Hiire kudedes esinevad kõhukelme makrofaagid homöostaasis, paranemises, nakatumises ja kasvaja metastaasides, 1. osa

1. Sissejuhatus

Kõhukelmeõõs, samuti pleura ja perikardi õõnsused tekivad embrüonaalsest tsöloomist, õõnsusest, mis tekib embrüonaalse keha seina moodustumisel ja mis koosneb parietaalplaadi mesodermist ja ektodermist ning sooleseinast, mis hõlmab vistseraalset. plaatmesoderm ja endoderm.

Embrüo koelom on embrüo moodustumise protsessis oluline struktuur ja selle välimus tähistab embrüonaalset arengut blastotsüsti staadiumisse. Blastotsüsti staadiumis areneb embrüos vedelikuga täidetud kott, mida nimetatakse tseloomiks.

Embrüonaalne koelom mängib embrüo arengus väga olulist rolli. See tagab embrüole toitumise ja hingamise keskkonna ning võib väljutada jääkaineid. Lisaks võib embrüo koelom pakkuda embrüole teatud kaitset. Võib öelda, et ilma embrüo kehaõõnsuseta ei saa embrüo normaalselt areneda.

Teisest küljest on immuunsus ka üks inimese arengu olulisi tegureid. Immuunsus võib kaitsta keha väliste mikroobide ja viiruste eest, samuti võib see aidata meil võidelda erinevate haigustega. Embrüote puhul, kuna immuunsüsteem ei ole veel täielikult välja arenenud, tugineb embrüo kaitseks ema immuunsüsteemile.

Kuigi embrüonaalne kehaõõnsus ja immuunsus võivad tunduda mitteseotud, on nende vahel tõepoolest teatav seos. Mitmed uuringud on näidanud, et embrüonaalse tsöloomi keskkond mängib immuunsuse kujunemisel rolli. Näiteks embrüo kehaõõnes on mõned kasvufaktorid, mis võivad soodustada immuunsüsteemi arengut. Lisaks pakub embrüo kehaõõnes olev vedelik ka immuunrakkudele toitumist ja kaitset.

Kokkuvõtteks võib öelda, et embrüo tseloomi ja immuunsuse vaheline seos on väga tihe. Embrüo koelom loob hea keskkonna embrüo arenguks, samuti loob see soodsad tingimused immuunsüsteemi arenguks. Seetõttu peaksime väärtustama embrüo koelomi tähtsust ning keskenduma oma immuunsuse kaitsmisele ja edendamisele. Sellest vaatenurgast peame oma immuunsust parandama. Cistanche võib oluliselt parandada immuunsust, sest lihatuhk sisaldab mitmesuguseid bioloogiliselt aktiivseid komponente, nagu polüsahhariide, kaks seeni, Huang Li jne. Need komponendid võivad stimuleerida immuunsüsteemi Erinevat tüüpi rakke süsteemis, suurendada nende immuunaktiivsust.

Klõpsake Cistanche'i kasulikkust tervisele

Embrüonaalse tsöloomi moodustumise protsess on säilinud primitiivsetest superfüülist Protostomia ja Deuterostomia, nii et liikide Annelida, Mollusca, Echinodermata ja Tunicata selgrootutel on tsöloom, mis on anatoomiliselt ja arenguliselt samaväärne embrüonaalse tsöeloomiga,[2] mis tekitab imetajate embrüonaalse arengu ajal kõhukelme, pleura ja perikardi õõnsusi.

Kõhuõõnde katab kõhukelme, keha suurim seroosne membraan, mille pindala on võrreldav naha omaga ja mis koosneb mesoteelist, mesodermaalset päritolu epiteelist, basaalmembraanist ja submesoteliaalsest sidekoest.[ 3]

Parietaalne kõhukelme joondab kõhuseina sisepinda, vistseraalne kõhukelme aga integreerub kõhusiseste organite serooskihtidega.

Kõhukelme topeltvolt moodustab soolestiku, mis ühendab kõhu seedeorganeid kõhuseinaga ja toimib veresoonte, närvide ja lümfiteede kanalina. Mesoteelirakkude poolt eritatav väike kogus kõhukelme vedelikku toimib kõhuõõnes määrdeainena ja hoiab ära mehaanilise hõõrdumise kõhuorganite vahel. Kahes hiljutises aruandes hinnati hiirte kõhukelme vedeliku kogumahuks püsiseisundis umbes 50–100 μL [4,5] ning väideti, et see erineb isastel ja emastel (≈20 μL vs ≈100 μL) ja viimases muutuda innatsükli ajal.[6] Kõhukelmevedeliku äravool lümfisüsteemi võimaldab kõhukelmevedeliku tsirkulatsiooni[7] ja see saavutatakse mesoteelis olevate avade kaudu, mida nimetatakse stoomideks, mis asuvad peamiselt diafragmas ja omentumis.[3]

Omentum on vistseraalne rasvkude, mis areneb mesenteeriumi liigsel kasvul ja millel on spetsialiseerunud vaskulaarsüsteem ja organiseeritud lümfoidkude, mis väidetavalt mängivad olulist rolli kaitses kõhukelme infektsiooni vastu.[8] Läbi diafragma voolav kõhukelme vedelik koguneb subperitoneaalsetesse lümfisõlmedesse, et jõuda diafragmasse, mis kogub lümfisüsteemi, mis voolab mediastiinumi lümfisõlmedesse, samas kui läbi omentumi voolav kõhukelme vedelik koguneb omentaalsesse lümfisüsteemi, mis omakorda koguneb soolestiku lümfisüsteemi. ühendub tsisterna chyli kaudu rinnajuhaga.[3] Kõhuõõne drenaaž võimaldab kontrollida kõhukelme homöostaasi ja leukotsüütide retsirkulatsiooni, kuid suurendab patogeeni ja metastaatiliste kasvajarakkude leviku riski.

Kõhuõõne on avatud kahele peamisele patoloogiale, infektsioonile ja kasvaja metastaasidele, mis on üldiselt seotud kõrge suremusega, kuna patogeenid või kasvajarakud levivad kergesti kõhuõõnesisestesse elunditesse, ja kõhuõõne anatoomilised omadused, mis takistavad oluliselt tõhusate ravimeetodite väljatöötamine nende haiguste vastu. Kuigi kõhuõõnsus on kinnine ruum, mis ei puutu kergesti kokku sissetungivate patogeenidega, nagu need, mis tungivad läbi nahka, kopse või soolestikku, võivad sooleseina terviklikkuse kaotuse tõttu tekkida kõhukelme infektsioonid (põhjustatud haavanditest, herniate kägistusest). , pimesoolepõletik või kasvaja kasv), maksatsirroos, juhuslikud kõhuvigastused, kõhuõõneoperatsioon või peritoneaaldialüüs.

