Looduslik parvoviiruse infektsioon looduslikel kalapüügikassidel (Prionailurus Viverrinus) paljastab viiruse säilinud lokaliseerimise neerudes
Feb 25, 2022
Abstraktne
Lihasööja protoparvoviirus-1 (CPPV-1), viirusliik, mis sisaldab kasside panleukopeenia viiruse (FPV) ja koerte parvoviiruse (CPV) variante, on kodu- ja metsikute lihasööjate seas laialt levinud, põhjustades süsteemseid surmaga lõppevaid haigusi. Metsikud kalapüügikassid (Prionailurus viverrinus), ülemaailmselt haavatav liik, on leitud surnuna. Korjuste surmajärgsel uurimisel leiti kahjustusi soolestikus, põrnas jaNeerud. CPPV-1 antigeeni tuvastamine nendes kudedes, kasutades polümeraasi ahelreaktsiooni (PCR) ja immunohistokeemiat (IHC), toetas viirusega nakatumist. PCR- ja IHC-positiivsus sisse neerukudedpaljastas viiruse ebatüüpilise lokaliseerimise, samas kui in situ hübridisatsioon (ISH) ja transmissioonelektronmikroskoopia (TEM) pop-off tehnikaga kinnitasid viiruse lokaliseerimise esimest kirjeldustneerud. Täielik genoomi iseloomustus ja saadud CPPV-1 aminohapete analüüs näitas, et FPV on põhjustaja. Tuvastatud FPV järjestused näitasid kapsiidivalgus I566M ja M569R aminohappemutatsioone. Täielike kodeerivate genoomijärjestuste fülogeneetilised ja evolutsioonilised analüüsid näitasid, et kalakassi CPPV-1 genoomid on geneetiliselt rühmitatud Tai kodukassidelt eraldatud FPV genoomidega. Alates 1970. aastatest on näidatud, et need genoomid jagavad geneetilist arengut Hiina FPV tüvedega. See uuring on esimene tõend kalapüügikasside CPPV{5}} nakkuse kohta ja see on esimene, mis näitab selle lokaliseerumistneerud. Need leiud toetavad selle parvoviiruse mitme peremehe levikut ja viitavad sellele, et surmaga lõppevad CPPV{1}}-nakkused võivad põhjustada teisi haavatavaid metsikkiskjaid.
Märksõnad: neerukude; neeruhaigused, neeru-, neeru-, neerutorukujulised
Sissejuhatus
Perekonda Prionailurus, perekond Felidae, liigitatakse Aasiast pärit täpiliste, väikesekasvuliste metsikute kasside rühma [1]. Perekonda Prionailurus kuulub neli ametlikult tunnustatud metskassiliiki, sealhulgas leopardkass (P. bengalensis), lamepeakass (P. planiceps), roostetäpiline kass (P. rubiginosus) ja kalakass (P. viverrinus). [2]. Kalapüügikass elab peamiselt soode ja mangroovide läheduses. Ta elab eranditult Lõuna- ja Kagu-Aasias ning on levinum Tais [3, 4]. Praegu on kalapüügikasside populatsioonid ohus, kuna märgalad, kus nad elavad, on viimase kümnendi jooksul hävinud. Seetõttu peetakse seda liiki praegu haavatavaks ja see on Rahvusvahelise Looduskaitseliidu (IUNC) punases nimekirjas [3]. Elupaiga kadumise tõttu on kalakasside kolooniad rännanud ja elanud aeg-ajalt piirkondades, kus elavad kodustatud loomad ja inimesed [5]. See jagatud keskkonna nähtus võib põhjustada patogeenide suurenenud levikut vastuvõtlike metsloomade ja koduloomade vahel ning vastupidi. Viimastel aastakümnetel on dokumenteeritud teateid surmaga lõppenud haiguspuhangute kohta metsloomadel või koduloomadel, mis võisid tuleneda patogeeni levikust [6–9]. Seega tuleks uurida nendelt loomadelt pärinevate patogeenide edasikandumise dünaamikat ja see vajab täiendavat uurimist.
CISTANCHE PARANDAB NEERU/NEERU FUNKTSIOONI
Lihasööja protoparvoviirus-1 (CPPV-1), viirusliik, sealhulgas naaritsa enteriidiviirus (MEV), pesukaru parvoviirus (RPV), kasside panleukopeeniaviirus (FPV) ja koerte parvoviiruse (CPV) variandid. tunnistatud oluliseks patogeeniks, mis on seotud surmaga lõppevate haigustega nii metsikutes kui ka kodustes Canidae ja Felidae perekondades [10, 11]. FPV, mis on Felidae liikide tavaline patogeen, on oletatud CPV ühiseks esivanemaks [12–14]. CPV nakatab sageli Canidae perekonda kuuluvaid loomi ja üha enam on tõendeid nakatumise kohta ka perekonda Felidae [9, 15, 16]. Varem on oletatud, et FPV ja CPV on peremeesrestriktsiooniga viirus. Kuid mitmed leiud näitasid hiljem, et mõned Canidae perekonna loomad võivad mängida rolli FPV reservuaarina või vastupidi [11, 17, 18]. Lisaks on mitmed aruanded näidanud, et FPV ja CPV variandid (CPV-2a, -2b ja -2c) jagavad vastuvõtlikke hoste. Need peremehed ei ole mitte ainult koduloomad, vaid ka mitmesugused lihasööjaliigid [15, 19, 20], mis viitab mitmest peremeesorganismist koosnevale CPPV-1 [11] vahemikule.
