ACOT13 ja PTGER2 identifitseerimine autosomaalse domineeriva polütsüstilise neeruhaiguse uudsete kandidaatgeenidena kogu eksoomi sekveneerimise kaudu

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com

Na Du¹, Dan Dong³, Luyao Sun¹, Lihe Che¹, Xiaohua Li¹, Yong Liu^2*†ja Bin Wang^1*†

Abstraktne

Taust:Autosoomne domineeriv polütsüstneerudhaigus (ADPKD) on kõige levinum monogeenneneerudhäire. Pooled patsientidest arenevad aeglaselt lõppstaadiumis neeruhaiguseks. Siiski puudub ADPKD ravi potentsiaalne sihtmärk.

Meetodid:NeliADPKDsellesse uuringusse kaasati patsiendid ja kaks tervet pereliiget. Perifeersed vereproovid saadi ja testiti kogu eksoomi järjestuse (WES) abil. ADPKD patsientide autosomaalsed mutatsioonid säilitati kandidaatkohtadena. Geeniontoloogia (GO), Kyoto geenide ja genoomide entsüklopeedia (KEGG) rikastamise ja valgu-valgu interaktsioonivõrgu (PPI) analüüsid viidi läbi klasterrulli R-paketiga. Andmekogum, mis sisaldas 18 ADPKD patsienti ja kolme normaalset proovi, laaditi alla andmebaasist Gene Expression Omnibus (GEO) ja analüüsiti limma R paketi abil.

Meetodid:NeliADPKDsellesse uuringusse kaasati patsiendid ja kaks tervet pereliiget. Perifeersed vereproovid saadi ja testiti kogu eksoomi järjestuse (WES) abil. ADPKD patsientide autosomaalsed mutatsioonid säilitati kandidaatkohtadena. Geeniontoloogia (GO), Kyoto geenide ja genoomide entsüklopeedia (KEGG) rikastamise ja valgu-valgu interaktsioonivõrgu (PPI) analüüsid viidi läbi klasterrulli R-paketiga. Andmekogum, mis sisaldas 18 ADPKD patsienti ja kolme normaalset proovi, laaditi alla andmebaasist Gene Expression Omnibus (GEO) ja analüüsiti limma R paketi abil.

Järeldused:WES-i, geeniekspressiooni ja PPI-võrgu analüüside kombinatsiooni abil tuvastasime potentsiaalsetena ACOT13 ja PTGER2ADPKD- seotud geenid.

Märksõnad:Terve eksoomi sekveneerimine, geenimutatsioonid, polütsüstilineneerudhaigus, ACOT13, PTGER2

Cistanche tubulosa hoiab ära neeruhaiguse, proovi saamiseks klõpsake siin

Sissejuhatus

Polütsüstilineneerudhaigus (PKD) on monogeensete häirete rühm ja see on lõppstaadiumis neeruhaiguse tavaline põhjus. Enamikku täiskasvanud patsiente mõjutab autosoomne dominantne vorm (ADPKD), samas kui autosoomne retsessiivne polütsüstiline vormneerudhaigus (ARPKD) on haruldasem vorm, mis avaldub tavaliselt perinataalselt või varases lapsepõlves [1]. PKD1 ja PKD2 mutatsioonid, mis kodeerivad polütsüstiin 1 ja 2 (PC1 ja PC2) valke, on ADPKD kõige levinumad põhjused. PC2, katioonkanal, on ioonikanalite transientretseptorpotentsiaali (TRP) perekonna liige [2]. Teatati, et PKD2 defektid põhjustavad muutusi mitokondriaalses energia metabolismis [3]. PC1 ja PC1PC2 kompleksi rollid on halvasti mõistetavad [4]. Kuigi PKD pärineb monogeenselt, on see fenotüübi, geeni ja alleeli poolest heterogeenne [1] ning 7 protsentiADPKDperekonnad on geneetiliselt lahendamata [5]. Lisaks on selle aluseks olevad molekulaarsed mehhanismidneeru-düsfunktsioonPKD geenide mutatsioonidest tulenevad ja polütsüstiini valkude füsioloogilised funktsioonid on samuti endiselt ebaselged [6].