Kõhukelme õõnsus puutub kokku ka parietaalse või vistseraalse kõhukelme vigastustega, mis on põhjustatud traumast, infektsioonist või kõhuõõneoperatsioonist, mis võivad põhjustada kõhukelme adhesiooni. Kõhuõõne täiendavate patoloogiate hulka kuuluvad - kõhukelme endometrioos, millega kaasneb kroonilise põletikuga seotud emakavälise vaskulariseerunud endomeetriumi koe moodustumine kõhukelmes, - peritoneaalne autoimmuunne serosiit, autoimmuunhaigustest põhjustatud krooniline kõhukelme põletik, nagu Crohni tõbi ja operatsioonijärgne põletik. kõhukelme adhesioonid.[3,9,10]

Immuunkaitse peritoneaalse infektsiooni ja kasvaja metastaaside vastu tugineb esimesele kohalikule kaitseliinile, mida toetavad püsivas olekus kõhukelmeõõnes esinevad residendid, millel on kaasasündinud immuunsust tuvastavad ja reageerivad omadused. Teist immuunkaitseliini kõhuõõnes tagavad lümfoidkoe funktsionaalsed üksused, mis on seotud omentumis, soolestikus või sugunäärme rasvkoes paikneva rasvkoega, mida nimetatakse rasvaga seotud lümfoidkobarateks (FALC) või piimalaikudeks omentaalsete FALC-de jaoks. [8] FALC-d sisaldavad struktuurset organisatsiooni, mis on sarnane sekundaarsetes lümfoidorganites leiduvale, sealhulgas retikulaarrakkudel põhinev strooma, B- ja T-rakkude sektsioonid ning spetsiaalsed vere- ja lümfisooned, mis võimaldavad leukotsüütide migratsiooni kõhuõõnde ja sealt välja.[8]

Peritoneaalsed immuunrakud hõlmavad kudedes asuvaid peritoneaalseid makrofaage, mida tavaliselt nimetatakse suurteks peritoneaalseteks makrofaagideks (LPM) ja B1-rakkudeks. Hiljutised eksperimentaalsed tõendid on paljastanud, et peale esmase fagotsüütilise funktsiooni täidavad LPM-id erinevaid homöostaatilisi, parandavaid ja immunoloogilisi kaitsefunktsioone, mis peegeldavad varem ootamatut funktsionaalset plastilisust.[11] Peritoneaalseid B1-rakke peetakse kaasasündinud B-rakkudeks, mis toodavad konstitutiivselt looduslikku IgM-i, pakkudes kohalikku immuunkaitset paljude patogeenide vastu.

Lisaks toodavad B1-rakud aktiivselt IgM-i vastuseks viirustele, bakteritele, seentele ja parasiitidele.[12] Immuunsuse esimene rida imetajate kõhukelmeõõnes, mis põhineb fagotsüütilistel ja antikehade vahendatud kaitsemehhanismidel, mida toetavad LPM-id ja B1-rakud, meenutab primitiivseid kaitsemehhanisme, mida toetavad selgrootute tsöeloomiõõnes esinevad erinevad tsöelomotsüütide populatsioonid. 13–15] Immuunkaitsestrateegiad tsöeloomiõõnsustes on seetõttu olnud kogu evolutsiooni vältel selgrootutest kõrgemate selgroogseteni väga konserveerunud.

Selles ülevaates käsitleme hiljutisi tõendeid, mis on avardanud meie teadmisi LPM-ide bioloogiast, kirjeldades residentide embrüonaalsete LPM-ide asendamise mehhanisme residentidest luuüdi monotsüütidest pärinevate LPM-idega (moLPM-idega), mille tulemuseks on fenotüübiline ja funktsionaalne LPM-i seksuaalne dimorfism, ja paljastades, kuidas stabiilses olekus vedelas keskkonnas vabad LPM-id täidavad parandus- ja immuunkaitsefunktsioone, moodustades vastuseks kõhukelme vigastusele trombitaolisi struktuure ja pärast bakteriaalset nakatumist seob mesoteel dünaamilisi LPM-i agregaate.

Veelgi enam, hiljutised eksperimentaalsed tõendid kinnitavad, et kõhukelme kasvajad võivad kahjustada LPM-i metabolismi, mille tulemuseks on kasvajat soodustavate funktsioonide omandamine, mida võib siiski taastada eksperimentaalsete strateegiatega, mis blokeerivad kasvaja poolt põhjustatud LPM-funktsiooni õõnestamist, mis võiks olla arengu aluseks. uudsed immunoterapeutilised lähenemisviisid peritoneaalse kasvaja metastaaside vastu, mis põhinevad makrofaagide ümberprogrammeerimisel.

2. Suur kõhukelme makrofaagide identiteet

LPM-id on pikaealised, kudedes elavad makrofaagid, mis moodustuvad embrüonaalse elu jooksul ja mis on arenguliselt ja funktsionaalselt piiratud kõhuõõnde, erinevalt teistest kõhukelme immuunrakkude populatsioonidest, mis värvatakse kõhuõõnde ja tsirkuleerivad püsiseisundis teistesse kohtadesse ja patoloogilistes tingimustes. Nende hulka kuuluvad püsiseisundis B1-rakud, mis koos LPM-idega moodustavad valdava enamuse peritoneaalse loputuse teel kogutud rakkudest, ja väike protsent monotsüütidest pärinevaid SPM-e (väikeste peritoneaalsete makrofaagide jaoks), B2-rakke, T-rakke, NK-rakke. , kaasasündinud lümfoidrakud ja nuumrakud.[11]

Nagu käesolevas ülevaates põhjalikult käsitletud, on viimastel aastatel tehtud uuringud näidanud, et LPM-id mitte ainult ei täida peritoneaalseid homöostaatilisi funktsioone, vaid on seotud ka põletikust ja infektsioonist põhjustatud koekahjustuste parandamisega ning kaitsega mikroobse infektsiooni vastu. Veelgi enam, LPM-id aitavad kaasa enamikule kõhukelme patoloogiatele, eriti kõhukelme kasvaja metastaasidele, aga ka peritoneaalsele endometrioosile, autoimmuunsele serosiidile ja operatsioonijärgsetele adhesioonidele.

