentsiaalseteks saasteaineteks, mis võivad nakatada inimesi, kes hingavad sisse saastunud väljaheidete väikeste osakeste aerosoole. Hantaviirused põhjustavad tavaliselt täiskasvanud BALB/c ja C57BL/6 hiirtel asümptomaatilise infektsiooni (9), kuid imetavatel ja vastsündinud hiirtel surmavat neuroloogilist haigust või püsivat infektsiooni (10, 11). Kuigi eksperimentaalselt PUUV-ga nakatunud makaakidel (Macaca fascicularis) demonstreeriti nefropaatilisi kõrvalekaldeid, ilmnes neil loomadel vaid kerge proteinuuria, immuunrakkude infiltratsioon ja neerude tubulaarne kahjustus, sarnaselt kerge HFRS-i juhtumiga (12). Lisaks põhjustasid nina kaudu HTNV-ga nakatunud hamstrid püsiva asümptomaatilise infektsiooni, mida iseloomustas sporaadiline vireemia, kuid kõrge viiruse genoomi koopiate tase kopsudes, ajus ja neerudes. Lihassüstiga suures annuses HTNV-ga nakatunud tuhkrutel vähenes kehakaal järk-järgult (5-12 protsenti aja jooksul), kuid need olid tervedneerufunktsioonid,vireemia puudumine ja viiruse edasikandumise puudumine elunditesse. Marmosettidel põhjustas HTNV intramuskulaarne süstimine serokonversiooni ja neutraliseerivate antikehade tootmise kõrge taseme; järjekindlalt ei olnud neil loomadel neerukahjustusi, vireemiat ega viiruse ülekandumist elunditesse (13).

Vaatamata nende ebatäiuslikkusele kasutati hantaviiruse patogeneesi uurimiseks laialdaselt rotte ja hiiri kasutavaid loommudeleid (14). Yoshimatsu jt. näitas, et SCID-hiirte nakatumine HTNV-ga põhjustas surmava kurnatushaiguse koos kopsutursega (15, 16) ja neutrofiilide vähenemine takistas kopsuturse teket, kuid HFRS-i iseloomulikke hemorraagilisi kahjustusi ei leitud (15). Shimizu et al. leidis, et HFRS-i patsientidest eraldatud HTNV võib nakatada veenisiseselt 6-nädalaseid emaseid BALB/c hiiri, põhjustades 6-9 päevaks vireemiat, millel on haigusnähud, sealhulgas ajutine kaalulangus, juuste kortsud, neerude eksudatsioon (17). ). Samas hiiremudelis oli makroskoopiline hemorraagia vahelisel piirilneerukoorja medulla, kuid seda, kas täheldatud histopatoloogilised muutused olid seotud neerufunktsiooni langusega, ei olnud uuritud. Humaniseeritud hiirtel põhjustab HTNV-nakkus kehakaalu langust, aktiivsuse vähenemist, turritavat karva ja kopsuvigastusi, mis tundub, et kops on viirusinfektsiooni peamine sihtorgan (18). Seetõttu on endiselt vaja sobivat HTNV-nakkuse loommudelit, mis hõlmaks enamikku HFRS-i haigustunnustest.

cistanche arvustusedjaoksneerutuubulite laienemine

NLR-id on kõige silmapaistvam rakusiseste kaasasündinud immuunretseptorite perekond ja neil on kaasasündinud immuunsuse reguleerimisel erinevad funktsioonid. Ehkki tuntuimatel NLR-idel (nt NLRP3) on põletikulise ja immuunsüsteemi aktiveerimisel positiivne regulatiivne funktsioon, omab ebatavaline NLR-ide alarühm, mis on määratletud kui inhibeerivad NLR-id, põletikulistes reaktsioonides inhibeerivat funktsiooni. NLR-vahendatud kaasasündinud immuunsupressiooni mehhanismi mõistmiseks on uuritud inhibeerivate NLR-ide, nagu NLRC3 ja NLRX1, ligande (19). NLRC3 on negatiivne regulaator, mis nõrgendab I tüüpi interferooni (IFN-I) vastust, eraldades ja nõrgendades interferoonigeenide (STING) aktivatsiooni (19). NLRX1 kui keskne homöostaatiline väravavaht mitokondriaalse bioloogia ja immunoloogilise vastuse vahel on seotud paljude haigustega, nii patogeeni poolt põhjustatud kui ka muude haigustega (20). Kuna HTNV-haigusel on palju põletiku ja immuunsüsteemi aktiveerimise häireid, valisime haiguse molekulaarsete mehhanismide uurimiseks Nlrc3-/- hiired.

See uuring näitas, et Nlrc3-/- hiirte mudel sarnaneb HFRS-iga patsientidel täheldatud süstemaatilistele vigastustele, mida iseloomustab trombotsütopeenia,neerutuubulite laienemine ja hemorraagia.Viirusliku koormuse analüüs näitas, et Nlrc3-/- hiirtel esines suurem viiruskoormus mitmetes kudedes, sealhulgas seerumis, põrnas ja neerudes. Meie uuringud loovad HTNV-nakkuse hiiremudeli, mis on kasulik kandidaatvaktsiinide ja ravimite hindamiseks.

