NGF moduleerib kolesterooli metabolismi ja stimuleerib ApoE sekretsiooni gliiarakkudes, andes neuroprotektsiooni oksüdatiivse stressi vastu, 1. osa

Abstraktne:

Kolesterool mängib olulist rolli ajus, kus astrotsüütiline aktiivsus reguleerib eriti ainevahetust. Tõepoolest, täiskasvanud neuronid pärsivad oma kolesterooli biosünteesi ja impordivad selle sterooli astrotsüütidest sekreteeritud ApoE-rikaste osakeste kaudu. Hiljutised tõendid näitavad, et närvikasvufaktor (NGF) võib avaldada neurotroofilist aktiivsust, mõjutades rakkude metabolismi.

Neuronid on põhiüksused, mis moodustavad inimese aju. Neuronite vaheliste ühenduste kaudu moodustavad nad meie ajukoore, mis kannab endas kõiki meie teadmisi ja mälestusi. Seetõttu on neuronid tihedalt seotud mäluvõimega.

Neuronite põhiülesanne on teabe edastamine. Igal neuronil on sünaps, mis ühendab teiste neuronite dendriite ja aksoneid. Kui neuron võtab vastu signaali, edastab see signaali neuronitele, millega ta on ühendatud. See signalisatsioon, mida nimetatakse neuronaalseks ülekandeks, on üks võtmeprotsesse mälu moodustamisel, säilitamisel ja taastamisel.

Aju tervena hoides saame treenimise kaudu edendada oma neuronite nõuetekohast toimimist. Füüsiline treening parandab aju vereringet ja hapnikuga varustamist, suurendades seeläbi neuronite arvu ja ühendusi. Samal ajal võivad mitmekesised sotsiaalsed ja õppimistegevused moodustada uusi neuroneid uutes ajupiirkondades ja suurendada aju plastilisust.

Kui meil on rohkem aktiivseid neuroneid, muutub meie mälu tugevamaks. Ajukoore neuronite vaheline sünkroon muutub ühtlasemaks, muutes meil teabe salvestamise ja hankimise lihtsamaks, parandades meie kognitiivseid võimeid. Lisaks parandab suur hulk neuroneid ja neuronitevahelised ühendused ka meie reaktsioonikiirust ja otsustusvõimet.

Seetõttu käivad tervete neuronite säilitamine ja mälu parandamine käsikäes. Me saame parandada oma mälu, edendades terveid neuroneid, keskendudes kehalisele treeningule, erinevatele sotsiaalsetele ja õppetegevustele ning toitumisharjumustele. Teeme koostööd oma aju tervise toetamiseks! On näha, et me peame oma mälu parandama. Cistanche deserticola võib oluliselt parandada mälu, sest Cistanche deserticola on traditsiooniline Hiina ravimmaterjal, millel on palju ainulaadseid toimeid, millest üks on mälu parandamine. Hakkliha tõhusus tuleneb erinevatest selles sisalduvatest toimeainetest, sealhulgas karboksüülhappest, polüsahhariididest, flavonoididest jne. Need koostisosad võivad erinevate kanalite kaudu edendada aju tervist.

Klõpsake teada, kuidas ajufunktsiooni parandada

Sellegipoolest ei ole NGF-i mõju gliaalkolesterooli homöostaasile veel välja selgitatud. Selle projekti eesmärk on hinnata, kas NGF võib mõjutada kolesterooli metabolismi gliiarakkudes. Selle eesmärgi saavutamiseks kasutati eksperimentaalse mudelina U373 astrotsüütidest pärinevat rakuliini. Immunoblot ja ELISA analüüs näitasid, et kolesterooli metabolismi võrgustikku kuuluvad valgud ja ensüümid suurenesid gliiarakkudes NGF-i töötlemisel. Lisaks suurendas NGF märkimisväärselt ApoE sekretsiooni ja rakuvälise kolesterooli kogust söötmes.