1 ja 2 (PC1 ja PC2) valgud on ADPKD kõige levinumad põhjused. PC2, katioonkanal, on ioonikanalite transientretseptorpotentsiaali (TRP) perekonna liige [2]. Teatati, et PKD2 defektid põhjustavad muutusi mitokondriaalses energia metabolismis [3]. PC1 ja PC1PC2 kompleksi rollid on halvasti mõistetavad [4]. Kuigi PKD pärineb monogeenselt, on see fenotüübi, geeni ja alleeli poolest heterogeenne [1] ning 7 protsenti ADPKD perekondadest on geneetiliselt lahendamata [5]. Veelgi enam, PKD geenide mutatsioonidest tuleneva neerufunktsiooni häire aluseks olevad molekulaarsed mehhanismid ja polütsüstiini valkude füsioloogilised funktsioonid on samuti endiselt ebaselged [6].

Siin teostasime WES-i, kasutades nende geenide variatsiooni analüüsimiseks nelja ADPKD patsiendi ja kahe terve pereliikme vereproove. Lisaks saadi Gene Expression Omnibus (GEO) andmebaasist geeniekspressiooni andmestik, mis sisaldas 18 ADPKD patsienti ja kolme normaalset proovi. Geenmutatsiooni, geeniekspressiooni, geenifunktsiooni rikastamise ja valgu-valgu interaktsiooni (PPI) integreeritud analüüside abil tuvastasime kaks geeni (ACOT13 ja PTGER2), mis olid potentsiaalselt seotud ADPKD patogeneesiga.

materjalid ja meetodid

Kliiniline teave

Selle uuringu kiitis heaks kohalik eetikakomitee (kinnitusnumber: 2019-307). Meie haiglas raviti ADPKD patsienti ja sellesse uuringusse kaasati viis selle pere liiget. Sellel patsiendil oli anamneesis polütsüstneerud haigus, polütsüstiline maksahaigus ja neerukivid 13 aastat (lisatoimik 1: tabel S1). Selle perekonna sugupuu on näidatud joonisel 1A. Te N_2 oli see proband. Te N_4, N_5 ja N_6 olid kõik ADPKD patsiendid (mustad), samas kui N_3 ja N_1 olid terved inimesed (valged) . Kokku oli meie uuringus neli ADPKD patsienti ja kaks tervet kontrolli. Selle probandi kliinilisteks sümptomiteks olid palavik, seljavalu ja hematuuria. N_2 kompuutertomograafia (CT) näitas mitut tsüsti maksas ja kahepoolses polütsüstilises neerus. Mõned kahjustused olid keerulised tsüstid, muutustega paremas perirenaalses eksudatsioonis, mille piirjooned olid hägused ja tihedus suurenenud (joonis 1B).

Terve eksoomi järjestamine

Genoomi DNA ekstraheeriti perifeersetest vereproovidest, kasutades DNA ekstraheerimiskomplekti (Tiangen Biotech, Peking, Hiina) ja eksoomid jäädvustati, kasutades Agilent SureSelect Human All Exon V6 komplekti (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) vastavalt juhistele. komplektidest. Terve eksoomi sekveneerimine viidi läbi Illumina Novaseq6000 instrumentidega, millel oli paarisotsa 150-bp sekveneerimislugemine. Toores järjestuse lugemised töödeldi eeltöödeldud, et eemaldada madala kvaliteediga alused ja lugemised, kasutades kiiret [11], ülikiiret kõik-ühes FASTQ-eelprotsessorit, ning võeti vastu vaikeparameetrid. Järjestuste lugemised joondati inimese genoomiga (Build-UCSC hg19), kasutades BWA (Burrow-Wheeler Aligner, http://bio-bwa.sourceforge.net/) tarkvara. SAMtoolsi tarkvaraga (//samtools.sourceforge.net/) tuvastati kümme ühe nukleotiidi polümorfismi (SNP) ja sisestamist/deletsiooni (Indel). ANNOVAR tarkvara (http://annovar.openbioinformat ics.org/en/latest/user-guide/download/) abil viidi identifitseeritud SNP ja Indeli jaoks läbi funktsionaalne annotatsioon, et uurida nende genoomi asukohti ja variatsiooniteavet (lisafail 2 : tabel S2).