Residentsed embrüonaalsed LPM-id on CD11b pluss F4/80hi MHC-II− rakud, mis ekspresseerivad mitmeid markereid, mis iseloomustavad koes residentseid makrofaage, nagu CD14, CD64 ja MerTK.[16,17]

Peale selle näivad, et keha seroossetes õõnsustes paiknevad kudedes paiknevad makrofaagid, mis koosnevad LPM-idest ja pleura- ja perikardiõõntes esinevatest kudedest pärit makrofaagid, jagavad transkriptsioonifaktori GATA6, püüduri retseptori Tim4 ja M ekspressiooni. -CSF-retseptor CFSR1.[11,18] Lisaks iseloomustab embrüonaalsete LPM-ide residente mitmete rakupinna retseptorite ekspressioon, mis peegeldavad LPM-i homöostaatilisi, parandavaid, reguleerivaid ja kaitsefunktsioone, sealhulgas LPM-i adhesioonis ja lokaliseerimises osalevaid molekule, nagu ICAM. -2 (CD102), CD11b, CD49f, CD73 ja CD62P,[19] surnud rakkude tuvastamine ja eemaldamine, nagu CD36, CD93, CD163, Tim4, MerTK, MARCO ja MSR1,[4,16,20 –22] makrofaagide aktiveerimise negatiivne regulatsioon, tagades apoptootiliste rakkude, näiteks V-komplekti immunoglobuliini domeen, mis sisaldab 4-d (VSIG4), [23] patogeeni sidumine, nagu CD14, CD36 ja SIGN-R1 (CD209b) )[11,24] ja reaktsioon patogeenidele, nagu TLR4 ja TLR7.[25,26] Kõige tüüpilisemad embrüonaalsete LPM-ide poolt ekspresseeritud rakupinna molekulid on kokku võetud joonisel 1.

LPM-id kuuluvad kudedes elavate makrofaagide perekonda, mis jagavad embrüonaalse elu jooksul kindlaksmääratud põhiliiniga seotud geenide ekspressiooni, kuid omandavad koespetsiifiliste mikrokeskkonna signaalidega kokkupuutel koespetsiifiliste mikrokeskkonna signaalidega kokkupuutel koespetsiifilised transkriptsioonilised ja funktsionaalsed tunnused koe ekspressiooni kaudu. -spetsiifilised transkriptsioonifaktorid.[16,27] Sellega seoses on transkriptsioonifaktor GATA6 oluline LPM-spetsiifilise geeniekspressiooni, proliferatsiooni ja LPM-ide ellujäämise jaoks.[19,28,29] Järelikult on homöostaatiline, parandav ja kaitsev LPM. funktsioonid olid häiritud hiirtel, kellel müeloidsetes rakkudes puudus GATA6.[5,19,30] GATA6 ekspressioon säilib mitte-raku autonoomsel viisil[27,31] ja in vitro katsete põhjal tehti ettepanek, et see aktiveeriks A-vitamiini metaboliit retinoehape, retinoehappe tuumaretseptorite kaudu.[19]

Seega moduleeriks GATA6 ekspressiooni retinoehappe kohalik kättesaadavus, mis toetab kontseptsiooni, et GATA6-indutseeritud LPM-ide transkriptsiooniprogramm on pöörduv,[17] mis oleks aluseks LPM-ide funktsionaalsele plastilisusele, mis võimaldab LPM-id, et vajadusel lülituda homöostaatiliselt parandavatele või immuunkaitsefunktsioonidele.

Sellega seoses vähendasid alveolaarsesse ruumi üle kantud LPM-id GATA6 ja omandasid alveolaarsete makrofaagide transkriptsiooniprofiili.[27] Väideti, et retinoehapet, mis aktiveerib GATA6 LPM-ides, toodavad omentaal- ja kõhukelme stroomarakud.[19] Kooskõlas nende tähelepanekutega väideti, et Wilmsi kasvaja 1 (WT1) transkriptsioonifaktori ekspressioon mesoteliaalsete ja fibroblastiliste stroomarakkude poolt, mis juhivad kahe retinooli metabolismi kontrolliva kiirust piirava ensüümi, RALDH1 ja RALDH2 [32] ekspressiooni, kontrollige GATA6 ekspressiooni LPM-ides ja GATA6 pluss residentsetes makrofaagides, mis paiknevad pleura ja perikardi õõnsustes, kuna WT1 pluss rakkude ammendumine põhjustas nende makrofaagide alamhulkade põhjaliku vähenemise, paralleelselt samaaegse Raldh1 ja Raldh2 transkriptide vähenemisega[18]. toetades veelgi retinoehappe rolli GATA6 ekspressiooni säilitamisel, mida tuleb siiski ametlikult tõestada.

Asjaolu, et GATA{0}}puudulike hiirte puhul kogunesid CD11b pluss makrofaagid omentaalsetesse piimalaikudesse, samas kui LPM-id kõhukelmeõõnes vähenesid,[19] toetab hüpoteesi, et omentumi stroomarakkude poolt sekreteeritud retinoidhape säilitab GATA{ {3}}juhitud transkriptsiooniprogramm LPM-ides ja see tähendaks, et LPM-id tsirkuleerivad pidevalt läbi omentumi, kuid seda tuleb veel ametlikult tõestada.

Retinoehape on retinoid-X retseptorite (RXR) ligand, mis on ligandist sõltuvate transkriptsioonifaktorite tuumaretseptorite superperekonna liikmed, mis kontrollivad lipiidide ja glükoosi metabolismi ning mängivad võtmerolli põletikuliste ja autoimmuunsete häirete korral.[33] Huvitav on see, et hiirtel, kellel puudus RXR-id 𝛼 ja 𝛽, ilmnes vastsündinute LPM-i laienemises sügav defekt ja täiskasvanud LPM-ide elulemuse vähenemine lipiidide akumuleerumise tõttu, mille tulemuseks oli apoptoos, mis näitab, et RXR-id aitavad kaasa LPM-i laienemisele ja säilimisele.[34] ATAC-seq analüüsid näitasid, et Gata6 lookus näitas kromatiini kättesaadavust RXR-puudulikes LPM-ides, mis korreleerus madalama Gata6 geeniekspressiooniga, kinnitades, et RXR-id reguleerivad GATA6-sõltuvat LPM-i transkriptsiooniprogrammi.