Ühiskultuuri ja U373-konditsioneeritud söötme katsed näitasid, et NGF-ravi neutraliseerib tõhusalt rotenooni vahendatud tsütotoksilisuse N1E-115 neuronaalsetes rakkudes. Seevastu NGF-ravi vahendatud neuroprotektsioon pärssis, kui N1E-115 kultiveeriti koos ApoE-ga vaigistatud U373 rakkudega. Need andmed viitavad sellele, et NGF kontrollib kolesterooli homöostaasi gliiarakkudes. Veelgi olulisem on see, et NGF avaldab neuroprotektsiooni oksüdatiivse stressi vastu, mis on tõenäoliselt seotud gliaalse ApoE sekretsiooni indutseerimisega.

Märksõnad:

ApoE; astrotsüüt; kolesterool; diferentseerimine; närvi kasvufaktor; ainevahetus; neuron; reaktiivsed hapniku liigid; rotenoon.

1. Sissejuhatus

Aju iseloomustab kõrgeim kolesteroolisisaldus kogu kehas [1]. Selle sterooli erakordne kontsentratsioon kesknärvisüsteemis (KNS) on põhjendatud asjaoluga, et kolesterool osaleb mitmetes fundamentaalsetes bioloogilistes protsessides. Märkimisväärne kogus kolesterooli on integreeritud astrotsüütide ja neuronite plasmamembraanidesse, kus see määrab õige raku morfoloogia ning membraaniretseptorite õige toimimise ja sünaptilise neurotransmissiooni [2].
Kolesterool on samuti oluline neuriitide väljakasvuks, sünaptogeneesiks ja neurotransmitterite vabanemiseks vajalike uute membraanide moodustamiseks, mis on seega ülioluline neuronite diferentseerumisel ja küpsemisel [3–7].

Põhimõtteliselt pärineb kogu ajus leiduv kolesterool de novo biosünteesist in situ. Täpsemalt, hematoentsefaalbarjäär (BBB) ​​takistab kolesterooli omastamist, mis tuleneb süsteemse vereringe kaudu transporditavatest lipoproteiinidest [8]. Sel põhjusel arendavad närvirakud välja eeskujuliku reguleeriva võrgustiku, et iseseisvalt hallata oma nõudlust selle lipiidi järele. Hästi aktsepteeritud mudel näitab, et pärast embrüogeneesi, postnataalse perioodi jooksul, langeb kolesterooli biosüntees neuronites dramaatiliselt, püüdes säästa aktsioonipotentsiaalide genereerimiseks kasutatud energiat.

Sellest tulenevalt täitsid astrotsüüdid kolesterooli neuronaalseid vajadusi, mille süntees muutub eriti tugevaks [1, 9, 10]. Astrotsüütide poolt toodetud kolesterooli kohaletoimetamine neuronitesse eeldab elegantset horisontaalse transpordi mehhanismi, mis hõlmab kriitilisi valke ja osakesi. Täpsemalt, kolesterooli eksport algab astrotsüütidest, kus uussünteesitud kolesterool laaditakse tekkivatesse lipoproteiini osakestesse, mis sisaldavad apolipoproteiin E (ApoE). Kogunev tõendusmaterjal näitab, et ApoE-rikaste osakeste lipidatsiooni vahendab transporteri ATP-siduv kassett A1 (ABCA1) [11]. Pärast ekstratsellulaarsesse ruumi vabanemist on ApoE-d sisaldav lipoproteiinide omastamine neuronite poolt retseptori vahendatud endotsütoosi madala tihedusega lipoproteiini retseptori (LDLr) ja LDLr-ga seotud valgu 1 (LRP1) kaudu [12].