Aastatel 1996–1997 tuvastati CPV variandid esmakordselt leopardikassidel ja algselt nimetati neid leopardikasside parvoviiruseks (LCPV), mis viitab CPPV -1 esimesele kirjeldusele perekonnas Prionailurus [21, 22]. Mõned neist LCPV tüvedest lahknesid geneetiliselt varem kirjeldatud CPV-2a ja -2b-st, kuna kapsiidi (VP) valgu G300A aminohappe mutatsioon on tingitud. Selle tulemusena muutusid selle antigeensed omadused, mida kasutatakse nüüd ainulaadse mutatsioonipunktina CPV{8}}c eristamiseks teistest CPV variantidest [22]. Uue CPV variandi (praegu tuntud kui CPV-2c) avastamine leopardkassidel toetas ideed CPPV-1 koosevolutsioonist loomaliikide seas. Hiljem teatati FPV ja CPV variantide nakatumisest leopardkassidel [9]. See viitas sellele, et teised leopardkassiga samasse perekonda kuuluvad liigid (perekond Prionailurus) võivad olla vastuvõtlikud CPPV{14}} nakkusele. Siiani on teiste perekonna Prionailurus liikide vastuvõtlikkus CPPV{15}}-nakkuse suhtes endiselt suures osas teadmata. CPPV{16}} variantide arenemise ja uute variantide käitumise dešifreerimine võib aidata selgitada, kuidas vältida uue variandi võimalikku puhangut. Isegi kui uus viirus levib laiemalt, võib uues vastuvõtlikus peremeesorganismis täheldada surmaga lõppevaid puhanguid või infektsiooniga seotud ebatüüpilisi kahjustusi. Selles uuringus kirjeldatakse metsikute kalapüügikasside (Prionailurus viverrinus) surmaga lõppenud CPPV{17}}-nakkust. Saadud CPPV-1 geneetiline iseloomustus näitab, et FPV on põhjustaja. See leid annab esimesed tõendid selle liigi FPV-nakkuse kohta ja paljastab selle viiruse ainulaadse rakulise tropismi. FPV nakkuse ja selle variantide edasine selgitamine selles liigis on vajalik paljude haavatavate liikide globaalse nakkuse arvestamiseks.
materjalid ja meetodid
Loomad ja rutiinne surmajärgne läbivaatus2019. aasta juunis registreerisid kaks metsikut kalakassi (P. viverrinus), määratud juhtumi nr. 1 ja 2 leiti Taist Nakhon Ratchasima provintsi äärelinnast surnuna. Hiljem 2019. aasta augustis ilmus veel üks kalapüügikass, mille nimi oli juhtum nr. 3, päästeti piirkonnast, kust leiti kaks esimest kalakassi. Dehüdratsiooni tõsiduse tõttu on juhtum nr. 3 surid loomahaiglasse suunamise ajal. Need kolm kalapüügikassi esitati rutiinse protsessina tapajärgsele uurimisele. Kahjuks ei olnud samas piirkonnas vabalt rändlevate kodustatud loomade või looduslike liikide näidised saadaval; seega neid sellesse uuringusse ei kaasatud. Kõigile kalapüügikassidele viidi läbi rutiinne surmajärgne uuring. Selektiivsed elutähtsad elundid, sealhulgas kopsud, maks, süda, põrn janeerudproovid võeti kõigilt püügikassidelt, samas kui soolestik ja soolestiku lümfisõlm koguti täiendavalt kalapüügikassilt nr.3. Kõik valitud kuded esitati histoloogiliseks uuringuks ja neist võeti individuaalselt proovid edasiste molekulaarsete analüüside jaoks. Histoloogia jaoks sukeldati kuded 10% (maht/maht) neutraalsesse puhverdatud formaliini vähemalt 24 tunniks ja töödeldi rutiinselt. Seejärel värviti need hematoksüliini ja eosiiniga
(H&E), kasutades standardprotseduure enne ACVP juhatuse sertifitseeritud veterinaarpatoloogi (TK) läbiviimist. Kolmelt kalapüügikassilt saadud värskeid koeproove säilitati molekulaaruuringute jaoks temperatuuril –80 ˚C. Kõik protseduurid viidi läbi vastavalt juhistele ja eeskirjadele pärast Chulalongkorni ülikooli loomade hooldamise ja kasutamise komitee (nr 1931036) heakskiitu.
Üldised viroloogilised molekulaaranalüüsidVärsked koeproovid, sealhulgas süda, kopsud, maks, põrn janeerudkõikidest püügikassidest pluss täiendavad kalakassi nr. 3, ekstraheeriti viiruse nukleiinhappega, homogeniseerides need individuaalselt 1% (maht/maht) fosfaatpuhverdatud soolalahusega (PBS). Seejärel ekstraheeriti kogu viiruse nukleiinhape, kasutades kaubanduslikku viiruse nukleiinhappe ekstraheerimise II komplekti (Geneaid, Taipei, Taiwan), järgides tootja soovitust. Seejärel ekstraheeritud nukleiinhapped kvalifitseeriti ja kvantifitseeriti nende A260/A280 neeldumissuhte järgi, kasutades spektrofotomeetrilist meetodit (NanoDrop, Thermo Scientific™, Waltham, MA, USA). Kõik ekstraheeritud nukleiinhapped allutati täiendavalt viiruse molekulaarsele uurimisele, kasutades polümeraasi ahelreaktsiooni (PCR) analüüsi koos mitme pan-viroloogilise perekonna PCR testimise paneeliga, sealhulgas herpesviiruse [23], paramüksoviiruse [24], pneumoviiruse [25] ja kalitsiviiruse tuvastamisega. [26], gripiviirus [27], bocaviirus [26, 28], parvoviirus [29] ja koroonaviirus [30, 31]. Reaktsioonides kasutatud PCR-protokolle, reaktiive, tsüklitingimusi ja positiivseid/negatiivseid kontrolle on kirjeldatud failis S1. Kasside glütseraldehüüd- 3-fosfaatdehüdrogenaasi (GAPDH) geeni spetsiifilist PCR-i tuvastamist kasutati sisekontrollina, nagu eelnevalt kirjeldatud [32]. Seejärel visualiseeriti positiivsed PCR amplikonid QIAxceli kapillaarelektroforeesi platvormi (Qiagen, Hilden, Saksamaa) abil, nagu eelnevalt kirjeldatud [33]. Iga PCR testi positiivsed amplikonid puhastati ja allutati kahesuunalisele Sangeri sekveneerimisele (Macrogen Inc, Seoul, Lõuna-Korea). Kudede mõõduka autolüüsi tõttu ei olnud nende kalapüügi kasside bakterioloogilist uurimist võimalik teha.