Makrofaagide kolooniaid stimuleeriv faktor (M-CSF või CFS1) kontrollib pühendumist makrofaagide liinile ja seetõttu sõltub LPM-i diferentseerumine CFS1-st, nagu on näidatud osteopetroosiga (Csf1 op/op) hiirtel, kellel on Cfs1 geenis mutatsioon, mis põhjustab defektne LPM arendus.[35] Veelgi enam, in vitro analüüside põhjal teatati, et mesoteelirakud sekreteerivad CSF1, mis säilitas LPM-i proliferatsiooni mesoteelirakkude ja LPM-i kaaskultuurides; transwelli analüüsid näitasid, et LPM-i proliferatsioon vähenes oluliselt, kui mesoteliaalse ja LPM-i interaktsioonid olid ära hoitud, mis viitab sellele, et rakkudevaheline kontakt aitas kaasa LPM-i proliferatsioonile.[36] Arvamust, et LPM-i säilitamiseks on vaja mesoteliaalset CSF1-d, toetab ka hiljutine aruanne, mis näitab, et LPM-id olid hiirtel, kelle WT1 pluss rakkudes puudus CFS1.[37] Tuleb veel uurida, kas mesoteelirakkudest pärinev CSF1 aitab kaasa püsiva oleku LPM-i eneseuuendusele ja/või LPM-i proliferatsioonile põletiku ajal.

3. Suurte kõhukelme makrofaagide päritolu ja asendamine homöostaasis

LPM-id eristuvad embrüonaalse elu jooksul ja säilitavad end täiskasvanueas in situ eneseuuendamise teel. Püsiseisundis asendatakse embrüonaalsed LPM-id järk-järgult, kuid osaliselt alates embrüonaalse arengu hilises staadiumis residentsete luuüdi moLPM-idega, mis omandavad püsiva embrüonaalse LPM-i, kuid säilitavad mõned nende päritoluga seotud transkriptsioonilised ja funktsionaalsed omadused.[38,39] ] Embrüonaalsete LPM-ide päritolu on endiselt vastuoluline, kuna väidetavalt tulenevad need kas munakollase makrofaagide ja loote maksa monotsüütide kahekordsest panusest[40] või ainult loote maksa monotsüütidest.[41] LPM-ide päritolu ja asendamise integreeritud mudel on näidatud joonisel 2.

Dr. F. Ginhouxi labori andmetel on embrüonaalsete asendamist luuüdi monotsüütidest pärinevate kudedes elavate makrofaagidega stabiilses olekus kirjeldatud kõigi kudedes elavate makrofaagide populatsioonide puhul, välja arvatud mikrogliia, Langerhansi rakud ja Kupfferi rakud. , kasutades saatuse kaardistamise mudeleid, mis põhinevad Ms4a3 geeni ekspressioonil, mida ekspresseerivad spetsiifiliselt granulotsüütide-monotsüütide eellased.[42] Luuüdi monotsüütidest pärinevate makrofaagidega asendamise määr näib olevat põhiliselt tingitud nišile juurdepääsust ja kättesaadavusest.[43] Ühelgi kudedes elaval makrofaagipopulatsioonil ei esine täielikku asendust luuüdi monotsüütidest pärinevate makrofaagidega, mis viitab sellele, et igas organis saavutatakse tasakaal luuüdi monotsüütide värbamise ning embrüonaalsete ja luuüdi monotsüütidest pärinevate makrofaagide proliferatsiooni ja ellujäämise vahel. [42]

Seetõttu hoitakse täiskasvanuea jooksul püsivat LPM-i kogumit stabiilses olekus, kombineerides residentide embrüonaalsete LPM-ide iseeneslikku uuenemist ning residentide mollp-de diferentseerumist ja iseeneslikku uuenemist. Järelikult viitab selles käsikirjas termin LPM-id täiskasvanud LPM-i populatsioonile, mis püsiseisundis sisaldab embrüonaalseid LPM-e ja resident-moLPM-e, kui pole teisiti märgitud. Huvitav on see, et pärast seksuaalset küpsust on embrüonaalse LPM-i asendusmäär suurem meestel, kelle LPM-idel on suurem proliferatiivne aktiivsus, nagu näitasid dr F. Ginhoux' ja dr S. Jenkinsi laborites tehtud geneetilise saatuse kaardistamise analüüsid, et sellest hoolimata. teatasid asendusmäärade erinevustest.[39,42] Ginhoux ja kolleegid[42] leidsid, et 8 nädala ja 20 nädala vanuselt meestel on suurem osakaal mollp-idest (≈25 protsenti vs 10 protsenti ja ≈50 protsenti vs 25 protsenti). vastavalt).

Seevastu Jenkins ja tema kolleegid[39] teatasid, et ≈30 protsenti residentidest moLPM-idest tuvastati nii meestel kui ka naistel 4 nädala pärast, samas kui 16. nädalal oli isastel suurem osa residentidest moLPM-e (≈60 protsenti vs 30 protsenti). Seksuaalselt dimorfset asendamist residentsete moLPM-idega soovitati kontrollida muutustega kõhukelme mikrokeskkonnas, mis tekivad seksuaalse küpsemise ajal, sõltumata östrogeeni tasemest ja peritoneaalsest rasvumisest, [39] mis põhjustab LPM-i populatsiooni heterogeensuse erinevusi. LPM-i populatsiooni heterogeensuse sooga seotud lahknevused, samuti soolised erinevused kõhukelme mikrokeskkonnas määravad olulised transkriptsioonilised ja funktsionaalsed erinevused LPM-i populatsiooni vahel isastel ja emastel hiirtel, kuigi RNA-seq analüüsid üherakulisel tasemel näitasid. samaväärsed klastri identiteedid meeste ja naiste LPM-ides.

RNA-seq analyses, at the population level, of 10- to 12-week-old male and female mice LPMs indicated that 486 mRNA transcripts were differentially expressed (>1.{1}}kord) naiste ja meeste LPM-ide vahel. 148 mRNA transkripti, mis olid populatsiooni tasemel rohkem ekspresseeritud naiste LPM-ides, sisaldasid lipiidide omastamise ja transpordiga seotud geene, nagu Apoe, Apoc1, Saa2 ja Saa3, samuti immuunkaitsega seotud geene. Viimaste hulka kuulusid Timd4, Cxcl13, Tgfb2, komplemendi komponendi geenid C1qa, C3 ja C4b ning C-tüüpi lektiiniretseptori geenid Cd209a, Cd209b ja Clec4g. [39] Seevastu meestel olid LPM-ide poolt rohkem ekspresseeritud geenid seotud proliferatsiooni ja rakutsükliga seotud protsessidega, nagu Cdk1, E2f2 ja Mki67.