Kandidaadi SNP/Indeli sõelumine ADPKD jaoks

Esmalt eemaldasime mutatsioonid sagedusega üle 1 protsendi vähemalt ühes neljast andmebaasist (1000g{2}}all, esp6500si_all, gnomAD_ALL ja gnomAD_ EAS). Kümme, eksooniliste või splaissimise (10 aluspaari eksonist üles- ja allavoolu) positsioonide mutatsioonid säilitati. Väikesed killud (<10 bp)="" non-frameshifting="" indel="" mutations="" in="" the="" repeat="" region="" were="" also="" removed.="" in="" addition,="" mutations="" that="" met="" one="" of="" the="" following="" conditions="" were="" retained:="" (a)="" te="" sites="" that="" were="" considered="" as="" harmful="" by="" at="" least="" half="" of="" the="" four="" software="" sift="" [12],="" polyphen="" [13],="" mutationtaster="" [14],="" and="" cadd="" [15]="" basing="" on="" the="" scores;="" (b)="" mutations="" that="" were="" predicted="" to="" affect="" the="" splicing="" by="" dbscsnv="" [16].="" ten,="" the="" genetic="" mutations="" that="" were="" classified="" into="" pathogenic="" and="" likely="" pathogenic="" ones="" according="" to="" the="" criteria="" and="" guidelines="" for="" grading="" clinical="" significance="" of="" single-gene="" mutations="" of="" american="" college="" of="" medical="" genetics="" and="" genomics="" (acmg,="" https://www.acmg.net/)="" were="" selected="" as="" candidate="" sites.="" for="" the="" screening="" of="" dominant="" genetic="" pattern,="" on="" the="" basis="" of="" mutation="" site="" filtering,="" the="" sites="" showing="" autosomal="" mutations="" in="" adpkd="" patients,="" which,="" however,="" could="" not="" be="" detected="" in="" normal="" controls="" were="" retained="" as="" candidate="">

Funktsionaalne rikastamine ja PPI analüüsid

GSE7869 [18] mRNA ekspressiooniprofiili andmed laaditi alla GEO andmebaasist (https://ncbi.nlm. nih.gov/geo), mis tuvastati Affymetrix Human Genome U133 Plus 2 põhjal.{4}} Array . GSE7869 andmestik sisaldas 18 ADPKD proovi ja kolme tavalist proovi. mRNA ekspressiooniprofiili andmeid analüüsiti, kasutades limma funktsiooni paketti R-s [19]. Diferentsiaalselt ekspresseeritud geenid (DEG-d) valiti, kasutades diferentsiaalekspressiooni absoluutväärtuse künniseid (|Log2FC|) > 0.5 ja P-väärtus <>

Statistiline analüüs

Statistilised analüüsid viidi läbi R tarkvara v3.5.2 abil. P-väärtust < 0,05="" peeti="" kõigis="" statistilistes="" analüüsides="" statistiliselt="">

Results

Mutatipealal landscape

SNP-de koguarv kuues proovis oli koondunud vahemikku 100,000 kuni 150,000 ning need paiknesid peamiselt intronipiirkonnas, eksonipiirkonnas ja geenidevahelises piirkonnas (joonis 2A). Indelite koguarv kuues proovis oli koondunud vahemikku 15,000 kuni 20,000 ning need indelid olid peamiselt jaotunud introni- ja intergeenses piirkonnas (joonis 2B). Järgmisena uurisime kodeerivas piirkonnas paiknevate mutatsioonide maastikku. Järelikult sisaldasid kodeerivas piirkonnas kuue proovi SNP-d peamiselt anonüümseid, missense ja stop-loss mutatsioone, mille kumulatiivne arv oli peaaegu 21,000 (joonis 2C). Kodeerimispiirkonna kuue valimi Indelid koosnesid peamiselt kaadrinihketa{14}}kustutusest ja kaadrinihketa{15}}sisestamisest (joonis 2D)

ADPKD potentsiaalsed mutatsioonid ja geenid

Kuus mutantset geeni, sealhulgas AGRN, ACOT13, ADCY4, HEATR5A, PTGER2 ja ADAM21, skriiniti domineeriva geneetilise mustriga. Nad olid ADPKD proovides heterosügootselt muteerunud, kuid normaalsetes proovides ei muteerunud. Enamik neist geenidest ei ole seotud ADPKD esinemisega. Vahepeal valiti ka 19 geeni vastavalt mutatsiooni kahjulikkusele, sealhulgas MUTYH, USH2A, HBS1L, GLI3, SBDS, SND1, ABCA2, RPS6KA4, FLVCR1, ATIC, SCN11A, ATP6V1A, GLASS, PRMT8, INSPL3, 4SUPTHLRA1, PRMT8, PKD1. ja GPR143. Nende geenimutatsioonide ja ADPKD vahelise seose uurimiseks analüüsisime esmalt geenimutatsioonide mõju valkudele. Järelikult oli kõigil neil geenidel vähemalt üks mutatsioon, mis võis mõjutada valgu kodeerimist, mis näitab nende mutatsioonide potentsiaalset rolli (tabel 1).