In situ CPPV{0}} tuvastamine immunohistokeemia (IHC), in situ hübridisatsiooni (ISH) ja transmissioonielektronmikroskoopia (TEM) abil
Esialgne viroloogiline molekulaarne sõeluuring näitas pan-parvoviiruse PCR positiivseid amplikone ja sekveneerimise tulemused näitasid ka CPPV -1 potentsiaalseid DNA järjestusi. Need leiud ajendasid meid täiendavalt kinnitama CPPV-1 olemasolu ja lokaliseerima CPPV-1 jaotumist kalapüügikasside kudedes. Formaliiniga fikseeritud parafiiniga manustatud (FFPE) koed, sealhulgas kops, maks, süda, põrn,neerudja soolestikku tehti CPPV-1 IHC tuvastamine, kasutades hiire monoklonaalset koerte parvoviiruse vastast antikeha (ab59832, Abcam, Cambridge, UK) mädarõika peroksidaasi (HRP) tuvastamissüsteemiga (EnVision polümeer, Dako, Glostrup, Taani) . Lühidalt, FFPE lõigud lõigati 4- μm paksuseks ning seejärel deparafineeriti ja rehüdreeriti. Seejärel töödeldi slaide, endogeenne peroksidaas blokeeriti ja töödeldi, nagu eelnevalt kirjeldatud [11]. Positiivse kontrollina kasutati FPV-ga nakatunud kassi ja CPV-ga nakatunud koera soolestiku sektsioone, samas kui identseid lõike inkubeeriti puhastatud kitse-hiire ja küüliku IgG-dega (IHC universaalne negatiivne kontrollreagent, kood ADI{7}}, Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY, USA), kasutati negatiivsete kontrollidena. Seosesneeru-tubulaarnekroos, mis esineb piirkondades, kus täheldati CPPV-1 IHC positiivseid signaale,neerudosad kõikidest kalapüügikassidest värviti perioodilise AcidSchiff (PAS) abil spetsiaalselt, et demonstreerida raku struktuuri.neerudkoed.
CISTANCHE PARANDAB NEERU-/NEERUHAIGUST
Lisaks FFPEneerudlõigud kalapüügi kass nr. 1 ja 3 allutati ISH- ja TEM-analüüsile, et toetada positiivse CPPV-1 IHC värvimise tulemust ja näidata ultrastruktuuriliselt viirusosakesineerukuded, vastavalt. ISH jaoks konstrueeriti CPPV-1 DNA sond, mis kattis CPPV-1 kapsiidigeeni 393 aluspaari [34], kasutades PCR DIG Probe sünteesikomplekti (Roche Diagnostics, Basel, Šveits). tootja soovitused. Termilise tsükli reaktsioon ja seisund viidi läbi nagu eelnevalt kirjeldatud [34], välja arvatud digoksigeniiniga (DIG) märgistatud oligonukleotiide. Konstrueeritud hübridisatsioonisond visualiseeriti ja kinnitati suuruse eraldusvõimega 1,5% (mass/maht) agaroosgeelelektroforeesil. Kromogeense DNA-ga ISH viidi läbi nagu eelnevalt kirjeldatud [26], väikeste muudatustega. Lühidalt, pärast deparafiini eemaldamist, rehüdreerimist ja sellele järgnevat loputamist PBS-is allutati 4- μm paksustele FFPE slaididele proteolüütiline seedimine, järelfikseerimine ja eelhübridiseerimine. Seejärel hübridiseeriti slaidid 25 ng/μL ISH-sondiga temperatuuril 42 ˚C üleöö. Hübridisatsioonisignaalid visualiseeriti, ühendades 100 µl anti-DIG-AP Fab fragmente (Roche, Basel, Šveits) (1:200 1X blokeerimislahuses) kombinatsioonis vedela püsiva punasega (LPR) (Dako, Glostrup, Taani) . Seejärel värviti slaidid hematoksüliiniga. Arvatakse, et punased sademed raku morfoloogia korrelatsioonis on ISH suhtes positiivsed. Negatiivsete kontrollide jaoks kasutati CPPV-1 sondi asemel tilapia järveviiruse (TiLV) sonde [35]. TEM-proovid valmistati vastavalt modifikatsioonidega pop-off tehnikatele [36–38] ja värviti raskmetallidega, nagu eelnevalt kirjeldatud [39, 40]. Ultrastruktuuri uuriti TEM-iga (HT7800; Hitachi, Tokyo, Jaapan), mis töötas 80 kV juures.