Huvitaval kombel olid emased hiired resistentsemad B-rühma streptokokkide[44] või Streptococcus pneumoniae nakkuse põhjustatud ägeda peritoniidi suhtes.[39] Kuna CD209 (SIGN-R1) on S. pneumoniae infektsiooniga nakatumise järgse ellujäämise seisukohalt ülioluline, soodustades tõhusat bakteriaalset fagotsütoosi ja kliirensit,[24] on väidetavalt tingitud soost sõltuv resistentsus bakteriaalse peritoniidi suhtes naiste LPM-ide suuremast ekspressioonist. CD209 ja lisaks komplemendi komponendid ja B1-rakke värbav kemokiin CXCL13.[39] Sellega seoses väideti, et naiste ja imikute suurem resistentsus vere kaudu levivate infektsioonide suhtes on korrelatsioonis looduslike antikehade suurenenud CXCL{12}}sõltuva tootmisega B1-rakkudes.

4. Põletiku põhjustatud suur kõhukelme makrofaagide asendus

Steriilse põletikulise stiimuli, [5,39,42,45,46] kõhuoperatsiooni[39] või bakteriaalse infektsiooni[47] põhjustatud põletikulised reaktsioonid kõhukelmes põhjustasid LPM-i rakusurma, mille tulemusel väheneb rakkude arv. residendist LPM-id (sealhulgas residendist embrüonaalsed LPM-id ja residendist moLPM-id), mille ulatus on korrelatsioonis põletiku raskusastmega.[42,46] Algse LPM-i kogumi taastumine toimub allesjäänud püsivate LPM-ide [45] proliferatsiooni ja põletikuliste LPM-ide asendamise teel. monotsüüdid (edaspidi ii-moLPM-id põletikust põhjustatud moLPM-ide jaoks), nagu on näidatud erinevate eksperimentaalsete strateegiate abil, mis põhinevad saatuse kaardistamise mudelitel, [42] koekaitsega luuüdi kimäärsetel hiirtel ja adoptiivsetel ülekandekatsetel.[39,46]

Kasutades eksperimentaalset mudelit, mis põhineb väikeses annuses sümosaani (10 ug hiire kohta) põhjustatud kerge põletiku esilekutsumisel või suures annuses (1000 ug hiire kohta) põhjustatud raskel põletikul, ja adoptiivseid ülekandekatseid ii-moLPM-ide jälgimiseks. ja hinnata, kuidas põletikuline keskkond kontrollib nende diferentseerumist, tegi Jenkins ja tema kolleegid ettepaneku, et residentide LPM-ide asendamise määr ii-moLPM-idega ning selle, mil määral hiljem omandavad residendist LPM-ide identiteedi ja funktsiooni, määrab põletiku raskusaste. protsess ja LPM-i surma suurus[46] (joonis 2).

ii-moLPM-id, mis tekkisid pärast kerget põletikku, eksisteerisid pikaajaliselt koos allesjäänud residendist LPM-idega, kuid konkurents püsivate LPM-idega ja muutused peritoneaalses keskkonnas säilitasid need ebanormaalses aktivatsiooniseisundis ja blokeerisid püsiva LPM-i fenotüübi omandamise. Seevastu tõsine põletik võib viia residentsete LPM-ide täieliku ablatsioonini, mis lõpuks asendatakse ii-moLPM-idega, mis omandasid püsiva LPM-i identiteedi, kuid säilitasid transkriptsiooniliselt ja funktsionaalselt lahknevad tunnused, mis on määratud nende päritolu, kõhukelme põletiku ja tekkeaja järgi. -residentsus.[46] Pakuti, et ii-moLPM-ide fenotüüp hõlmaks nende päritolu järgi määratud sisemisi markereid, nagu CD62L ja Semaphorin 4a, markereid, mille ekspressiooni kontrollib konkurents kohalike LPM-idega, kuid mis on aja jooksul ümber programmeeritud, nagu GATA6, MHCII ja CCR5, ja elukoha ajaga seotud markerid, mis ei sõltu konkurentsist residentide LPM-idega, nagu Tim4, CD209b ja VSIG4. Märkimisväärset osa geenidest, mida ekspresseerivad erinevalt residentide LPM-id ja ii-moLPM-id, näivad kontrollivat erinevused retinoehappe signaaliülekandes, kas otseselt või GATA{18}}sõltuval viisil.[46]

ii-moLPM-idel on suurem proliferatiivne aktiivsus kui resident-LPM-idel,[38,46] mis väidetavalt korreleerub erinevustega esimeste suurenenud proliferatsioonivõimes vastusena mesoteelirakkude poolt toodetud CSF1-le.[36] Lisaks näitasid ii-moLPM-id madalamat võimet fagotsüteerida baktereid ja omastada surevaid rakke ning ei suutnud toota CXCL13.[46] Kuigi peritoneaalsete B1-rakkude arv suureneb koos vanusega homöostaasis, põhjustas kõhukelme põletik B1-rakkude puuduliku kuhjumise[46], kuna nagu eespool märgitud, kontrollib LPM-ide CXCL13 tootmine B1-rakkude liikumist kõhuõõnde.[48] Seetõttu on tõsiasjal, et LPM-i populatsiooni arenguline ja funktsionaalne heterogeensus sõltub soost ja vanusest, oluline mõju, kui käsitletakse LPM-de rolli parandamisel, kaitsel ja mõju kõhukelme kasvaja metastaasidele, mida tuleb tulevastes uuringutes arvesse võtta.

