Mitokondriaalsed valgud paljastavad mehhanismi, mille abil füüsiline harjutus parandab mälu, õppimist ja motoorset aktiivsust hüpoksilise isheemilise entsefalopaatia roti mudeli 3. osa

4. Materjalid ja meetodid

4.1. Loomad ja katserühmad

Selles uuringus kasutati 36 Sprague-Dawley rotti. Loomi hoiti temperatuuril 22 ± 1 °C 12-tunniste valguse/pimeduse tsüklitega ning neil oli vaba juurdepääs toidule ja veele. Katseprotseduurid viidi läbi Zhengzhou ülikooli loomahoolduse ja -uuringute institutsionaalse eetikakomitee heakskiidul.

Pime tsükkel viitab perioodile, mil inimesed öösel magavad, ja see on tihedalt seotud mäluga. Enamiku inimeste jaoks parandab hea uni füüsilist tervist ja ajutegevust. Samas on uni seotud ka aju mäluprotsessiga.

Kui me magame, sisenevad meie kehad erinevatesse unefaasidesse, sealhulgas kiire silmade liikumise (REM) uni ja mittekiire silmade liikumise (NREM) uni. Need etapid mängivad olulist rolli aju teabe integreerimise ja mälu konsolideerimise reguleerimisel.

Enamik inimesi kogeb une positiivset mõju keskendumisvõimele ja mälule. Uuringud näitavad, et uni võib aidata meil mälestusi kinnistada ja tugevdada ning isegi parandada õppimisvõimet. Une ajal integreerib aju uut teavet olemasolevate teadmistega, suurendades seeläbi mälu salvestamise ja kasutamise võimet.

Vastupidi, piisava une puudumine võib põhjustada mälukaotust ja õppimisraskusi. Pikaajaline unetus võib põhjustada mitmesuguseid probleeme kehas ja ajus, mõjutades igapäevaelu ja töövõimet. Seetõttu on õige unestrateegia ja mõistlik eluviis hea mälu säilitamiseks üliolulised.

Üldiselt on tumedate tsüklite ja mälu vahel seos. Piisav uni võib soodustada ajuinfo integreerimist ja mälu konsolideerimist, samas kui pikaajalised unehäired võivad mõjutada ajufunktsiooni ja mälu. Seetõttu peaksime oma igapäevaelus tähelepanu pöörama une kvaliteedile ja hoidma tervislikku eluviisi, et tõhusalt toetada ja parandada oma mälu ja õppimisvõimet. On näha, et meil on vaja mälu parandada ja Cistanche deserticola võib oluliselt parandada mälu, sest Cistanche deserticola suudab reguleerida ka neurotransmitterite tasakaalu, näiteks tõsta atsetüülkoliini ja kasvufaktorite taset. Need ained on mälu ja õppimise jaoks väga olulised. Lisaks võib Cistanche deserticola parandada ka verevoolu ja soodustada hapniku kohaletoimetamist, mis tagab aju piisava toitainete ja energia kättesaamise, parandades seeläbi aju elujõudu ja vastupidavust.

Klõpsake nuppu Tea 10 viisi mälu parandamiseks

Tehti kõik endast oleneva, et vähendada loomade arvu ja minimeerida loomade kannatusi katsete ajal. Loomad jagati juhuslikult nelja rühma (joonis 8). (1) HIE, NT (hüpoksia-isheemia-entsefalopaatia rühm ilma treeningutreeninguta) koosnes loomadest, keda modelleeriti hüpoksilis-isheemilise entsefalopaatia suhtes 7. sünnijärgsel päeval, anesteseerides poegi isofluraaniga (5% induktsioon, 1,5% hooldus).

Vasak ühine unearter ligeeriti seejärel püsivalt ja pojad pandi 30 minutiks soojale diivanile, enne kui nad viidi hüpoksikambrisse, kus voolas pidevalt 90 minutiks 92% N2 ja 8% O2 sisaldav hüpoksiline gaasisegu. naasid kuni 10. nädalani puuridesse ilma ujumistreeningut tegemata. (2) HIE, T (hüpoksia-isheemia entsefalopaatia rühm koos treeningtreeninguga) koosnes loomadest, keda modelleeriti hüpoksilis-isheemilise entsefalopaatia jaoks nagu punktis 1 ja kes viidi tagasi puuridesse kuni 6. elunädalani ja seejärel allutati 90-minutisele ujumistreeningud iga päev viis päeva koos 2 puhkepäevaga nädalas 4 nädala jooksul, (3) SHAM, NT (kontrollrühm) hõlmas loomi, keda ei ravitud, kuid kes elasid puurides normaalset elu 1. postnataalsest päevast kuni 10. nädalani ilma treeningtreeningud ja (4) SHAM, T koosnes loomadest, keda ei ravitud, kuid nad elasid puurides normaalset elu sünnijärgsest päevast 1 kuni 6 nädalani, pärast mida tehti neile 4 nädala jooksul ujumistrenni.