Püügikassi CPPV täispikk geneetiline iseloomustus-1Kuna viroloogilise PCR ja IHC sõeluuringu tulemused ühtisid ning pan-parvoviiruse PCR-ga saadud osaliste VP-2 genoomi järjestuste tulemused viitasid juhtumite nr vahelisele geneetilisele sarnasusele. 1 ja 2, kuid mitte juhtumi nr 3 puhul, iseloomustasime täiendavalt nende kalapüügi kasside täispikka CPPV-1 järjestust (juhtumid nr 1 ja 3) ning klassifitseerisime CPPV-1 päritolu, kasutades FPV ja CPV spetsiifiliste degenereerunud praimeripaaride komplekt, mis on hankitud eelmisest publikatsioonist [26]. Lühidalt põrnast saadud ekstraheeritud nukleiinhapped janeerudkahest kalakassist pluss püügikassi nr. 3, amplifitseeriti individuaalselt, kasutades GoTaq1 Hot Start Green Master Mix (Promega, Madison, WI, USA) ja spetsiifilisi praimereid (S1 File). PCR tingimusi on eelnevalt kirjeldatud [26]. Sihtamplikonid visualiseeriti 2% (mass/maht) agaroosgeelelektroforeesiga ja puhastati enne kaubanduslikku Sangeri sekveneerimist Monarch DNA Gel ekstraheerimiskomplektiga (New England Biolab, Frankfurt, Saksamaa). Kahelt kalapüügikassilt saadud CPPV-1 isolaatide täielikud genoomijärjestused deponeeriti GenBanki (juurdepääsunumbrid MW145540-MW145541).
Kalapüügikassi CPPV-1 fülogeneetilised, rekombinatsiooni- ja evolutsioonilised analüüsid Kalakassi CPPV-1 tüvede täispikad genoomijärjestused joondati erinevatelt peremeesliikidelt saadud avaldatud täielike CPPV-1 järjestustega. , mis on saadaval GenBankis, kasutades MAFFT V. 7 (http://mafft.cbrc.jp/alignment/server/) ja MEGA7 tarkvara (http://www.megasoftware.net). Seejärel viidi järjestuste joondustele fülogeneetiline puu. Fülogeneetiline puu loodi maksimaalse tõenäosuse (ML) meetodil Hasegawa-Kishino-Yano gamma jaotusega (HKY pluss G) mudeliga, mis valiti MEGA7-s vastavalt Bayesi teabekriteeriumile parima sobivuse mudeli algoritmi abil. . Puu käivitati 1,{10}} kordusega. CPPV-1 genoomide järjestuste paaridevaheline sarnasus arvutati maksimaalse liittõenäosuse mudeli abil ja nende evolutsioonilist kaugust analüüsiti MEGA7-s. Väljundi paaripõhised nukleotiidide identiteedid genereeriti ja visualiseeriti Microsoft Exceli vormingus (S2 fail). Seejärel kasutati CPPV-1 väljundi joondusjärjestust kahe statistiliselt sõltumatu tarkvarapaketi abil geneetilise rekombinatsiooni analüüsi mallina. Lühidalt, joondamine tuvastas potentsiaalsed rekombinatsioonitüved, kasutades integreeritud rekombinatsioonituvastusprogrammi 4 (RDP4) paketti V. Beta 4.94 tarkvara ja seda kontrolliti SimPloti tarkvarapaketi vanuses V sarnasusgraafiku ja algskannimise analüüsiga. 3.5.1. Programmide seadistus ja tulemuste tõlgendamine viidi läbi nagu eelnevalt kirjeldatud [26, 41].
FKalakassi CPPV{{0}} evolutsiooniliseks analüüsiks saadi 224 täielikust genoomijärjestusest koosnev andmekogum, mis sisaldas 26 FPV-, 6 MEV- ja 192 CPV järjestust, mis kõik pärinevad 18 riigist aastatel 1979–2019. GenBanki andmebaasist. Evolutsiooniline analüüs viidi läbi kahe potentsiaalse CPPV-1 järjestusega, mis saadi kalapüükidelt kassidelt, kasutades Bayesi Markovi ahela Monte Carlo (BMCMC) mudelit, mida rakendati BEAST V-s. 2.4.8 [42]. JModelTest [43] viidi läbi selleks, et tuvastada kõige paremini sobiv nukleotiidide asendusmudel mitme joondusjärjestuse jaoks. Kõige paremini sobivad asendusmudelid lognormaalsete lõdvestunud ja rangete kellamudelite korral konstantse populatsiooni suuruse juures nagu varem, et võtta arvesse põlvkondade vahelisi erinevaid evolutsioonikiirusi. Koalestseeruv Bayesi siluetipuu eelnevad ja empiirilised baassagedused saadi kõige sobivama kellamudeli alusel ja seda kasutati 100 miljoni ahela jaoks, mis võeti iga 10. 000 põlvkonna järel, kusjuures esimesed 10 protsenti jäeti sissepõlemise tõttu kõrvale. Parameetrite konvergentsi kinnitati efektiivse valimi suuruse arvutamisega TRACER programmi V. 1.7.0 [44] abil. Klade maksimaalse usaldusväärsuse puud märgiti TreeAnnotator V. 1.8.3 abil [42]. Hinnangulise lahknevuse, muutuva ajajoone, tagumise tõenäosuse ja 95-protsendilise kõrgeima tagumise tihedusega (HPD) fülogeneetiline puu loodi ja kuvati FigTree V abil. 1.4.3 [45].