Oluline on märkida, et mitteinfektsioosse kõhukelme kahjustuse, infektsiooni või metastaatilise kasvaja kasvuga seotud põletikuliste reaktsioonide käigus kõhuõõnde värvatud monotsüüdid võivad potentsiaalselt diferentseeruda monotsüütidest pärinevateks rakkudeks, mis täidavad spetsiifilisi parandus-, kaitse- või kasvajat soodustavaid funktsioone. kuid ei pruugi omandada fenotüüpseid või funktsionaalseid LPM-i omadusi ja seetõttu ei tohiks neid pidada ii-moLPM-ideks. Põletikulisele kõhukelmele värvatud monotsüütidest eristatud rakkude identiteedi määratlemine võib aga olla vastuoluline, kuna enamikus aruannetes keskendutakse kõhukelme monotsüütidest pärinevate rakkude funktsionaalsele olulisusele, püsivuse ajale ja/või nende poolt LPM-ide omaduste omandamisele. monotsüütidest pärinevaid rakke ei käsitletud ja vastupidi, aruannetes residentide LPM-i asendamise kohta põletiku ajal, ei uuritud ii-moLPM-ide funktsiooni põhjalikult.

Kooskõlas hüpoteesiga, et konkurents konkreetse füüsilise niši pärast, mis on määratletud rakuliste ja molekulaarsete mikrokeskkonnateguritega, määrab monotsüütide panuse kudedes elavatesse makrofaagidesse,[43] pakuti välja biokeemilise niši olemasolu peritoneaalsete makrofaagide jaoks.[46] ] Sellest lähtuvalt kontrolliks konkurents signaalide ja rakkudevaheliste interaktsioonide pärast, mis kontrollivad LPM-ide ellujäämist, proliferatsiooni ja funktsiooni, tasakaalu residentide LPM-ide ja ii-moLPM-ide vahel, samuti küpse resident LPM-i identiteedi omandamist iimoLPM-ide poolt.

5. Suurte kõhukelme makrofaagide roll peritoneaalses homöostaasis

LPM-id täidavad olulist rolli apoptootiliste rakkude kliirensis püsiseisundis, mis on kudedes elavate makrofaagide tunnus, mis on ülioluline enesetaluvuse säilitamiseks, [49] spetsiifiliste püüduriretseptorite, sealhulgas CD36, CD93, CD163 Tim4 ekspressiooni kaudu. ja MerTK.[16,20–22] Huvitaval kombel pakuti välja, et apoptootiliste rakkude tõhus internaliseerimine LPM-ide poolt tugineks apoptootiliste rakkude poolt eksponeeritud fosfatidüülseriini esialgsele seondumisele Tim4-ga, millele järgnes MerTK-vahendatud neelamine.[20] LPM-id programmeerib kõhukelme mikrokeskkond tõhusalt eemaldama apoptootilisi rakke, vältides TLR-vahendatud põletikku, mida vahendab isetuletatud nukleiinhapete äratundmine, säilitades samal ajal võime reageerida infektsioonidele.[25]

Väideti, et Kruppeli-sarnased tegurid 2 ja 4 juhivad LPM-i programmeerimist apoptootiliste rakkude immunoloogiliselt vaikseks puhastamiseks, kontrollides apoptootiliste rakutuvastusretseptori geenide, nagu Timd4, Marco ja Olr1, ekspressiooni ning negatiivsete regulaatoritena toimivate geenide ekspressiooni. TLR-i signaalimine, nagu Hes1, Socs3, Pdlim2, Ptpn6 ja Tnfaip3, mille tulemuseks on suurenenud aktiveerimislävi.[25] Kooskõlas nende tähelepanekutega ekspresseerivad LPM-id VSIG4, B7 perekonnaga seotud retseptorit, mis väidetavalt vähendab PDK{14}}vahendatud mitokondriaalse püruvaadi oksüdatsiooni ja ROS-i tootmise ümberprogrammeerimise kaudu makrofaagide aktivatsiooni.[23]

LPM-id mängivad peritoneaalsete B1-rakkude homöostaasi säilitamisel keskset rolli. Tõepoolest, peritoneaalsed B1-rakud, mis toodavad konstitutiivselt looduslikku IgM-i, pakkudes kohalikku esimest kaitseliini paljude patogeenide vastu,[12] sõltuvad kemokiinist CXCL13, mida toodavad LPM-id ja stroomarakud, et neid vereringest värbada ja omada. kõhuõõnde; CXCL13 on vajalik ka B1-rakkude omentumile suunamiseks.[48] Lisaks eritavad kõhukelme B1-rakud pärast püsiseisundi migratsiooni soolestiku lamina propriale IgA looduslikke antikehi, mis tagavad soolestiku mikrobiota immuunkontrolli.[12] Huvitav on see, et IgA klassi vahetamist peritoneaalsetes B1-rakkudes ja järelikult ka B1-rakkude poolt vahendatud soole IgA sekretsiooni kontrollib retinoehappe/GATA{13}}sõltuv TGF-𝛽 tootmine LPM-ide poolt.[19] Kooskõlas selle tähelepanekuga avaldavad retinoehape ja TGF-𝛽 sünergistlikku toimet kõhukelme B1-rakkude IgA klassi vahetusele in vitro.[50]

Kõhukelme homöostaasiga seotud LPM-ide täiendav funktsioon on steriilse kõhukelme vigastuse jälgimine, mis, kui seda kiiresti ei parandata, võib põhjustada kõhukelme adhesioonide moodustumist, mis võib muutuda raskeks kõhukelmehaiguseks, sealhulgas soole oklusiooniks ja naiste viljatuseks. 10] Kõhukelme kahjustuse või infektsiooni tuvastamise jälgimist teostavad peamiselt LPM-id ja see nõuab kõhukelme pinna aktiivset patrullimist. Sellega seoses näidati hiljutises aruandes, kus kõhukelme õõnsuse kuvamine läbi terve kõhuseina viidi läbi intravitaalse mikroskoopia abil, näidati, et LPM-id liiguvad stabiilses olekus passiivselt hingamisest sõltuval ja juhuslikul viisil kiirusega. kuni 800 μm s-1. [4] LPM-ide rolli kõhukelme kudede paranemisel ja adhesiooni moodustumisel käsitletakse järgmises osas.

6. Suurte kõhukelme makrofaagide roll kõhukelme vigastuste parandamisel

Kõhuõõne või vistseraalse kõhukelme kahjustused võivad olla põhjustatud juhuslikust traumast või kõhuõõneoperatsioonist tekkinud steriilsest vigastusest või kõhukelme patoloogiatest, nagu infektsioon, maksa- või soolehaigused või kasvaja metastaatiline kasv. Hiljutised uuringud, mida käsitletakse allpool, on toonud valgust kõhukelme steriilsete vigastuste parandamisega seotud mehhanismidele ja LPM-ide rollile selles protsessis.[10] Seevastu tuleb põhjalikult uurida, kuidas peritoneaalse infektsiooni või kasvaja metastaaside poolt kahjustatud kõhukelme hiljem taastatakse.