Oluliselt rikastatud KEGG rajad ja potentsiaalsete ADPKD-ga seotud geenide GO terminid

ADPKD-ga seotud 25 potentsiaalse geeni GO ja KEGG rikastamise analüüside tulemused on näidatud joonisel 3A (bioloogiline protsess), joonisel 3B (rakuline komponent), joonisel 3C (molekulaarfunktsioon) ja joonisel 3D (KEGG). . GO analüüs näitas, et need 25 geeni olid märkimisväärselt rikastatud ühe organismi rakuprotsessi bioloogilistes protsessides (BP) ja reaktsioonis stiimulile, plasmamembraani ja raku perifeeria rakukomponentidele (CC) ning anioonide sidumise molekulaarsele funktsioonile (MF). Lisaks näitas KEGG raja analüüs, et need 25 geeni olid peamiselt rikastatud tsüklilise adenosiinmonofosfaadi (cAMP) signaaliradade ja vähi radadega.

ACOT13 ja PTGER2 võivad olla ADPKD-ga seotud kandidaatgeenid

PPI võrgu analüüs viidi läbi, et uurida seost 25 potentsiaalse ADPKD-ga seotud geeni vahel. Nagu on näidatud joonisel 3E, olid enamik neist geenidest võrgus sõltumatud. ACOT13-l oli otsene suhtlus nii SBDS-i kui ka ATIC-ga; Eeldati, et PTGER2, ADCY4 ja INSL3 suhtlevad üksteisega (joonis 3E). Veelgi enam, ACOT13, PTGER2 ja ADCY4 olid geenid, mis muteerusid ainult ADPKD patsientidel. , võrreldi GEO andmebaasist allalaaditud ekspressiooniandmete põhjal ACOT13, PTGER2 ja ADCY4 ekspressioonitasemeid ADPKD patsientide ja normaalsete kontrollide vahel. Võrreldes tavaliste kontrollidega oli ACOT13 ekspressioonitase ADPKD patsientidel oluliselt madalam (joonis 4A), samas kui PTGER2 ekspressioonitase oli ADPKD patsientidel kõrgem (joonis 4B). ADCY4 ei näidanud olulist ekspressioonierinevust ADPKD patsientide ja normaalsete proovide vahel (joonis 4C). Teavet kombineerides oletasime, et ACOT13 ja PTGER2 võivad olla ADPKD-ga seotud kandidaatgeenid.

Arutelu

ADPKD on põhjustatud mutatsioonist ühes kahest geenist-78 protsenti juhtudest on põhjustatud 16. kromosoomi PKD1 mutatsioonist ja 15 protsenti juhtudest on põhjustatud 4. kromosoomi PKD2 mutatsioonist [20]. Tsüstilisi neeruhaigusi on nimetatud ka tsiliopaatiaks. Te PC1 ja PC2 valgud, mida kodeerivad PKD1 ja PKD2, asuvad mõlemad primaarsetel ripsmetel ja toimivad neerus vooluanduritena [21]. Selles uuringus tuvastati ADPKD patsientide proovides kahjulik mutatsioon PKD1-s ja veel 18 teadaolevat kahjulikku geeni. Veelgi enam, kuut mutanti, sealhulgas AGRN, ACOT13, ADCY4, HEATR5A, PTGER2 ja ADAM21, skriiniti domineeriva geneetilise mustriga ja enamikku neist ei olnud varem ADPKD-ga seotud patogeensete geenidena tunnustatud.