CPPV{0}} antigeeni retrospektiivne uuring metsloomade lihasööjatelSelleks et uurida CPPV{0}} rolli, mis on seotud metsikute kiskjaliste haigestumuse ja suremusega teadmata põhjustega kauges ja lähiminevikus, lisati 305 värsket selektiivset proovi CPPV genoomseks ekstraheerimiseks ja identifitseerimiseks{{2} } kapsiidi geen, nagu eespool kirjeldatud. Need proovid on saadud alates 2013. aastast kas väljaheite tampooni või soolesisuna. Need saadi 136 loomaaia loomalt 27 erinevast lihasööjaliigist (S1 tabel). Tulemused Kalapüügi kassi surmajärgsed leiud ja kudede lokaliseerimine CPPV-1 Kõik lahangud kalapüügikassid olid mõõdukalt kõhnad ja erineva dehüdratsiooniastmega, samas kui kahel kolmest kalapüügikassist (juhtumid nr 1 ja 2) ilmnes mõõdukas autolüüs. Silmapaistvalt on põrn janeerudolid ülekoormatud kõigis kalapüügikassides. Kalastuskassil nr 3 esinesid katarraalse enteriidi makroskoopilised kahjustused, mis sisaldasid vesist pruunikaskollakat sisu nende luumenis ja mesenteriaalse lümfisõlme ülekoormust. Histoloogiliselt on püügikassi nr. 3 näitas tõsist ülekoormust koos mononukleaarsete rakkude infiltratsiooniga alveoolides. Maksas ilmnes kerge periportaalne hepatiit, mida iseloomustas mononukleaarsete rakkude infiltratsioon maksaportaali triaadides. Kõigil kalapüügikassidel täheldati sarnaseid põrna ummikuid koos vähese põrna lümfoidsete folliikulite arvuga. Lümfoidsed folliikulid olid ammendunud ja ülejäänud lümfoidsed folliikulid põrna kokkuvarisemise taustal koos silmatorkavate põrnatrabekulide arvu suurenemisega (joonis 1A). Seal oli hajutatud karüorrektilisi lümfotsüütide jääke
Joonis 1. CPPV-1 infektsioon kalastavatel kassidel. Demonstratiivsed H&E (A, C) ja CPPV-1 IHC (B, D) pildid kalastavatelt kassidelt. (A) Kalastuskass nr. 1. Hajus ülekoormatud põrn hõreda arvu lümfoidsete folliikulitega. Ühe ülejäänud lümfoidsete folliikulite keskel oli eosinofiilne fibrillaarne materjal (fibriin), mis oli segatud lümfotsüütide hajutatud karüorrektiliste jääkidega (lümfotsütolüüs) (sisend). Vähesed arvud neid lümfotsüüte sisaldasid 5–7 μm basofiilseid intranukleaarseid inklusioonkehi, mis piirasid tuumakromatiini (nool). (B) Kalastuskass nr. 3. Villi lühenemine aeg-ajalt laienenud krüptidega, mis sisaldasid eosinofiilseid valgulisi aineid ja mida ääristasid märgatavalt nõrgestatud või nekrootilised krüpteepiteelirakud (inset). Paljud krüpti epiteelirakud olid püknootilised ja karüorreetilised ning haruldased rakud sisaldasid sarnaseid basofiilseid tuumasiseseid inklusioonkehi (nooled). (C) Kalastuskass nr. 1. CPPV-1 immunoreaktiivsust täheldati sageli mononukleaarsete rakkude tsütoplasmas põrna lümfoidse folliikuli piirkonnas. (D) Kalastuskass nr. 3. CPPV-1 IHC signaalid tuvastati hajusalt ja immunoreaktiivsuse signaalid paiknesid märgatavalt krüpaalsete epiteelirakkude tsütoplasmas (inset). Tulbad näitavad 25 μm (A) ja 120 μm (B–D).
eosinofiilsete fibrillaarsete materjalide kogunemine sellise folliikuli keskele. Vähesed arvud neid lümfotsüüte sisaldavad 5–7 μm basofiilseid intranukleaarseid inklusioonkehi, mis piiravad tuuma kromatiini. Soolevilli lühenemine koos limaskesta arhitektuuri kollapsiga esines kalapüügi kassi nr. 3 (joonis 1B). Mõned krüptid olid laienenud ja need sisaldasid eosinofiilset valgulist materjali ning olid vooderdatud märgatavalt nõrgenenud või nekrootiliste krüpteepiteelirakkudega. Paljud krüptoepiteelirakud olid püknootilised ja karüorrektilised ning haruldased rakud sisaldasid sarnaseid basofiilseid intranukleaarseid inklusioonkehi. CPPV-1 IHC-d kasutati selleks, et demonstreerida viiruse olemasolu kudedes ja kirjeldada CPPV-1 patoloogilist rolli rutiinse surmajärgse uuringu käigus täheldatud kahjustustes. Põrnas paiknevad mononukleaarsed rakud näitasid CPPV-1 positiivset intensiivset immunoreaktiivsust kõigil kalapüügikassidel (joonis 1C). Immunoreaktiivsust täheldati ka enamikus krüptaalepiteelirakkude tsütoplasmas ja see ühildus kalakassi nr. 3 (joonis 1D). Eelkõige erineval määralneerutorukujulinevakuolatsioon ja multifokaalneneeru-hemorraagia ilmnes kõigil kalapüügikassidel (joonis 2A). Mõnedneeru-tubulaarsed epiteelirakud olid tuumapüknoosiga hüpereosinofiilsed, samas kui haruldased vakuoleeritud tubulaarsed epiteelirakud näitasid vesikuleeritud tuumasid koos marginaalse tuumakromatiiniga (joonis 2B). Seosesneerudkahjustuste korral teostasime täiendavalt PAS-värvimist, et demonstreerida rakulist arhitektuurineerukudeja välistada süsteemne hüpoksia selle kahjustuse võimaliku põhjusena. PAS-i värvimine näitasneerutorukujulinebasaalmembraanid olid terved (joonis 2B, sisestus). Piirkonnasneerudlõikudes oli CPPV{0}} immunomärgistamine tugev ja seda nähti sageli tsütoplasmasneerutorukujulineepiteelirakud (joonis 2C) ja uroteelirakudneeruvaagenkõigil juhtudel. Negatiivsetes kontrollides ei täheldatud mingeid tõendeid immunogeense reaktsiooni kohta (joonis S1). Ebatüüpiline CPPV-1 lokaliseerimineneerukudedIHC näitas, et peaksime läbi viima täiendavaid uuringuid, et kinnitada CPPV-1 olemasolu ja lokaliseerimistneerudkasutades ISH ja TEM koos pop-off tehnikaga. CPPV-1 ISH-immunoreaktiivsus oli positiivne kõigil kalapüügil kassidel ja paiknes difuusselt kasside tuumas.neeru-torukujulised epiteelirakud, kus täheldati torukujulisi kahjustusi (joonis 2D). Negatiivsetes kontrollides (joonis S1) reaktsiooni ei täheldatud. Vastavalt ISH positiivsete immunoloogiliste signaalide tulemustele, mis paiknesid ISH tuumas.neeru-Täheldati epiteelirakke, arvukalt väikeseid elektrontihedaid viirusosakesi, mille läbimõõt on hinnanguliselt umbes 19–22 nm. Need olid koondunud nende tuumadesseneerutorukujulineja uroteelirakud (joonis 3).