Kõhukelme limaskesta kahjustuste tuvastamine saavutatakse ohuga seotud molekulaarsete mustrite (DAMP) äratundmise kaudu, mida vabastavad kahjustatud rakud, sealhulgas mesoteelirakud, submesoteliaalses sidekoes asuvad rakud ja potentsiaalselt need, mis moodustavad aluskudesid. DAMP-de hulka kuuluvad konstitutiivselt ekspresseeritud DAMP-d, nagu tuuma- ja mitokondriaalne DNA, tuuma- ja mitokondriaalsed valgud (HMGB1, histoonid, tsütokroom c), ATP, K pluss ioonid või S100 kaltsiumi siduvad valgud, indutseeritavad DAMP-d, nagu kuumašoki valgud, defensiinid , galektiinid ja IL{5}}𝛼 ning rakuvälised DAMP-d, nagu hüaluronaan või heparaansulfaat.[51] DAMP-aktiveeritud mesoteelirakud vallandavad peritoneaalse põletiku põletikueelsete tsütokiinide ja kemokiinide vabastamise kaudu, mis soodustavad leukotsüütide värbamist kahjustatud piirkondadesse ja komplemendi aktivatsiooni, mille tulemuseks on täiendav põletik. See põletikuline reaktsioon käivitab koefaktorist sõltuva fibriini polümerisatsiooni fibrinogeneesi ja fibrinolüüsi vahelise tasakaalustamatuse tulemusena, mis viib fibriini maatriksi moodustumiseni, mis toimib haava parandamise karkassina.

Viimane hõlmab parandusfunktsiooni täitvate leukotsüütide, sealhulgas LPM-ide, neutrofiilide, monotsüütide ja monotsüütidest pärinevate makrofaagide värbamist submesoteliaalsesse sektsiooni, mesenhümaalsete prekursorite värbamist, rakuvälise maatriksi ladestumist, närvide ja veresoonte sissekasvamist ja taastamist. kahjustatud kõhukelme kohta.[10] Kõhukelmepõletiku püsimine võib põhjustada liigset fibriini ladestumist ja lõppkokkuvõttes kiuliste sildade moodustumist vastastikku paiknevate kõhukelmepindade vahel, mis sisaldavad närve ja veresooni, mida nimetatakse abdominaalseteks adhesioonideks.[52] Adhesioonid tulenevad valdavalt kõhuõõneoperatsioonist, kuid need võivad olla põhjustatud ka infektsioonist, endometrioosist, kiiritusravist või peritoneaaldialüüsist ning on seotud märkimisväärse haigestumusega, mis võib hõlmata eluohtlikke tüsistusi.[52]

Kõhukelme paranemise elektronmikroskoopia analüüs pärast eksperimentaalset kirurgilist vigastust, mis näitas, et makrofaagid kleepusid kahjustatud koele 24 tundi pärast vigastuse tekitamist ja migreerusid seejärel haavasse,[53] andis esimesed tõendid makrofaagide võimaliku rolli kohta kõhukelmes. vigastuste parandamine. Seda hüpoteesi toetasid ka dr P. Kubesi laboris läbi viidud intravitaalsed mikroskoopiauuringud, mis näitasid, et pärast maksakapsli laseriga indutseeritud vigastust värvati kahjustatud piirkondadesse F4/80high GATA6 pluss LPM-id, mis migreerusid läbi mesoteeli maksakahjustused 1 tunni jooksul pärast laseriga indutseeritud vigastust.[30]

LPM-id tuvastasid kahjustatud koe maksa nekrootiliste rakkude poolt DAMP-retseptori PX27 kaudu vabastatud ATP äratundmise kaudu ja infiltreerusid maksa parenhüümi CD44- kaudu, vahendades kahjustatud piirkondades esineva hüaluronaani seondumist. Huvitav on see, et vigastatud koesse värbamine vallandas LPM-i proliferatsiooni ja molekulide ülesreguleerimise, mis olid seotud alternatiivse aktiveeritud / parandatud fenotüübiga, nagu CD206, CD273 ja arginaas 1. Sellest tulenevalt aitasid värvatud LPM-id aktiivselt kaasa nekrootiliste rakkude eemaldamisele, mis väidetavalt oli kriitiline. revaskularisatsiooni ja kudede parandamise jaoks, mida toetavad katsed, mis näitasid, et vigastatud piirkondade paranemine viibis klodronaadiga laetud liposoomide vahendatud LPM-i ammendunud või GATA{8}}puudulikel hiirtel.[30]

Sarnast ATP-indutseeritud värbamist ja CD{1}}sõltuvat migratsiooni F4/80 kõrge GATA6 pluss LPM-de kahjustatud piirkonda kirjeldati soolestiku termilise vigastuse mudelis.[54] Klodronaadiga laetud liposoomide vahendatud LPM-i kahanemise katsed toetasid ka kontseptsiooni, et LPM-id aitasid selles katsekeskkonnas kaasa vigastatud soole paranemisele. Kas aga, nagu käesolevas aruandes kirjeldatud, LPM-id värvatakse pärast sooleepiteeli kahjustamist soole seroosse, oleks vaja täiendavat uurimist, kuna on võimalik, et see nähtus oli artefaktiline, kui nendes katsetes ei piirdunud kahjustus ainult soolestiku luminaalset pinda, kuid mõjutas soole limaskesta ja submukoosset, võttes arvesse selles uuringus selle probleemi lahendamiseks kasutatud eksperimentaalset strateegiat.