ADPKD patogeensed valgud vastutavad peamiselt teabe edastamise eest väliskeskkonnast rakkudesse [22]. Analüüsime GO ja KEGG rikastamisanalüüside abil 25 tuvastatud geeni potentsiaalseid funktsioone. Tulemused näitasid, et ühe organismi rakuprotsessi BP-d, reaktsioon stiimulile, samuti plasmamembraani ja raku perifeeria CC-d rikastati oluliselt. Lisaks võivad ADPKD rakud oma energiatootmise viisi oksüdatiivselt fosforüülimiselt teistele radadele nihutada ja need muutused rakkude metabolismis on kujunenud ADPKD tunnuseks [6]. Muutused energia tootmise ja kasutamise moduleerimises ADPKD-s sõltuvad mitmest sisemisest raku signalisatsiooniradadest, nagu AMP-aktiveeritud proteiinkinaas (AMPK), kaltsiumi signaalimine mitokondritega seotud membraanidel, rapamütsiini kompleksi 1 (mTORC1) imetaja sihtmärk, cAMP ja tsüstilise fibroosi transmembraanse juhtivuse regulaatori (CFTR) vahendatud ioonitransport [23, 24]. Siin tuvastati cAMP signaalirada nendes ADPKD proovides oluliselt rikastatud radana. Need tulemused toetavad meie skriinitud mutatsioonide usaldusväärsust. Samal ajal, hoolimata rikastamise analüüsist osaliselt ilmnenud funktsionaalsest teabest, väärisid 25 tuvastatud geeni üksikasjad tulevikus ADPKD täiendavat uurimist.

PPI ja diferentsiaalse ekspressiooni analüüsid näitasid, et võrreldes normaalsete inimestega olid ACOT13 ja PTGER2 ADPKD patsientidel muteerunud ja erinevalt ekspresseeritud ning võivad olla ADPKD-ga seotud potentsiaalsed geenid. ACOT13 valk on atsüül-CoA tioesteraaside (Acts) ensüümide liige, mis katalüüsivad rasvhapete atsüül-CoA molekulide hüdrolüüsi reaktsiooni vabadeks rasvhapeteks ja CoASH-ks. ACOT13 on rikastatud oksüdatiivsete kudedega ja on seotud mitokondritega [25]. Lin et al. teatas, et PC1 mõjutas mitokondrite morfoloogiat ja funktsiooni, mis võib mängida võtmerolli mitokondriaalse funktsiooni ja raku metabolismi reguleerimisel [26]. Meile teadaolevalt ei ole ACOT13 ja ADPKD vahelise seose kohta teateid. PTGER2 ekspressioon mõjutab erinevat tüüpi pahaloomuliste kasvajate bioloogilist käitumist [27–29], mis peaks olema seotud vähiteede rikastamisega KEGG analüüsis. Muidu on juba uuritud prostaglandiin E (2) (PGE2) rolli tsüstogeneesis ADPKD geneetiliselt mittenortoloogilistes mudelites. Liu et al. leidis, et PGE2 võib aktiveerida hälbivaid signaaliradu PC-1-puuduliku epiteeli korral ning vahendada proliferatsiooni ja kloriidide sekretsiooni ADPKD tsüstilise neeruepiteelis [30]. Elberg et al. on näidanud PTGER2 rolli PGE2 mõju vahendamisel tsüsti moodustumise esilekutsumisel kombineeritud biokeemiliste, farmakoloogiliste ja funktsionaalsete analüüside abil ADPKD-s [31]. See kinnitab veelgi meie lähenemisviisi usaldusväärsust patogeensete geenide sõeluuringule ADPKD-s, mis võib olla rakendatav ka muude haiguste korral. Samuti toetab see kaudselt ACOT13 kui potentsiaalse ADPKD-ga seotud geeni usaldusväärsust. ACOT13 bioloogiline funktsioon ADPKD-s nõuab siiski täiendavaid uuringuid.

Järeldused

Selles uuringus tuvastasime kaks potentsiaalset ADPKD-ga seotud geeni, sealhulgas ACOT13 ja PTGER2, analüüsides nelja ADPKD patsiendi ja kahe terve pereliikme WES-i tulemusi koos GEO andmebaasi geeniekspressiooni andmetega. Meie tulemused võivad olla abiks ADPKD patoloogiliste põhjuste edasistes uuringutes. Kuid meie uuringus osalevate patsientide väikese arvu tõttu on ACOT13 ja PTGER2 võimaliku rolli osas endiselt teatud ebakindlus, mis nõuab siiski täiendavaid uuringuid.

Viited

1. Bergmann C, Guay-Woodford LM, Harris PC, Horie S, Peters DJM, Torres VE. Polütsüstiline neeruhaigus. Nat Rev Dis krundid. 2018; 4(1):50. https://doi. org/10.1038/s41572-018-0047-a.