Püügikasside CPPV{0}} tuvastamine ja genoomianalüüsEkstraheeritud viiruse nukleiinhappeproovidega testiti peamiselt erinevate viiruste, sealhulgas herpesviiruse, paramüksoviirus, pneumoviirus, kalitsiviirus, gripiviirus, bocaviirus, koronaviirus ja parvoviirus, suhtes spetsiifilisi koguperekonna PCR paneele. See näitas positiivseid tulemusi ainult pan-parvoviiruse PCR-ga soolestikus, lümfisõlmedes janeerudkolme kalapüügi kassi näidised. Vastupidi, teised pan-PCR-id teiste viiruste tuvastamiseks olid kõigis testitud koeproovides negatiivsed. Eelnevalt saadud pan-parvoviiruse PCR-positiivsuse tulemuste põhjal kõigil kalapüügikassidel iseloomustasime täiendavalt kahe kalapüügi kassi kodeerivaid genoomi järjestusi, kasutades mitut praimeripaari. soolestikust saadud ekstraheeritud nukleiinhappeproovid (juhtum nr 1) janeerud(juhtum nr 3). Kahe kalakassi CPPV-1 tüve täielikke kodeerivaid genoome 4462 ja 4430 aluspaari avastati ja määrati tüvedeks 19ZP004-TH/2019 (juhtum nr 1, registreerimisnumber MW145540) ja 19ZP{ {12}}TH/2019 (asi nr 3, liitumisnr MW145541) vastavalt. Pärast geneetilist analüüsi näitasid täielikud kodeerivad genoomid kalapüügikassidelt saadud CPPV-1 tüvede puhul geneetiliselt sarnaseid tulemusi, näidates, et need kalakassi CPPV-1 olid FPV. CPPV-1 variantide ja kalastavate kasside FPV tuletatud aminohapete võrdlust on kirjeldatud tabelis 1. Pange tähele, et kalapüügi kassi FPV näitas struktuurses (VP1 ja 2) valgus I566M ja M569R ainulaadseid aminohappemutatsioone. , mida eelmistes CPPV-1 variantides ei tuvastatud.
Joonis 2. CPPV-1 infektsioon kalastavatel kassidel. Demonstratiivsed H&E (A), PAS-värvimise (B), CPPV-1 IHC (C) ja in situ hübridisatsiooni (ISH) (D) mikrofotodneerudkalapüügikassidest. (A, B) Kalastuskass nr.3. (A) Multifokaalneneeru-hemorraagia koosneerutorukujulinevakuolatsioon. Vähesed torukujulised epiteelirakud olid hüpereosinofiilsed ja püknootiliste tuumadega (sisend, nooled). (B)Neeru torukujulineepiteelirakkudel esines tsütoplasmaatiline vakuool ja haruldaste epiteelirakkude tuumad on vesikulaarsed koos marginaalse tuumakromatiiniga. PAS-värvimine tõstis esile terve basaalmembraani (sisend). (C) Kalastuskass nr. 2. CPPV-1 IHC-immunoreaktiivsust (tumepruuni värvi) täheldati hajusaltneerutuubulidja tuvastatakse sageli tsütoplasmasneerutorukujulineepiteel (sisend). (D) Püügikass nr.1. CPPV-1 ISH-immunoreaktiivsust (punakasroosa värvus) täheldati rohkestineerutuubulid(tärnid) ja see lokaliseerub tuumadesneerutorukujulineepiteelid (sisend, nooled). Tulbad näitavad 50 μm (A, C) ja 120 μm (B, D).