MEETODID

VVirus aktsiad

HTNV tüve {{0}} annetas Changshou Hang (Hiina haiguste tõrje ja ennetamise keskus) ning seejärel säilitati ja laiendati seda meie laboris. Viiruse paljundamiseks kasutati Vero E6 rakke ja nakkuslikud tiitrid määrati 50-protsendilise koekultuuri nakkusliku doosi (TCID50) abil immunofluorestsentsanalüüside (IFA) abil. Teisendamine TCID50 ja naastude moodustavate ühikute (PSU) vahel põhines järgmisel arvutusel: 1 PFU ≈0,7 × TCID50 (21).

põlvkonna Nlrc3 Knockout Mouse Model

Metsiktüüpi C57BL/6J hiired ja Nlrc3 knockout (Nlrc3−/−) hiiremudelid kujundas ja arendas Shanghai Model Organisms Center, Inc (Shanghai, Hiina). Nlrc3-/- hiire saamiseks valmistati Cas9 mRNA ja sgRNA-d in vitro transkriptsiooniga. Kaks sgRNA-d, mis on suunatud Nlrc3 geeni eksonite 2-3 kustutamisele: 5'- GTTGGTCTAATAAGCATCCTGGG {{10}', 5'- TCCCATGAAACCATGTCAGAAGG -3'. C57BL / 6J hiirte sigoodid võeti vastu ja süstiti neile in vitro transkribeeritud Cas9 mRNA ja sgRNA-dega ning kanti üle pseudorasedatele retsipientidele. Saadud F0 hiirte genotüüp tuvastati ja kinnitati PCR-i ja sekveneerimisega, kasutades praimeripaare: F-5'- GTGATGTCTGCTTACC CCGTCTCC -3'; R-5'- GCCTGTGCCGCCTCTCA -3'. Ristades C57BL/6J hiirtega, valiti positiivsed F0 hiired, et saada F1 heterosügootsed Nlrc3 knockout hiired. PCR ja sekveneerimisanalüüs kinnitasid saadud F1 hiired. Heterosügootsete Nlrc3-/- hiirte saamiseks ristati juhuslikult emased ja isased F1 heterosügootsed hiired. Kõigis uuringutes kasutati hiiri vanuses 6–8 nädalat.

Loomade nakatumine ja proovide ettevalmistamine

Kokku 5x105 PFU HTNV-d 50 ul söötmes inokuleeriti intraperitoneaalselt. Kontrollrühmade hiired said identse koguse PBS-i. Kasutati 20 kuni 25 Nlrc3-/- või WT hiirt. Igat tüüpi hiired jaotati viide rühma proovide võtmiseks 0, 3, 6, 9 ja 12 päeva pärast nakatumist. Kehakaalu ja päraku temperatuuri registreeriti iga päev. Igal ajahetkel surmati testimiseks neli kuni viis looma mõlemast rühmast. Viroloogiliseks analüüsiks koguti värsked koeproovid südamest, maksast, põrnast, kopsust, neerust ja ajust ning seejärel külmutati kohe -80 kraadi juures. Hiiri perfuseeriti külma PBS-ga ja elundid fikseeriti 4-protsendilises paraformaldehüüdis histoloogiliseks ja immunohistokeemiliseks analüüsiks 4 tundi. Vereproovid koguti viiruskoormuse testimiseks ja rutiinseks vereuuringuks ning seerum eraldati biokeemilise analüüsi jaoks.

Tsütokiini analüüs

Iga hiire kokku 25 ml seerumit analüüsiti 13 erineva tsütokiini suhtes LEGENDplex™ Mouse Anti-Virus Response Panel (13-plex) (BioLegend) abil vastavalt tootja juhistele. Tuvastamiseks kasutati FACS Calibur tsütomeetrit (Becton Dickinson Biosciences, CA). Andmeid analüüsis LEGENDplex v8.{5}}. Tarkvara.