Seejärel koguti erinevate rühmade loomade ajud ja valmistati ette Western blotting (hipokampus ja ajukoor) ja immunofluorestsents (motoorne ajukoor).

4.2. Harjutuse paradigma

Loomi hoiti ad libitum toidu ja veega ning neid hoiti 12-valguse/pimeduse tsüklis. Nad jagati kahte rühma: istuvad loomad (HIE, NT ja SHAM, NT) ja treenivad loomad (HIE, T ja SHAM, T). Treenivatele loomadele tehti pärast 6. sünnitusjärgset nädalat 4 nädala jooksul ujumistreeningut; nad ujusid 5 päeva nädalas koos 2 puhkepäevaga. Iga ujumine kestis 90 minutit. Bassein täideti 50 cm sügavuselt, et vältida loomade puudutamist paagi põhjaga.

Loomadel lasti vabalt ujuda ilma lisakoormuseta ja neid stimuleeriti ujumise ajal õrnalt. Pärast treeningut kuivatati rotid hoolikalt ja viidi tagasi puuridesse.

4.3. Vertica! Pooluse mootori test

Iga rühma loomad asetati ükshaaval näoga ülespoole riidest teibiga kaetud vardale (läbimõõt 3,{3}} cm ja pikkus 150 cm), mida hoiti horisontaalasendis, seejärel tõsteti järk-järgult vertikaalses asendis ja aeg, mil rott matil viibis, registreeriti maksimaalselt 2 minutit (120 s). Selles testis kukub loom, kellel on puudulik motoorne koordinatsioon ja tasakaal.

4.4. Morrise veelabürindi test (MWM)

Rottidele (10 nädala vanused) tehti MWM pärast 4-nädalast treeningprotokolli (SHAM, 'T ja HlE, T). Kõik veelabürindi andmed salvestati Panjab SMART videojälgimissüsteemi abil (Panlab Howo Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd.) (Shanghai, Hiina). MWM-i kasutati nii, nagu on kirjeldatud l32]. Lühidalt öeldes kasutasid rotid basseini piiridele asetatud visuaalseid näpunäiteid, et jõuda peidetud platvormile ja põgeneda veest. Õppimist hinnati 7 päeva jooksul. Enne õppimise hindamist viidi rotid basseini, mis sisaldas selget vett ja nähtavat platvormi. Treeningu käigus tehti rottidele ülesandega tutvumiseks prooviujumise harjutusi.

Õppefaasis määriti rotte video jälgimise hõlbustamiseks musta värviga ja platvorm sukeldati. Iga rotiga tehti neli katset erinevatest lähtepunktidest (kvadrantidest). Panlab SMART Video Tracking System salvestas iga päev latentsust või platvormile jõudmiseks kuluvat aega. Katse viimasel päeval platvorm eemaldati ja iga rott viidi uuesti vette nii palju kordi, kui loomad ületasid peidetud platvormi ala kvadrandis, mis varem sisaldas platvormi (sihtkvadrant).

4.5. Western Blotting

Valgutaseme katse jaoks valiti igast rühmast juhuslikult kuus rotti. Valgud ekstraheeriti hipokampusest ja ajukoorest ning homogeniseeriti RIPA reagendis (CW2333S, CoWin Biosciences, Cambridge, MA, USA) ning eraldati tsütoplasmaatilisteks ja tuumavalkudeks. Valgu kontsentratsioonid määrati bitsinhoniinhappe analüüsi (BCA) abil (CW0014S, CoWin Biosciences, Cambridge, MA, USA) ja universaalsetel SDS-PAGE geelidel (CFAS AnyKD PAGE) # PE008 eraldati elektroforeesiga kokku 20 g valku. Zhonghui Hecai Bio-pharmaceutical Technology Co., Ltd., Shaanxi, Hiina.

Seejärel kanti valgud polüvinülideenfluoriidmembraanidele (PVDF) (R1CB12934, Merck Millipore Ltd., (Burlington, MA, USA) Membraanid blokeeriti 2 tunniks 5% veise seerumi albumiiniga (BSA) (#A8020, Solarbio Life Sciences). , Peking, Hiina) toatemperatuuril ja inkubeeritud järgmiste primaarsete antikehadega Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA): AIF (D39D2, 1:1000), tsütokroom C (136F3, 1:1000), lõhustatud kaspaas{{ 13}} (Asp175, 1:1000), Smac/Diablo (D553R, 1:1000) ja OPA1 (D7C1A, 1:1000).