2. Grieben M, Pike AC, Shintre CA, Venturi E, El-Ajouz S, Tessitore A, Shrestha L, Mukhopadhyay S, Mahajan P, Chalk R jt. Polütsüstilise neeruhaiguse TRP kanali Polycystin-2 (PC2) struktuur. Nat Struct Mol Biol. 2017;24(2):114–22.

3. Chumley P, Zhou J, Mrug S, Chacko B, Parent JM, Challa AK, Wilson LS, Berryhill TF, Barnes S, Kesterson RA jt. Kärpimine PKHD1 ja

PKD2 mutatsioonid muudavad energia metabolismi. Am J Physiol Renal Physiol. 2019;316(3): F414–25.

4. Kim DY, Park JH. ADPKD geneetilised mehhanismid. Adv Exp Med Biol. 2016;933:13–22.

5. Cornec-Le GE, Olson RJ, Besse W, Heyer CM, Gainullin VG, Smith JM, Audrezet MP, Hopp K, Porath B, Shi B jt. DNAJB11 monoalleelsed mutatsioonid põhjustavad ebatüüpilist autosoom-dominantset polütsüstilist neeruhaigust. Olen J Hum Genet. 2018;102(5):832–44.

6. Padovano V, Podrini C, Boletta A, Caplan MJ. Ainevahetus ja mitokondrid polütsüstilise neeruhaiguse uuringutes ja ravis. Nat Rev Nephrol. 2018;14(11):678–87. https://doi.org/10.1038/s41581-018-0051-1.

7. Bergmann C. Viimased edusammud polütsüstilise neeruhaiguse molekulaardiagnostikas. Ekspert Rev Mol Diagn. 2017;17(12):1037–54. https://doi. org/10.1080/14737159.2017.1386099.

8. Yang Y, Muzny DM, Xia F, Niu Z, Person R, Ding Y, Ward P, Braxton A, Wang M, Buhay C jt. Molekulaarsed leiud patsientide seas, kes on suunatud kliinilisele kogu eksoomi järjestusele. JAMA. 2014;312(18):1870–9.

9. Mallawaarachchi AC, Hort Y, Cowley MJ, McCabe MJ, Minoche A, Dinger ME, Shine J, Furlong TJ. Terve genoomi järjestamine ületab pseudogeense homoloogia, et diagnoosida autosoomne domineeriv polütsüstiline neeruhaigus. Eur J Hum Genet. 2016;24(11):1584–90. https://doi.org/10.1038/ ejhg.2016.48.

10. Braun DA, Schueler M, Halbritter J, Gee HY, Porath JD, Lawson JA, Airik R, Shril S, Allen SJ, Stein D jt. Terve eksoomi sekveneerimine tuvastab põhjuslikud mutatsioonid enamikul sugulus- või perekondlikel juhtudel koos lapsepõlves tekkinud suurenenud neeru ehhogeensusega. Kidney Int. 2016;89(2):468–75.

11. Chen S, Zhou Y, Chen Y, Gu J. kiire: ülikiire kõik-ühes FASTQ eelprotsessor. Bioinformaatika. 2018;34(17):i884–90.

12. Kumar P, Henikof S, Ng PC. Mittesünonüümsete variantide kodeerimise mõju ennustamine valgu funktsioonile SIFT-algoritmi abil. Nat Protoc. 2009;4(7):1073–81.

13. Flanagan SE, Patch AM, Ellard S. SIFT ja PolyPhen kasutamine funktsiooni kadumise ja funktsiooni suurenemise mutatsioonide ennustamiseks. Genet Test Mol Biomarkerid. 2010;14(4):533–7.

14. Schwarz JM, Rodelsperger C, Schuelke M, Seelow D. MutationTaster hindab järjestuse muutuste haigust põhjustavat potentsiaali. Nat meetodid. 2010;7(8):575–6.

15. Itan Y, Shang L, Boisson B, Ciancanelli MJ, Markle JG, Martinez-Barricarte R, Scott E, Shah I, Stenson PD, Gleeson J jt. Mutatsiooni olulisuse piir: variantide prognoosimise geenitaseme läved. Nat meetodid. 2016;13(2):109–10.

16. Liu X, Wu C, Li C, Boerwinkle E. dbNSFP v3.0: inimeste mittesünonüümsete ja splaissimiskoha SNV-de funktsionaalsete prognooside ja märkuste ühekordne andmebaas. Hum Mutat. 2016;37(3):235–41.