Reaalajas RT-PCR analüüs

Iga hiire koeproovid kaaluti ja sukeldati PBS-i ning homogeniseeriti automaatse homogenisaatoriga TissueLyser II (QIAGEN, Saksamaa), kasutades sagedust 30/s ja aega 5 min. RNA täielikuks ekstraheerimiseks viidi 200 ml koe homogenaati 500 ml TRIzol reagendisse, millele järgnes ekstraheerimine kloroformiga ja sadestamine isopropanooliga. 140 ml seerumiproove viidi RNA ekstraheerimiseks 560 ml AVL puhvrisse, mis sisaldas kandja-RNA-d (Qiagen, UK), kasutades QIAamp Viral RNA Mini komplekti (Qiagen, UK). Lõpuks lahustati RNA uuesti RNaasi-vabas vees. Igast proovist viiruse RNA tuvastamiseks viidi läbi HTNV-spetsiifiline reaalajas RT-PCR test. Spetsiifiliselt HTNV segmenti sihtivad praimerijärjestused võeti vastu järgmiselt: F-5'- GATCAGTCACAGTCTAGTCA- 3' ja R-5'- TGATTTCTTCCACCATTTTGT-3'. qRT-PCR testis kasutati One-Step TB Green PrimeScript™ RT-PCR komplekti II (Perfect Real Time) (Takara, Jaapan). Viimane põhisegu (20 ml) sisaldas 2 ml RNA-d, 5,6 ml RNaasivaba dH2O, 0,8 ml edasisuunamis- ja pöördpraimerit (10 mM), 0,8 ml PrimScript 1 Step Enzyme Mix 2 ja 10 ml 2 × One Step TB Green RT-PCR puhver 4. Kasutatud tsüklitingimused olid 42 kraadi 5 minutit, 95 kraadi 10 sekundit, seejärel 40 tsüklit 95 kraadi 0 sekundit, 65 kraadi 15 sekundit ja 95 kraadi 0 sekundit. Reaktsioonid viidi läbi ja analüüsiti LightCycleri platvormil (Roche Diagnostics, USA).

Viiruse koormuse absoluutne kvantifitseerimine

Viiruse RNA oligonukleotiidid kui RNA standard saadi DNA-st in vitro transkriptsiooni teel, kasutades MAXIscript Kit'i (Thermo Scientific, UK), mis sisaldas 562 testi sihtmärgiks olnud HTNV RNA alust (22) ja seejärel kvantifitseeriti ultramikroplaadi spektrofotomeetriga ( BioTek Epoch, USA), oli standardse RNA varu kontsentratsioon 800 ng/ml. Iga proovi viiruskoormuse hindamiseks valmistati standardne RNA 10-kordse seerialahjendusega, vahemikus 1010 koopiat kuni 103 koopiat reaktsiooni kohta. Meie standardse RNA tuvastamispiir on 1010 koopiat 101 koopiani reaktsiooni kohta ja seega seadsime selle testi tuvastamise läveks 100 genoomi koopiat reaktsiooni kohta. Käitusanalüüsi käigus loodi standardkõverad kaldega -3,6624, Y-lõikepunktiga 41,68 tsüklit ja R2 väärtusega 0,9996.

Valgutasemete analüüs Western Blottinguga

Hiire koeproovidest valmistati koelüsaadid. Valgu kontsentratsiooni tuvastamiseks kasutati bitsinhoniinhappe (BCA) valguanalüüsi komplekti (Thermo Scientific, UK). Valgu analüüsiks laaditi igast proovist 30 mg kogu valku SDS-polüakrüülamiidgeelile ja kanti üle NC-membraanidele. Seejärel kasutati 2 tunni jooksul toatemperatuuril blokeerimiseks 5% lõssilahust. Järgmisena lisati 1:1000 lahjendatud HTNV-NP vastane 1A8 monoklonaalne antikeha (valmistatud ja puhastatud meie laboris) (23, 24) ja inkubeeritud 4 kraadi juures üleöö. Lõpuks inkubeeriti membraane sekundaarsete antikehade, HRP-konjugeeritud küüliku hiirevastase IgG või HRP-konjugeeritud hiire küülikuvastase IgG-ga toatemperatuuril 2 tundi. Seejärel lisati valkude tuvastamiseks HRP kemoluminestsents-substraat. Valguribade intensiivsuse densitomeetriline analüüs viidi läbi Image J tarkvara (NIH, USA) abil. Normaliseerimiseks kasutati laadimiskontrollina b-aktiini.

Immunohistokeemiline analüüs

Koeproovid sisestati parafiini ja viilutati immunohistokeemiliseks värvimiseks 4 mm. Sektsioonid läbivad deparafineerimise ja rehüdratsiooni ning endogeensete peroksidaaside inaktiveerimise. Sektsioonid allutati antigeeni otsimisele tsitraatpuhvris (PH=6) 95 kraadi juures 10 minuti jooksul. Seejärel kasutati 40 minuti jooksul toatemperatuuril blokeerimiseks 5% tavalist kitseseerumit. mAb 1A8 kasutati HTNV NP antigeeni primaarse antikehana ja inkubeeriti koos koelõikudega 4 kraadi juures üleöö. Sellele järgnes värvimine FITC hiirevastase IgG-ga (Invitrogen) 37 kraadi juures 1 tund ja seejärel DAPI-ga 10 minutit toatemperatuuril. Piltide hankimiseks kasutati 3DHISTECHi (Ungari) ja andmete analüüsiks CaseViewer2.4.

Histoloogiline uuring

Rakkude ja koe morfoloogia säilitamiseks kasutati koeproovide kinnitamiseks histopatoloogiliseks analüüsiks 4 protsenti neutraalset puhverdatud formaliini. Neid kudesid töödeldi 5 mm lõikudeks ja seejärel värviti hematoksüliini ja eosiiniga (H&E). Lõpuks uuriti sektsioone valgusmikroskoopia abil ja pildid jäädvustas 3DHISTECH (Ungari), analüüsis CaseViewer2.4. Kahjustuste aste hinnati visuaalselt, kasutades eelseadistatud 4-hinnete süsteemi: normaalsetes piirides 0, minimaalne 1, kerge 2, mõõdukas 3, raske 4.