GAPDH ettevõttest Servicebio, Wuhan, Hiina (GB11002, 1:2000) ja H3 firmast Proteintech (17168-1-AP, 1:1000) temperatuuril 4 ◦C üleöö, millele järgneb HRP-konjugeeritud sekundaarne antikeha SA00001-2 firmalt Proteintect (1:5000) inkubeerimine 2 tundi toatemperatuuril. Valguribad visualiseeriti täiustatud kemoluminestsentskomplektiga #KF005 firmalt Affinity Biosciences ja pildistati Bio-Image Analysis süsteemiga (Zhengzhou ülikool, Zhengzhou, Hiina). Valguribade intensiivsuse suhted GAPDH-sse (tsütoplasmaatilised valgud) ja H3-sse (tuumavalgud) kui sisemised võrdlusalused määrati ImageJ abil.

4.6. Immunofluorestsents

Ajukoe {{0}} µm koronaalsed viilud saadi, kasutades immunofluorestsentsi jaoks külmutusmikrotoomi (Leica, Saksamaa). Slaidid blokeeriti 2 tundi PBS-iga, mis sisaldas 10% veiseloote seerumit (#A8020, Solarbio Life Sciences, Peking, Hiina) ja 0,3% Triton ×-100, Amresco 0694, Biosharp, Eesti toatemperatuuril ja seejärel inkubeeritud primaarsete antikehadega Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA): anti-AIF, D39D2 (lahjendus 1:400), anti-tsütokroom C, 136F3 (lahjendus 1:200), lõhustatud kaspaas-3 , Asp175 (lahjendus 1:400), anti-Smac/Diablo, D553R (lahjendus 1:200) ja anti-OPA1, D7C1A (lahjendus 1:400) üleöö temperatuuril 4 °C.

Seejärel pesti slaide kolm korda, iga kord 10 minutit PBS-is ja inkubeeriti seejärel sekundaarsete antikehadega (ab150077 firmalt Abcam, Cambridge Biomedical Campus, Cambridge, UK) 2 tundi toatemperatuuril pimedas. DAPI, #C0065 ettevõttelt Solarbio Life Sciences, Peking, Hiina (1:100 PBS) lisati 5 minutiks ja valati ära, pesti PBS-is 3 korda, iga kord 5 minutit, kuivatati, lisati kustutusvastane aine (#P0126, Beyotime Biotechnology, Shanghai, Hiina), klaas slaidid kinnitati objektiklaasidele ja proove hoiti 2 tundi temperatuuril –20 ◦C ja tehti mikroskoopiliseks pildistamiseks. Kujutised tehti konfokaalse fluorestsentsmikroskoobiga (Ni-U942877, Nikon, Tokyo, Jaapan) ja kujutised Motoorse ajukoore valgud kvantifitseeriti seejärel FIJI-ImageJ abil, nagu on kirjeldatud punktis [33].

4.7. Statistiline analüüs

Kõigi analüüside jaoks kasutati GraphPad Prismi versiooni 8.0.0 Windowsile (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). Statistilise olulisuse mõõtmiseks kasutati ühesuunalist ANOVA-d, millele järgnesid vastavalt Dunnetti post hoc testid. Tulemused on esitatud kui keskmine ± SEM ja p < 0,05 loeti statistiliselt oluliseks.

5. Kokkuvõtted

See uuring näitab, et ujumisharjutused parandasid HIE-ga seotud motoorset aktiivsust, mälu ja õppimist, pärssides mitokondriaalset apoptoosi Cyto.C/lõhustatud kaspaasi{0}} ja AIF-i signaaliradade kaudu. Lisaks on näidatud, et ujumistreeningu sekkumine stabiliseerib mitokondriaalseid kristlasi ja membraanipotentsiaali, mida kujutab Smac/Diablo ja OPA1 ümberpööramine HIE-ga rottidel. Selle tulemusena on see atraktiivne ja elujõuline alus täiendavatele uuringutele, et dešifreerida rohkem molekulaarseid teid, mida saaks manipuleerida, et tõhusalt hallata HIE-d ja sellest tulenevaid puudujääke. Kuigi see uuring näitas edukalt treeningu rolli mitokondrite põhjustatud struktuursete ja funktsionaalsete puudujääkide ümberpööramisel. HIE poolt ei ammendanud see kõiki võimalikke meetodeid mitokondriaalsete kristade stabiliseerumise kindlakstegemiseks; see on selle teema tulevaste uuringute jaoks kriitiline.