Fülogeneetiline ja evolutsiooniline analüüsAvastatud kalakassi CPPV-1 ja teiste varem avaldatud CPPV-1 genoomide geneetilise seose võrdlemiseks viidi läbi täielikul kodeerival genoomijärjestusel põhinev fülogeneetiline analüüs. ML-i fülogeneetiline puu näitas, et enamik FPV-d, MEV-d ja CPV-d moodustasid rühmade vahel väga selgelt eristuva kladi (joonis 4). Uuritud kalakasside kaks CPPV-1 genoomi (tähistatud punaste kolmnurkadega) koondati kokku erinevatelt peremeestelt saadud varem avaldatud FPV järjestuste sama liiniga, mis kinnitas, et saadud
Joonis 3. CPPV-1 viiruseosakesed tuumasneerutorukujulineepiteelirakud. Transmissioonelektronmikroskoopia (TEM), kasutades pop-off tehnikat. Elektrontihedate osakeste (nooled) rühmitamise ultrastruktuurne demonstratsioon. Ikosaeedriliste osakeste suurus oli 19–22 nm läbimõõduga, mis paiknesid tuumasneerutorukujulineepiteelirakud (inset). Skaala ribad nagu näidatud joonisel.
kalapüügi kasside CPPV{0}} oli FPV. Avastatud genoomid koondati kokku ja olid kõige tihedamalt seotud Tai kodukassidel tuvastatud FPV genoomiga (juurdepääsunumber MN127780). Avastatud kalakassi CPPV-1 evolutsiooniprotsessi edasiseks selgitamiseks viidi läbi mitu rekombinatsiooni tuvastamist ja evolutsioonianalüüsi 224 CPPV-1 täielikust genoomijärjestusest koosneva andmekogumiga. Rekombinatsioonianalüüs näitas, et kalapüügi kassi CPPV-1 järjestustes ei leitud ühtegi rekombinatsiooni. Nende andmete evolutsiooniline puu näitas kahte peamist erinevat eraldatud klade (joonis 5). Üks klaad sisaldas FPV-d ja MEV-d ning teine klaad sisaldas kõiki CPV-järjestusi. Üldine evolutsioonikiirus oli hinnanguliselt 1,08 × 10–4 asendust saidi kohta aastas (95 protsenti HPD: 1,95–2,87 × 10–4). Evolutsioonipuu näitas, et kalapüügi kasside FPV järjestused olid koondunud samasse FPV liini, mis Taist eraldati. Neil on ühine geneetiline evolutsioon Hiina kodukasside FPV genoomidega ja neil võib olla sama päritolu alates umbes 1970. aastast.
Arutelu
CPPV{0}} variantide, mis hõlmavad CPV-d ja FPV-d, ringlust on tuvastatud nii kodu- kui ka metsikutel kiskjatel. Kuigi kodukoertel ja -kassidel on CPPV-1 surmaga lõppev infektsioon tavaline, esineb seda nakkust juhuslikult metsikutel kiskjatel [46]. Mitmed uuringud on näidanud, et paljud looduslikud lihasööjad on vastuvõtlikud CPPV-1-nakkusele, sealhulgas metsikud kassid, naaritsad, saarmad, skunksid, kährikud, rebased, hundid, koiotid, tsiivetid ja märtrid [11, 19]. Eelkõige perekonna Prionailurus puhul on teatatud, et ainult leopardkassid on nakatunud CPPV-1 variantidega [9]. Selles uuringus kirjeldame CPPV -1 liikme FPV loomulikku nakatumist looduslikel kalapüügikassidel (Prionailurus viverrinus). See on esimene aruanne, mis kirjeldab viiruse erinevat levikut ja tropismineerukudedmida kinnitab antigeenne tuvastamine, kasutades ultrastruktuuri PCR, IHC, ISH ja TEM analüüsi.
Täheldatud on CPPV-1 variantide liikidevahelist ülekandumist kodu- ja metsikkiskjate vahel ning on oletatud, et mõned surmaga lõppenud CPPV-1 puhangud on seotud patogeenide levikuga elupaikadesse [9, 11]. Praeguse metsloomade elupaikade kadumise tõttu on metsikute kolooniad rännanud ja jaganud elupaiku koduloomadega, mis on suurendanud patogeenide levikut vastuvõtlike loomade vahel. Selles uuringus avastasime, et kalakassi CPPV-1 genoomidel on evolutsiooniline muster jaganud aastal tuvastatud FPV tüvedega.
Joonis 4. Fülogeneetiline topoloogia, mis näitab täispikkade kodeerivate järjestuste geneetilist seost kalapüügi kassi CPPV-1 ja teiste CPPV-1 variantide vahel. Fülogeneetiline puu näitas, et kalakassi CPPV-1 järjestused (tähistatud punaste kolmnurkadega) olid koondunud koos FPV genoomidega, mille genoom on kõige enam seotud Tai kassil tuvastatud FPV genoomiga (MN127780). Näidati selles analüüsis kasutatud varem kirjeldatud CPPV-1 järjestuste GenBanki liitumisnumbrid.
kodukassid Tais. Need tulemused näitavad Hiinas kodukassidest alates 1970. aastatest isoleeritud ühiste esivanemate FPV tüvede sarnast evolutsioonimustrit. See tulemus võib viidata võimalikele tõenditele kodukasside ja kalapüügikasside liikidevahelise ülekandumise kohta või CPPV-1 variantide koosarengu kohta. Kuna aga samades elupaikades vabalt ringi liikuvatelt loomadelt võetud proovide arv ja uuritud kalapüügikasside väike arv on piiratud, ei õnnestunud selles uuringus CPPV-1 peamist reservuaari tuvastada ja vaja on täiendavat uurimist. . Kuigi mitmed uuringud on näidanud, et kapsiidigeeni erinevad aminohappejäägid on seotud nii võimega nakatada uusi peremeesorganisme kui ka CPPV antigeensusega -1 [18, 47], on ühe aminohappe mutatsioon positsioonis 300 kapsiidvalku (VP2) on kirjeldatud mitme peremeesorganismi vahemiku võtmetegurina [48]. Selles uuringus näitas kalapüügikassidelt saadud CPPV-1 variant samu aminohapete mustreid, mis FPV järjestustes, kusjuures alaniini (A) olemasolu peamise aminohappe määrajana kapsiidi positsioonil 300. Kuigi kalakassi CPPV-1 kapsiidivalk paljastas asparagiini (N) ja alaniini (A) aminohapped, mis paiknesid vastavalt positsioonides 564 ja 568 (mida peetakse kriitiliseks FPV replikatsiooni jaoks kasside peremeesorganismis), neil oli 2 ainulaadset aminohappemutatsiooni positsioonides I566M ja M569R. Need mutatsioonid võivad seda viirust eelnevalt kirjeldatud CPPV{20}} variantidest eristada. Varasem esivanemate rekonstrueerimise analüüs näitas, et FPV võib nakatada erinevaid lihasööjaid VP2 geenis väheste muutustega [49]. Seega nimetati FPV-sarnast parvoviirust esialgselt kalapüügikassidel tuvastatud potentsiaalselt uudseks viiruseks ja see võib toetada selle viiruse esmast tuvastamist sellel liigil. Kuid väike arv uuritud kalapüügikasse võrreldes väikese arvu teiste järjestustega ei pruugi anda lõplikku tõlgendust. See vajab täpsemate järelduste tegemiseks täiendavat uurimist.