Loomade aineuuringudKõik loomkatsed kiitis heaks neljanda sõjaväemeditsiini ülikooli loomakeskuse laboratoorsete katsete komitee. (nr 20210403).

StatistikaAndmeid analüüsiti GraphPad Prism 9 tarkvara abil. Kui pole teisiti täpsustatud, esitati kõik andmed kui keskmine ± standardhälve (SD). T-teste või ühesuunalist ANOVA-d kasutati vastavalt jooniste legendidele. P-väärtust alla 0,05 peeti oluliseks.

TULEMUSED

Viiruskoormuse tuvastamine Nlrc3-/- hiirte erinevates organites pärast intraperitoneaalset HTNV-ga nakatumist

Nlrc3-/- hiirte tundlikkuse iseloomustamiseks HTNV-nakkuse suhtes nakatati rühm Nlrc3-/- hiiri intraperitoneaalselt 5 × 105 PFU-ga HTNV-ga hiire kohta, kasutades kontrollina WT-hiiri. Kõiki loomi jälgiti iga päev kliiniliste sümptomite, temperatuuri ja kehakaalu muutuste suhtes. Hiired surmati 3, 6, 9 ja 12 päeva pärast nakatumist (dpi), et analüüsida erinevaid laboratoorseid parameetreid, viiruskoormust ja patoloogiat. Nlrc3−/− hiired hakkasid kaalust alla võtma 4 dpi juures ja 6 dpi võrra registreeriti kaalulangus > 5 protsenti nende algsest kehakaalust. Võrdluseks, WT hiirtel kaalulangus ei ilmnenud (joonis 1A). Mõlemas rühmas palavikku ei registreeritud (joonis 1B). HTNV leviku ja replikatsiooni hindamiseks viirusega nakatunud hiirtel koguti seerum ja peamised organid (sealhulgas süda, maks, põrn, kops, neer ja aju) viiruse RNA koopiate arvu absoluutseks kvantifitseerimiseks. Tulemused näitasid, et vireemia esines mõlemas rühmas 3 dpi juures (Nlrc3-/- hiired: 943 ± 140 koopiaekvivalenti ml kohta; WT hiired: 803 ± 277 koopiat ml kohta). Nimelt saavutas WT hiirte seerumi viiruskoormus tipptasemel 3 dpi ja vähenes pärast seda kiiresti, samas kui Nlrc3-/- hiirtel püsis viiruskoormus vahepealsel tasemel kuni 6 dpi-ni ja vähenes seejärel järk-järgult madalale tasemele 9 dpi (joonis fig. 1C). Lisaks kogusime HTNV-ga nakatunud hiirte täisverd 0., 3., 6. ja 9. päeval pärast nakatumist, et määrata kindlaks viiruse replikatsioon veres. Tulemused näitasid, et viiruskoormus suurenes 3 dpi võrra ja seejärel vähenes, mis viitab viiruse replikatsioonile vererakkudes. Nagu on näidatud lisajoonisel 1, oli viiruse koopiate arv Nlrc3-/- hiirtel suurem kui WT hiirtel (Nlrc3-/- hiirtel: 5752 ± 502 koopiat ml kohta; WT hiired: 3589). ± 869 koopiat ml kohta) eraldusvõimega 3 dpi. Veelgi enam, Nlrc3−/− hiirte põrnades tuvastati 2- korda suurem viiruskoormus (3033 ± 175 koopiaekvivalenti mg kohta) kui WT hiirtel (1520 ± 425 koopiat mg kohta) 6 dpi juures; sama mustrit täheldati neerudes 9 dpi kohta (Nlrc3-/- hiired: 500 ± 87 koopia ekvivalente mg kohta; WT hiired: 270 ± 40 koopiat mg kohta) (joonis 1C). Üldiselt tuvastati Nlrc3 - / - hiirtel mõõdukalt kõrgem viiruskoormus kui WT hiirtel.

Järgmisena uurisime HTNV nukleoproteiini (NP) taset. Nagu on näidatud joonistel 2A, C, oli Nlrc3-/- hiirtel põrnas ja neerudes kõrgem viiruse antigeeni tase kui WT-hiirtel. Neerude ja põrna viirusantigeenide statistiline analüüs on näidatud vastavalt joonistel 2B ja 2D. Nlrc3-/- hiirte südames, maksas, kopsus ja ajus tuvastati viiruse antigeenide madal tase (täiendav joonis 2). Viiruse NP valgu tase Nlrc3-/- hiirte südames, kopsudes ja ajus oli valgu tasemel madalam kui WT hiirtel (täiendavad joonised 2B, F, H), kuid statistilist olulisust näidati südame ja aju vahel nii mRNA-l. ja valgu tase (täiendavad joonised 2A, E, I). See leid viitas aktiivsele viirusele