Vastavalt astrotsüütidest pärineva kolesterooli pöördelisele rollile neuronaalses homöostaasis näitasid eksperimentaalsed leiud, et ApoE-rikastes lipoproteiinides sisalduv kolesterool suurendab oluliselt dendriidi diferentseerumist ja sünaptilist funktsiooni [13, 14]. Accordinastrocyte konditsioneeritud sööde Huntingtoni tõve (HD) astrotsüütidest, mis eritavad vaid mõõdukas koguses ApoE-lipoproteiiniga seotud kolesterooli, mõjutab tõsiselt neuriitide väljakasvu ja sünaptilist aktiivsust HD neuronites [15].

Astrotsüütidest pärinevate ApoE-d sisaldavate osakeste neurotroofset toimet toetab veelgi ApoE puudulikkus, mis pärsib märkimisväärselt täiskasvanute neurogeneesi hipokampuses [16]. Astrotsüütide ja neuronite kolesterooli läbirääkimine on samuti kriitiline oksüdatiivse stressi vastase neurokaitse jaoks. Näiteks näitavad mõned aruanded, et ApoE takistab vesinikperoksiidiga kokkupuutest põhjustatud oksüdatiivseid kahjustusi ja apoptoosi [17, 18].

Nende tähelepanekute põhjal on kolesterooli homöostaasi säilitamine ajus vajalik, et tagada närvirakkude toimimine, ja selle lipiidi reguleerimise aluseks olevaid metaboolseid teid tuleks täpselt kontrollida, et säilitada mitmete neurofüsioloogiliste protsesside esinemine.

Viimastel aastatel on neurotrofiinid kujunenud olulisteks rakkude metabolismi osalisteks [2, 19–22]. Neurotrofiinid kuuluvad väikesesse kasvufaktorite perekonda, millel on neuronite arengus, ellujäämises ja plastilisuses vaieldamatu roll [23]. Viimasel ajal on neid signaalmolekule tunnistatud ka rakkude metabolismi, sealhulgas kolesterooli metabolismi, olulisteks modulaatoriteks [2, 22].

Eksperimentaalsed tõendid näitavad, et närvikasvufaktor (NGF), neurotrofiinide perekonna prototüüp, stimuleerib kolesterooli biosünteesi neuronaalsetes rakkudes ja hepatotsüütides [24, 25]. Huvitaval kombel hõlmavad need sündmused vähemalt osaliselt madala afiinsusega neurotrofiini retseptorit p75NTR, mis kutsub esile sterooli regulatoorset elementi siduva valgu 2 (SREBP-2) aktiveerimise ja omakorda indutseerib kolesterooliga seotud transkriptsiooni. geenid [25]. NGF-i aktiivsus kolesterooli metabolismile ei piirdu biosünteesiga, kuna see soodustab ka kolesterooli omastamist, suurendades LDLr ekspressiooni neuronites [26].

Vaatamata sellele teabele näivad teadmised NGF-i võimaliku panuse kohta kolesterooli homöostaasi reguleerimisse endiselt eriti piiratud. Eelkõige puuduvad süstemaatilised uuringud, mis hindaksid NGF-i rolli kolesterooli metabolismi reguleerimisel astrotsüütide rakkudes. Arvestades, et astrotsüütide poolt toodetud kolesterool on neuronaalse füsioloogia tagamiseks hädavajalik, on oluline mõista, kas see võib mõjutada kolesterooli metabolismi gliiarakkudes ja rakkudevahelist kolesterooli transporti, mille omapärane regulatsioon on aju tervise tagamiseks hädavajalik.

Selle põhjal tehtud töö eesmärk on uurida NGF-i tulevast osalust kolesterooli metabolismi moduleerimisel gliiarakkudes, samuti selle mõju neuronite diferentseerumisele ja neuronite ellujäämisele oksüdatiivse stressi tingimustes.

2. Tulemused

2.1. U373 ekspresseerib nii NGF retseptoreid TrkA kui ka p75NTR

Algselt tuvastati NGF kui neuronaalsete rakkude spetsiifilise tropismiga kasvufaktor. Kuid koguvad tõendid näitavad, et see neurotrofiin kutsub esile bioloogilisi toimeid ka mitmetes mitteneuronaalsetes rakkudes ja kudedes [22]. NGF aktiivsuse tagab selle seondumine kõrge afiinsusega retseptoriga TrkAd madala afiinsusega retseptoriga p75NTR [2].