Teisest küljest, mis puudutab LPM-i ammendumise katseid klodronaadiga koormatud liposoomidega töötlemisel, mis viidi läbi selleks, et käsitleda LPM-de rolli maksa või soolestiku serooside paranemises, [30, 54], kas klodronaadiga ravitud hiirtel täheldati haavade hilinenud paranemist. ei saa välistada vähemalt osaliselt kõhukelme monotsüütidest pärinevate makrofaagide ja kudedes elavate makrofaagipopulatsioonide ammendumist omentumis, peritoneaalmembraanis või maksakapslis. Tõepoolest, on tõestatud, et monotsüüdid värvatakse peritoneaalsetesse vigastatud piirkondadesse, kus nad eristuvad monotsüütidest pärinevateks makrofaagideks, mis võivad soodustada kudede paranemist.[55]

Kooskõlas nende tähelepanekutega on hiljutises aruandes kahtluse alla seatud kontseptsioon, et pärast LPM-ide kinnitumist kahjustatud mesoteeli külge, migreeruvad nad seroosvigastustesse ja täidavad kriitilist parandusfunktsiooni. [56] Need uuringud näitasid, et GATA6 pluss LPM-id kogunesid maksa vigastatud pinnale, kuid tungisid minimaalselt nekrootilist maksa parenhüümi. Veelgi enam, kasutades difteeriatoksiinist sõltuvat G6Mø-CreER-i; R26-tdTomato/iDTR hiireliin, mis võimaldas enamiku GATA6 pluss resident LPM-ide geneetilist ablatsiooni, jõudsid autorid järeldusele, et GATA6 pluss resident LPM-ide puudumine ei mõjutanud oluliselt maksa haavade paranemist ja seega GATA6 pluss resident LPM-id ei olnud kahjustatud serooskoe regenereerimise jaoks kriitilised. Seetõttu tuleb läbi viia täiendavad uuringud, et teha kindlaks, kas ja lõpuks kuidas LPM-id aitavad kaasa kõhukelme paranemisele.

Huvitav on see, et hiljutine dr P. Kubesi labori aruanne, mis põhineb kõhukelmeõõne kujutisel pärast laser-indutseeritud fokaalset termilist peritoneaalset vigastust intravitaalse mikroskoopia abil läbi terve kõhuseina, toetab LPM-ide otsest rolli seroosi paranemisel. [4] Tõepoolest, residendid GATA6 pluss LPM-id olid esimesed rakud, mis värvati mesoteliaalsete vigastuste korral - protsess, mis nõudis peritoneaalse vedeliku nihkevoolu. Värbatud LPM-id kinnituvad kahjustatud kõhukelmele ja katsid kahjustused täielikult 15 minutit pärast vigastuse tekitamist, moodustades trombitaolisi struktuure protsessis, mis peegeldas trombotsüütide agregatsiooni vastusena veresoonte vigastusele. LPM-i agregatsioon ei sõltunud kanoonilistest adhesioonimolekulidest ega fibriini polümerisatsioonist, vaid püüdurretseptoritest, mis sisaldavad püüduriretseptori tsüsteiinirikkaid (SRCR) domeene, nagu MARCO või MSR1, mis seonduvad suure hulga polüanioonsete liganditega ja on kogu evolutsiooni vältel väga konserveerunud. selgrootutelt. Tõepoolest, okasnahksete (nt merisiiliku) puhul põhjustas tsöeloomiõõne vigastus SRCR-i sisaldavaid homolooge ekspresseerivate tsölomotsüütide agregatsiooni, mis pitseerisid kahjustatud alad.[57,58] Väideti, et LPM-id aitavad kaasa fookuskauguse paranemisele. kõhukelme kahjustused, saavutades kõhukelme vigastuste füüsilise tihendamise, kuna makrofaagide agregatsiooni blokeerimine viis vigastatud parietaalse kõhukelme paranemise edasilükkamiseni.[4]

Seevastu kirurgilisest steriilsest vigastusest põhjustatud peritoneaalse adhesiooni moodustumise eksperimentaalset mudelit kasutades, mis hõlmas kõhukelme nööbi moodustumist kõhukelme seina osa õmblemisega, ilmnes, et 3 tunni jooksul pärast operatsiooni värvati nuppudele suur arv LPM-e. [4] Selles iatrogeenses keskkonnas moodustasid makrofaagid ulatuslikud agregaadid, mis soodustasid fibriini ladestumist ja armkoe kasvu, mis viis peritoneaalsete adhesioonide tekkeni 7 päeva jooksul pärast operatsiooni.

Huvitaval kombel vähenes peritoneaalsete adhesioonide arv ja areng märkimisväärselt hiirtel, kelle LPM-id kahanesid 24 tundi enne operatsiooni, kinnitades, et LPM-id aitasid kaasa peritoneaalse adhesiooni moodustumisele. Huvitav on see, et kasutades sarnast eksperimentaalse adhesiooni moodustumise mudelit, näidati, et LPM-id moodustavad kahjustatud mesoteliaalsetes piirkondades moodustunud fibriinihüüvete kohal rakubarjääri, mis viib adhesiooni moodustumiseni, kui makrofaagibarjäärist ei piisa fibriini trombi katmiseks, kuid välistas adhesiooni moodustumise, kui makrofaagide barjäär varjas täielikult fibriini trombe.[59] Tõepoolest, IL-4-vahendatud makrofaagibarjääri tugevdamine takistas adhesiooni teket ja võib olla aluseks operatsioonijärgsete adhesioonide vältimiseks uuenduslike ravimeetodite väljatöötamisele. Seetõttu, kuigi näib, et seroosse õigeks paranemiseks on vajalik esialgne makrofaagide värbamine ja agregatsioon koos fibriini ladestumisega, võib see põhjustada ka patogeenset armistumist, mis põhjustab adhesiooni moodustumist – olukorda, mida on seostatud madala mesoteliaalse fibrinolüütilise aktiivsusega.[52] ]

Kokkuvõtteks võib öelda, et LPM-ide roll steriilse peritoneaalse kahjustuse parandamisel on suurel määral tingitud vigastuse raskusest. LPM-id soodustavad adhesiooni moodustumist pärast suurt kõhukelme vigastust, kuid täidavad olulist funktsiooni fokaalsete mesoteliaalsete vigastuste kiireks parandamiseks, meenutades kogu evolutsiooni vältel säilinud primitiivseid parandusmehhanisme (joonis 3). Teisest küljest on LPM-ide potentsiaal tungida sügavale kahjustatud submesoteliaalsesse koesse ja aidata kaasa selle taastamisele koos monotsüütidest pärinevate makrofaagide ja neutrofiilidega, mis on endiselt vastuoluline ja seetõttu tuleb seda täiendavalt uurida. Sellega seoses tuleb veel uurida, kas LPM-id toodavad, nagu on kirjeldatud teiste makrofaagide populatsioonide puhul, sügavaid tervendavaid vahendajaid, nagu trombotsüütidest pärinev kasvufaktor, insuliinitaoline kasvufaktor 1, TGF-𝛽1 või VEGF-𝛼, [60]. .

For more information:1950477648nn@gmail.com