replikatsioon toimus pärast HTNV-nakkust Nlrc3-/- hiirte veres, põrnas ja neerudes. Lõpuks kasutasime HTNV NP ekspressioonitasemete tuvastamiseks põrnas ja neerus immunofluorestsentsi. HTNV NP FL fluorestsentsi intensiivsus oli neerudes kõrgemneeru-tuubulid (joonis 2E) ja põrna punane pulp (joonis 2F) Nlrc3-/- hiirtel kui WT hiirtel 6 dpi ja 9 dpi. Need tulemused näitavad koos, et Nlrc3 - / - hiired on vastuvõtlikumad HTNV intraperitoneaalsele infektsioonile.

Nlrc3-/- hiirte tavapärased vereanalüüsid pärast HTNV-ga nakatumist

On laialdaselt tunnustatud, et HFRS-i patoloogia on suures osas immuunvahendatud, sealhulgas immuunkompleksid, komplemendi aktiveerimine, T-raku vastus (24–26) ja HTNV-indutseeritud tsütokiinide tootmine (26, 27), mis põhjustab mitme organi vigastusi. Lisaks on trombotsütopeenia tavaline kliiniline tunnus viirusliku hemorraagilise palaviku (VHF) viirustega nakatunud inimestel. Seega teostasime kõigepealt hematoloogilise testi, kasutades täisverd, mis koguti Nlrc3-/- ja WT-hiirtelt sagedusega 3, 6, 9 ja 12 dpi. Tulemused näitasid, et WT hiirte PLT arv vähenes 3 dpi juures ja taastus seejärel järk-järgult, kuid Nlrc3−/− hiirtel vähenes see jätkuvalt, kuni saavutas madalaima väärtuse 9 dpi juures, mis on oluliselt madalam kui WT puhul 9 dpi juures (P<0.05) (figure="" 3a).="" the="" decrease="" of="" wbc="" counts="" was="" observed="" on="" 3="" dpi="" and="" then="" gradually="" recovered="" to="" normal="" levels="" in="" both="" mouse="" strains="" (figure="" 3b).="" to="" further="" dissect="" the="" subset="" changes="" in="" wbcs,="" we="" analyzed="" on="" 0,="" 3,="" 6="" dpi="" the="" number="" of="" monocytes,="" neutrophils,="" lymphocytes,="" and="" t="" cells="" by="" routine="" blood="" tests="" combined="" with="" fellow="" cytometry="" assay.="" the="" number="" of="">

suurenes märkimisväärselt Nlrc3 - / - hiirtel 6 dpi juures, kuid mitte WT hiirtel (joonis 3C). Neutrofiilid mõlemat tüüpi hiirtel vähenesid veidi, kuid taastusid 6 dpi juures keskmisele tasemele (joonis 3D). Lümfotsüütide arv vähenes märkimisväärselt 3 dpi juures, samal ajal kui WT hiirtel hakkasid nad tõusma 6 dpi juures, jäi lümfotsüütide arv Nlrc3-/- hiirtel 6 dpi juures madalale tasemele (joonis 3E). CD3 pluss CD4 pluss T-rakkude ja CD3 pluss CD8 pluss T-rakkude suhe perifeerses veres määrati kaastsütomeetriaga ja leiti, et see suurenes 3 dpi juures ja pöördus seejärel kiiresti 6 dpi juures, mis on kooskõlas HFRS-i patsientidel sageli täheldatud muutustega (joonis). 3F), kellel CD4 pluss T-rakud dramaatiliselt vähenesid ja CD8 pluss T-rakud jäävad muutumatuks või kompenseerivad laienemist, mille tulemuseks on CD4/CD8 vastupidine suhe. Need leiud viitasid sellele, et HTNV intraperitoneaalne inokuleerimine Nlrc3-/- hiirtesse kutsus mingil määral esile HTNV-ga nakatunud patsientide peamised kliinilised tunnused, nagu trombotsütopeenia ja vastupidine CD4/CD8 T-rakkude suhe.

Patoloogilised muutused nakatunud Nlrc3−/− hiirte neerudes näitavad märgatavat neerude interstitsiaalset hemorraagiat ja neerutuubulite laienemistJärgmisena hinnati HTNV-ga nakatunud hiirte patoloogilisi muutusi H&E värvimisega ja leiti, et need esinevad kõigi nakatunud Nlrc3-/- hiirte neerudes, mis ilmnesid ödeemina.neeru-torukujulised epiteelirakud. 6 dpi juures täheldati hemorraagilisi kahjustusineeru-medulla (joonis 4A).Neerutuubuldilatatsiooni täheldati juba 3 dpi juures, selle raskusaste saavutas haripunkti 9 dpi juures ja püsis kuni 12 dpi ning see on Nlrc3-/- hiirtel rohkem väljendunud kui WT hiirtel (joonised 4B, C). Need leiud näitasid