Seega tegime algselt kindlaks, kas U373 rakud ekspresseerivad NGF retseptoreid. Eelkõige on U373 astrotsütoomi rakuliin, mida kasutatakse laialdaselt astrotsüütide rakukultuuri mudelina, kuna mitmed aruanded näitasid, et need taastavad astrotsüütide morfoloogilisi, metaboolseid ja funktsionaalseid omadusi [27–29]. Vastavalt avaldatud andmetele [30] näitas immunofluorestsentsanalüüs, et U373 rakud ekspresseerivad nii TrkA kui ka p75NTR märgataval tasemel (joonis S1A). Neid tulemusi kinnitas ka Western blot analüüs, mis viitab sellele, et U373 rakud võivad NGF-ile täielikult reageerida.

Kuna NGF-i manustamine võib mõjutada selle retseptorite ekspressioonitasemeid, muutes potentsiaalselt tasakaalu TrkA ja/või p75NTR poolt esile kutsutud signaaliradade vahel [31–33], kontrolliti mõlema retseptori ekspressiooni ka 48-tunnise NGF-ravi järel. Siiski ei täheldatud pärast neurotrofiiniga stimuleerimist nii TrkA kui ka p75NTR valgu koguses muutusi (joonis S1B).

2.3. NGF suurendab kolesterooli sekretsiooni U373 poolt söötmesse

Saadud tulemused ajendasid meid uurima, kas NGF-i vahendatud mõjud võivad kajastada kolesteroolisisalduse modulatsiooni. Neutraalsete lipiidide, sealhulgas kolesterüülestrite visualiseerimiseks viidi läbi Oil Red O värvimine. U373 rakkudes leitud lipiiditilkade suurus ja arv olid sarnased primaarsete astrotsüütide puhul kirjeldatuga [34, 35].

Kuid NGF-i töötlemisel muutusi ei täheldatud (joonised 2A ja S2A, B). Samamoodi ei tuvastatud muutusi vaba kolesterooli koguses, hinnati filipiiniga värvimisega (joonised 2B ja S2C). Olulise mõju puudumist rakusisese kolesterooli tasemel kinnitas veelgi kolesterooli ensümaatiline test, mis tõi esile, et NGF ei muutnud üldkolesterooli, vaba kolesterooli ja kolesterüülestrite sisaldust (joonis 2C).

Vastupidi, kolesterooli (vaba, estrite ja üldkolesterooli) kogus suurenes U373--ga töödeldud NGF-i söötmes märkimisväärselt (joonis 2D). Tervikuna hinnates näitavad need andmed, et NGF soodustab kolesterooli ekstrusiooni, suurendades ApoE-d sisaldavate osakeste ABCA{2}}vahendatud väljavoolu.

Joonis 1. NGF moduleerib peamiste kolesterooli homöostaasiga seotud valkude ekspressiooni U373 rakkudes ja suurendab ApoE sekretsiooni n U373 söötmes. (A–G) SREBP-1, SREBP-2, HMGCR, LDLr, NPC1, ABCA1 ja ApoE tüüpiline Western blot ja densitomeetriline analüüs vehiikuliga (Ctrl) ja NGF-iga (100 ng) töödeldud U373 rakkudes /mL) 48 tundi. n=6 erinevat katset.

Laadimiskontrollina kasutati aktiini ja vinkuliini. (H) ApoE tasemete kvantifitseerimine (µg/mL) ELISA testiga vehiikuliga ja NGF-ga töödeldud U373 söötmes. n=3 erinevat katset. Andmed tähistavad keskmisi ± SD. Statistilist analüüsi hinnati ühe paaritu Studeti testi testiga. * p < 0.05, ** p < 0,01, *** p < 0,001.