Kalastuskassi CPPV-1 lokalisatsioone täheldati erinevates kudedes, sealhulgas sooleepiteelirakkudes ja lümfoidrakkudes, kus CPPV-1 nakkuse levinuim kudede lokaliseerimine on leitud teistel liikidel [20, 26, 50, 51 ]. Huvitav on see, et kuna viiruse genoomi tuvastamise esialgne uurimine PCR-i abil ja viiruse lokaliseerimine IHC abil näitasid viiruse erinevat lokaliseerumistneerukuded, teostasime PAS-värvimise, et demonstreerida rakuarhitektuurineerukudeja välistada süsteemne hüpoksia kui tubulaarse nekroosi võimalik põhjus. PAS-i värvimine näitas, et kõige torukujulised alusmembraanid olid terved, mis viitab sellele, et see kahjustus ei pruugi tuleneda süsteemsest hüpoksiast [52]. Seda kahjustust võivad aga põhjustada ka muud põhjused, nagu toksiinidest põhjustatud tubulaarnekroos. Seega on seotud FPV-sarnase parvoviiruse infektsiooni rollneerudkahjustused vajavad veel täiendavat uurimist. Lisaks püüdsime veelgi selgitada viiruse säilinud lokaliseerimistneerukudekasutades ISH-d ja TEM-i pop-off tehnikaga [37] piirkondades, kus tuvastati CPPV-1 IHC-immunoreaktiivsus. Elektrontihedaid osakesi täheldati tuumasneerutorukujulineepiteelirakud ja uroteelirakud, toetades CPPV positiivset in situ immunoreaktiivsust-1neerukude. FPV-ga nakatunud kassid eritavad viirust peamiselt väljaheitega, kuid on kirjeldatud aktiivse viiruse esinemist uriinis [53, 54]. Hiljutised uuringud on näidanud, et parvoviiruse infektsioonil on oma rollneerupuudulikkus[55]. Kuid FPV ja CPV vaste lokaliseerimineneerukudepole varem uuritud. Lisaks veel hiirneerudon tõestatud, et parvoviirus (MKPV) on nefrotroopne viirus, kuna sellel on afiinsus nakatada ja lokaliseeridaneerutorukujulineepiteelirakud, mille tulemuseks onneeruhaigused [56, 57].
Meie teadmiste põhjal on CPPV{0}} lokaliseerimine riigisneerudpole varem kirjeldatud. See viitab selle liigi ainulaadse viiruse lokaliseerimise uudsele kirjeldusele või isegi juhul, kui seda võib leida FPV-ga nakatunud kassidest. See leid võib toetada varasemaid uuringuid, mis leidsid FPV-d uriinis. Unikaalsed patoloogilised leiud võivad olla subjektiivsed ja neid võib üksikisikutel täheldada infektsioonina. Seega hõlbustab kalapüügi kasside CPPV-1 ulatuslik uurimine lõplikku tõlgendust. Lisaks ei sobi nendelt loomadelt edasiseks elundite kogumiseks isendid, mis saadeti peamiselt surnud loomadelt ja olid juba läbinud surmajärgse autolüüsi. Seega ei õnnestunud meil määrata viiruse lokaliseerimist teistes elundites. Kalapüügikassi CPPV-1 ebatüüpilise viiruse lokaliseerimise väljaselgitamine oleks kasulik uurimine.
CISTANCHE PARANDAB NEERU-/NEERUHAIGUST
CPPV-1 on tuvastatud erinevatel metsikutel kiskjatel ja seda seostatakse surmaga lõppevate haiguspuhangutega. Selle uuringu negatiivsed tõendid retrospektiivse CPPV-1 tuvastamise kohta loomaaia metsikutes proovides võivad tuleneda sellest, et vastuvõtlike loomade vahel puudub tihe kontakt või teisest küljest on proovide pikaajaline säilitamine, mis mõjutab genoomsete materjalide stabiilsust. CPPV-1 uudne identifitseerimine, mis on seotud kalakasside sureliku infektsiooniga selles uuringus, tekitab muret selle haavatava looma uudse, potentsiaalselt virulentse haiguse pärast. Seetõttu on CPPV-1 edasikandumise uurimine kalapüügil olevatel kassidel hädavajalik, et vältida teiste vastuvõtlike loomaliikide kadu. Seetõttu tuleks rõhutada ennetusstrateegiaid, et hallata CPPV{6}}-nakkusi mitte ainult sellel liigil, vaid ka vabalt ringi liikuvatel koduloomadel, kes võivad olla selle viiruse potentsiaalsed peremehed.