et ägedat nefropaatiat iseloomustabneerutuubulidlaienemine janeerude interstitsiaalne hemorraagiaindutseeriti HTNV-ga nakatunud Nlrc3-/- hiirtel. Mis puutub muudesse patoloogilistesse muutustesse maksas, põrnas ja kopsudes, siis nende kahe hiirerühma tulemused olid sarnased. Need hõlmasid peamiselt ekstramedullaarset vereloomet põrnas, alveolaarseina paksenemist kopsus ja maksa degeneratsiooni (täiendavad joonised 3A–F). Ülaltoodu põhjal sarnanesid Nlrc3-/- hiirte neerudes HTNV-nakkuse ägedas faasis täheldatud patoloogilised tunnused tihedalt inimese HFRS-i juhtude kliinilis-patoloogiliste muutustega.

Selle põhjal uurisime täiendavalt seotud vere ja uriini indekseid hiirtel neeru funktsionaalsete häirete osas. Hiire seerumid koguti alaniinaminotransferaasi (ALT), kreatiinkinaasi MB fraktsiooni (CK-MB), uurea ja kusihappe (UA) hindamiseks. Nagu on näidatud joonisel 4D, oli seerumi UA tase võrreldes kontroll-WT hiirtega oluliselt kõrgem Nlrc3-/- hiirtel 3 dpi juures, seerumi CK-MB tõusis Nlrc3-/- hiirtel märkimisväärselt 9 dpi juures, kuid seerumi tase ALT, UREA ja CREA ei näidanud tõusu (täiendav tabel 1).

Neerudosalemine PUUV-ga nakatunud HFRS-is hõlmab mööduvat proteinuuriat, mikroskoopilist, kuid harva nähtavat hematuuriat ja oliguurset AKI-d, millele järgneb polüuuria ja taastumine. Selle haiguse proteinuuria tüüpiline tunnus oli selle kiire vähenemine pärast haiguse ägedat faasi (6). Suurel hulgal erinevatest etioloogiatest põhjustatud ägeda tubulointerstitsiaalse nefriidiga patsientide rühmas leiti proteinuuria vaid ühel neljandikul patsientidest, samas kui ainult 2 protsendil kõigist patsientidest leiti nefrootilise ulatusega proteinuuria (28). Kogusime uriini 0, 3, 6 dpi ja avastasime, et uriini valgu tase tõusis 3 dpi, infektsiooni ägeda faasi korral. Nakatunud Nlrc3-/- hiirtel ja WT hiirtel suurenes uriini valgu kontsentratsioon oluliselt ja keskmine väärtus oli 0,3 g/l lähedal 3 dpi juures (joonis 4E).

Sisse imbunud põletikuliste rakkude uurimiseksneeru-interstitsiaalne pärast HTNV-nakkust, teostasime immunohistokeemia (IHC) värvimise CD3, F4/80 ja CD11b-ga. Tulemused näitasid, et CD3 suhtes positiivsete immuunrakkude rühm on imbunud immuunsüsteemineeru-interstitsiaalne pärast HTNV infektsiooni (joonis 5A) ja CD11b suhtes positiivsed müeloidrakud ilmusid kortikaalsesse tubulointerstitsiaali (joonis 5B). Infiltreeruvate CD3 pluss T-rakkude ja CD11b pluss müeloidrakkude osakaal on nakatunud Nlrc3-/- hiirtel oluliselt suurem kui WT-hiirtel, kuid F4/80 suhtes positiivsed makrofaagid on jaotunud kogu neerukoores ja medullas ega näidanud märkimisväärset tähtsust. erinevus nende kahe hiiretüübi vahel (joonis 5C).

HTNV infektsioon kutsus Nlrc3−/− hiirtel esile tugeva tsütokiinivastuse

Põletikuliste tsütokiinide ületootmist on sageli teatatud HFRS-iga patsientidel ja see on tekitanud hüpoteesi, et tsütokiinide düsregulatsioonil võib olla haiguse patogeneesis keskne roll. Vaheri jt. (8) leidsid, et vastusena põletikku soodustavatele signaalidele, nagu viirusnakkus, toodavad mitmed tsütokiinid erinevad rakud, nagu makrofaagid, monotsüüdid ja lümfotsüüdid. Wang et al. teatas, et TNF-a, IL-6, IFN-g, IL-8, IP-10 ja RANTES (kuid mitte IL-4) kontsentratsioon seerumis oli palju kõrgem HFRS-i patsientidel (29) võrreldes kontrollidega; ja et kõrgeimad kontsentratsioonid leiti tavaliselt palaviku, hüpotensiivse ja oliguurse faasi ajal, eriti raskete ja kriitilist tüüpi HFRS-i juhtudel. Kõrget plasma IL-6 taset seostati rasketeneeru-PUUV-indutseeritud HFRS-i ebaõnnestumine ja trombotsütopeenia ning seda võib kasutada haiguse tõsiduse markerina.