2.4. p75NTR on osaliselt seotud NGF-i vahendatud mõjudega kolesteroolivalgu võrgustikule

Eksperimentaalsed leiud näitavad, et NGF mõjutab kolesterooli metabolismi maksarakkudes selle madala afiinsusega retseptori p75NTR aktiveerimise kaudu [25]. Et testida, kas see signaalirada võib ka astrotsüütides rakkudes säilida, töödeldi U373 LM11A-31-ga, väikese ligandiga, mis toimib spetsiifilise p75NTR modulaatorina. See ühend ei aktiveeri TrkA-d, kuid sarnaselt NGF-iga kutsub esile p75NTR allavoolu signaaliradade indutseerimise [36]. LM11A-31 jäljendas NGF-vahendatud HMGCR suurenemist (joonis 3A).

Siiski ei täheldatud muutusi teistes kolesterooli metabolismis osalevates valkudes (joonis 3B–D), samuti rakuvälise ApoE (joonis 3E) ja kolesterooli (kokku, vaba ja estrid) koguses, mis kultiveerimiskeskkonda vabanes (joonis 3F). ). Need tulemused näitavad ühiselt, et HMGCR-i NGF-indutseeritud ekspressiooni vahendab p75NTR aktiivsus, samas kui mõju NPC1, ABCA1, ApoE sekretsioonile ja kolesterooli ekstrusioonile sõltuvad tõenäoliselt teistest transduktsiooni radadest, mis võivad hõlmata ka TrkA-d.

Joonis 2. NGF mõju neutraalsete lipiidide ja kolesterooli sisaldusele. (A) U373 rakke töödeldi vehiikuliga (Ctrl) või NGF-iga (100 ng / ml) 48 tundi ja seejärel värviti Oil Red O-ga, et visualiseerida neutraalsete lipiidide rakusisest sisu. n=3 erinevat katset. (B) Tüüpiline pilt filipiiniga värvimisest, mis viidi läbi U373 rakkudel, mida töödeldi vehiikuliga (Ctrl) ja NGF-iga (100 ng / ml) 48 tundi. n=3 erinevat katset. (C) Intratsellulaarse kolesterooli taseme (üldkolesterool, vaba kolesterool ja kolesterüülestrid) kvantifitseerimine kandja- ja NGF-ga töödeldud U373 rakkudes. n=3 erinevat katset. (D) Kolesterooli kvantifitseerimine (üldkolesterool, vaba kolesterool ja kolesterüülestrid) U373 rakkude söötmes, mida on töödeldud vehiikuliga (Ctrl) ja NGF-iga (100 ng/ml) 48 tundi. n=3 erinevat katset. Andmed tähistavad keskmisi ± SD. Statistiline analüüs viidi läbi paaritu Studenti t-testi laulmise teel. ** lk<0.01.

Joonis 3. LM11A-31 poolt p75NTR modulatsiooni mõju kolesterooli metabolismile ja sekretsioonile. (A–D) HMGCR, ABCA1, NPC1 ja ApoE tüüpiline Western blot ja densitomeetriline analüüs U373 rakkudes, mida töödeldi vehiikuliga (Ctrl) ja LM11A-31 (0,1 µM) 48 tundi. n=4 erinevat katset.

Vinculiin toimis majapidamisvalguna valgu laadimise normaliseerimiseks. (E) ApoE koguse (µg/mL) kvantifitseerimine ELISA testiga kandja- ja LM11A-31--ga töödeldud U373 rakkude söötmes. n=3 erinevat katset. (F) Kolesterooli (üldkolesterooli, vaba kolesterooli ja kolesterüülestrite) kvantifitseerimine U373 rakkude söötmes, mida on töödeldud vehiikuliga (Ctrl) ja LM11A-31 (0,1 µM) 48 tundi. n=3 erinevat katset. Andmed tähistavad keskmisi ± SD. Statistiline analüüs viidi läbi ühe paarita Studet-testi abil. *** p < 0.001.

For more information:1950477648nn@gmail.com