Autori kaastööd: Conceptualization, FG, FP, YW ja CC; andmete kureerimine, FG, FP, YW, HL ja JF; formaalne analüüs, FG, HL ja CC; rahastamise omandamine, CC; uurimine, FG, FP, YW, HL ja JF; metoodika, FG, FP, YW ja CC; projektihaldus, FG, YW ja CC; ressursid, CC; tarkvara, FG, FP, JF ja CC; järelevalve, CC; valideerimine, FG, FP, YW, HL ja CC; visualiseerimine, FG, FP, YW, HL ja JF; kirjutamine – originaalkavand, FG ja YW; kirjutamine – FG ja HL ülevaatamine ja toimetamine Kõik autorid on käsikirja avaldatud versiooni läbi lugenud ja sellega nõustunud.

Rahastamine: seda uuringut toetavad Henani provintsi teaduse ja tehnoloogia osakonna teaduslik ja tehnoloogiline uurimisprojekt (grandi nr 212102310217) ja Hiina riikliku loodusteaduste fondi toetus (grandi nr 81401015).

Institutsioonilise ülevaatenõukogu avaldus: Uuring viidi läbi vastavalt Zhengzhou ülikooli uurimisloomade hooldamise komitee juhistele; ZZUIRB2022-32.

Teavitatud nõusoleku avaldus: Ei kohaldata.

Andmete kättesaadavuse avaldus: Ei kohaldata.

Huvide konflikt: autorid ei deklareeri huvide konflikti.

Viited

1. Li, B.; Concepcion, K.; Meng, X.; Zhang, L. Aju-immuunsed interaktsioonid perinataalse hüpoksilis-isheemilise ajukahjustuse korral. Prog. Neurobiol.2017, 159, 50–68. [CrossRef]

2. Douglas-Escobar, M.; Weiss, MD Hüpoksilis-isheemiline entsefalopaatia: kliiniku ülevaade. JAMA Pediatr. 2015, 169, 397–403.[CrossRef] [PubMed]

3. Must, RE; Cousens, S.; Johnson, HL; Muru, J.; Rudan, I.; Bassani, D.; Jha, P.; Campbell, H.; Walker, CF; Cibulskis, R.; jt. 2008. aasta laste suremuse globaalsed, piirkondlikud ja riiklikud põhjused: süstemaatiline analüüs. Lancet 2010, 375, 1969–1987. [CrossRef]

4. Juul, SE; Ferriero, DM Farmakoloogilised neuroprotektiivsed strateegiad vastsündinute ajukahjustuse korral. Clin. Perinatool. 2014, 41, 119–131.[CrossRef]

5. Zhu, C.; Rodriguez, JI; Li, T.; Xu, Y.; Sun, Y. Apoptoosi indutseeriva faktori roll perinataalses hüpoksilis-isheemilises ajukahjustuses. NeuralRegen. Res. 2021, 16, 205–213. [CrossRef] [PubMed]

6. Song, S.-H.; Jee, Y.-S.; Ko, I.-G.; Lee, S.-W.; Sim, Y.-J.; Kim, D.-Y.; Lee, S.-J.; Cho, YS jooksulint ja rattaharjutused parandavad motoorset funktsiooni, pärssides ajupõletikuga rottidel apoptootilist neuronaalsete rakkude surma. J. Harjutus. Rehabil. 2018, 14, 911–919.[CrossRef]

7. Kelly, M.; Darrah, J. Veeharjutused tserebraalparalüüsiga lastele. Dev. Med. Laps. Neurol. 2005, 47, 838–842. [CrossRef]

8. Müller, P.; Duderstadt, Y.; Lessmann, V.; Müller, NG Lactate ja BDNF: Treeningu põhjustatud neuroplastilisuse peamised vahendajad? J. Clin. Med. 2020, 9, 1136. [CrossRef]

9. Intlekofer, KA; Cotman, CW Harjutus takistab hipokampuse funktsiooni vähenemist vananemise ja Alzheimeri tõve korral. Neurobiol.Dis. 2013; ajakirjanduses. [CrossRef]

10. Real, C.; Ferreira, A.; Chaves-Kirsten, G.; Torrão, A.; Pires, R.; Britto, L. BDNF retseptori blokaad takistab harjutuste kasulikku mõju Parkinsoni tõve rotimudelil. Neuroscience 2013, 237, 118–129. [CrossRef]

For more information:1950477648nn@gmail.com