Meie tulemused näitasid, et HTNV-nakkus suurendas tsütokiinide tootmist, sealhulgas CXCL-1, CCL-5, IL-6, IL-12, TNF-a ja IFN-g Nlrc3-/- hiirtel ja nende tsütokiinide tase oli 6 või 9 dpi juures; Võrdluseks, WT hiirtel oli kogu nakkusprotsessi vältel nõrgem tsütokiinivastus (joonis 6).

Kokkuvõtteks avastasime selles uuringus, et pärast HTNV intraperitoneaalset inokuleerimist areneb Nlrc3-/- hiirtel kaalulangus,neerude hemorraagiaja tuubulite laienemine. Need tunnused meenutavad HFRS-i kliinilisi sümptomeid rohkem kui ükski teine ​​varem avaldatud loommudel. Veelgi enam, Nlrc3-/- hiirtel oli ka suurem viiruskoormus seerumis, põrnas ja neerudes kui WT-hiirtel ning Nlrc3-/- hiirtel tekkisid hematoloogilised häired ja olulised patoloogilised muutused mitmes elundis, mis tekitas Nlrc3-/ HTNV-nakkuse. − hiired kui uus mudel HFRS-i uurimisel.

ARUTELU

Siin kirjeldatud HFRS-i hiiremudel näitab, et HTNV-ga nakatunud Nlrc3-/- hiired on sobiv väikeloommudel, mida saab kasutada HFRS-i vaktsiinide ja ravimite hindamiseks. Nlrc3-/- hiiremudel meenutab inimestel täheldatud süstemaatilist vigastust, mida iseloomustavad trombotsütopeenia, lümfotsütopeenia, kõrgenenud seerumi AST (maksafunktsiooni häire), LDH, kreatiinkinaasi MB fraktsioon ja UA(neerufunktsiooni häired). Lisaks tekkis Nlrc3-/- hiirtel kaalulangus ja ilmneneerude hemorraagia. Kopsudes, põrnas, maksas ja neerudes tuvastati viiruse replikatsioon ja histopatoloogilised muutused sihtorganites. Lisaks leiti Nlrc3-/- hiirte veres, põrnas ja neerudes mõõdukalt kõrgem viiruse RNA koormus. Võrdluseks, WT hiirtel tekkisid kerged histoloogilised muutused hoolimata viiruse RNA tuvastamisest veres, põrnas ja neerus.

Our findings are generally in agreement with what would be expected for HTNV infection-induced HFRS and signify an improvement over previously published animal models. It has been reported that hemorrhagic fever (HF) virus infection in animal models can lead to a spectrum of diseases from asymptomatic to mild and severe and often transient viremia. A transient weight loss usually manifests mild illness, but severe disease showed more significant weight loss (>20 protsenti) (30). Näiteks põhjustasid nina kaudu HTNV-ga nakatunud hamstrid püsiva asümptomaatilise infektsiooni, mida iseloomustab juhuslik vireemia, kuid kõrge viiruse genoomi koopiate tase kopsudes, ajus ja neerudes. Lihassüstiga suures annuses HTNV-ga nakatunud tuhkrutel vähenes kehakaal järk-järgult (5-12 protsenti aja jooksul), kuid need olid tervedneerufunktsioonid, vireemia puudumine ja viiruse edasikandumise puudumine elunditesse. Marmosettidel põhjustas HTNV intramuskulaarne süstimine serokonversiooni ja neutraliseerivate antikehade tootmise kõrge taseme; järjekindlalt ei olnud neil loomadel neerukahjustusi, vireemiat ega viiruse ülekandumist elunditesse (13).

Mis puutub tähelepanekusse, et hematoloogilised muutused, mida täheldati ainult ühel ajahetkel ja tsütokiinide muutused ei ole olulised, siis arvame, et need on seletatavad HTNV infektsiooni olemusega, mis on sarnane paljudele teistele viirusnakkustele, mis mõjutavad mitut elundit ja seetõttu sageli. ühe parameetri püsivaid muutusi on raske leida. Üldiselt on meie tulemused üldiselt kooskõlas valdkonna olemasolevate teadmistega. Veelgi enam, Nlrc3-/- hiirte avastamine, kellel on suurem vastuvõtlikkus HTNV-nakkuse suhtes ja millel on palju muutusi, mis on sarnased HFRS-i patoloogiliste muutustega, on valdkonda uus panus. Üldiselt aktsepteeritakse, et inimese veresoonte endoteelirakud on hantaviiruse peamised sihtmärgid. , mis põhjustab erineval määral üldistatud kapillaaride laienemist ja turset (31).

Viiruse antigeene võib leida erinevate kudede kapillaaride endoteelis (hantaviirused suunavad endoteelirakkude läbilaskvust, sensibiliseerides rakke veresoonte läbilaskvusfaktori VEGF suhtes, samas kui angiopoetiin 1 ja sfingosiin1-fosfaat inhibeerivad hantaviiruse poolt suunatud läbilaskvust). Histoloogiline analüüs näitas, et täheldati Nlrc3-/- hiirte neereneerutuubuliddilatatsioon 9 dpi juures, Nlrc3-/- hiirtel, kellel olid raskemad patoloogilised muutused kui WT-hiirtel ja mis püsisid 12 dpi juures. Nlrc3-/- hiirtel täheldati neerudes neerutorukeste epiteelirakkude turset ja märkimisväärset neerude interstitsiaalset hemorraagiat. Lisaks täheldati 6, 9 ja 12 dpi juures silmapaistvat ekstramedullaarset vereloomet põrna punases pulbis ning idukeskuse laienemist ja mitmetuumaliste hiidrakkude arvu suurenemist 12 dpi juures. Maksad näitasid ka tõsist hepatotsüütide degeneratsiooni ja hajutatud nekroosi päevadel 3, 6, 9 ja 12 dpi. Kopsupõletikku ja alveolaarseina paksenemist täheldati 6 dpi juures. See leid viitab sellele, et HTNV infektsioonil oli märkimisväärne ja pikaajaline mõju maksale ja neerudele HTNV-ga nakatunud Nlrc3-/- hiirtel. Lisaks olid silmapaistvad Nlrc3-/- hiiredneerutuubulite laienemine, interstitsiaalne hemorraagia ja neerufunktsiooni häired pärast HTNV infektsiooni. Seerumi UA tase tõusis märkimisväärselt 3 dpi juures, mis näitab selgelt neerufunktsiooni häireid. Nakatunud Nlrc3-/- hiirtel tõusis uriini valgu kontsentratsioon märkimisväärselt ja keskmine väärtus oli 3 dpi juures 0,3 g/l lähedal. Sama UA suurenemise suundumust ei täheldatud WT hiirtel. Need tulemused viitavad sellele, et meie mudel võtab kokku inimese HTNV nakkuse patoloogilisemad tunnused.

N-valku (NP) toodetakse ohtralt hantaviirusega nakatunud rakkudes ja seda saab tuvastada juba 4 tundi pärast nakatumist (32). Need omadused on peamiseks põhjuseks, miks ELISA lõpp-punktiks on hantaviiruse N valgu ja immunofluorestsentsanalüüside tuvastamine viirusosakeste arvu ja viirusinfektsiooni progresseerumise hindamiseks. Erinevad meetodid võivad mõjutada saadud tulemusi ja tehtud järeldusi. Viirusvalk ja vireemia on viirusinfektsiooni kaks erinevat parameetrit ja need ei pruugi alati muutuda sünkroonselt. Kvantitatiivse reaalajas PCR tulemused näitasid, et põrnas toimus 6 dpi juures NP taseme mööduv tõus, kus viirus võis läbida mööduva replikatsiooni, millele järgnes selle kliirens. Ootuspäraselt täheldati viiruse valkude akumuleerumist pärast vireemia tippu, mis ilmnes 3 dpi juures. Tõepoolest, viiruse replikatsioon põrnas ja neerudes püsis mõõdukal tasemel 9 ja 12 dpi juures, millega kaasnes N-valgu süntees (põrn 9 dpi juures: WT hiired: 192 ± 128 koopiat mg kohta; Nlrc3-/- hiired: 431 ± 12 dpi 229 koopiat mg kohta; põrn 12 dpi juures: WT hiired: 160 ± 85 koopiat mg kohta; Nlrc3-/- hiired: 226 ± 118 koopiat mg kohta). Kuid HTNV NP kogus valgu tasemel saavutas maksimumi päeval 6 pi ja püsis kõrgendatud kogu 9 ja 12 dpi. Viiruse RNA koopiate ja valgu koguse kineetika erinevus võib peegeldada nende erinevat lagunemist erinevates organites.

Tsütokiinide roll on haigusmudelites tavaliselt keerulisem. PUUV-indutseeritud HFRS korral raskeneerupuudulikkusja trombotsütopeenia on seotud kõrge plasma IL{0}} tasemega (33). Meie analüüs näitas, et HTNV-nakkus suurendas tsütokiinide tootmist, sealhulgas CXCL-1, CCL-5, IL-6, IL-12, TNF-a ja IFN-g Nlrc3-/- hiirtel, kuid mitte nii palju WT-hiirtel. Väärib märkimist, et 9 dpi juures näitasid Nlrc3-/- hiirtel põrnas ja neerus märkimisväärseid patoloogilisi muutusi, millega kaasnes sel ajal tugev tsütokiinivastus. Need leiud näitavad, et tsütokiinide kõrge tase võib olla seotud haiguse patogeneesiga.

Kokkuvõttes näitavad siin esitatud tulemused, et pärast intraperitoneaalset HTNV-ga nakatamist tekib Nlrc3-/- hiirtel kaalulangus, trombotsütopeenia, rneerufunktsiooni häired ja hemorraagia.Need sarnanevad rohkem HFRS-i kliinilistele sümptomitele kui ükski teine ​​varem avaldatud loommudel. Seda mudelit saab kasutada potentsiaalsete vaktsiinide ja ravimite hindamiseks ning HFRS-i patogeneesi põhjalikuks uurimiseks in vivo.