MiR-214 leevendab sepsisest põhjustatud ägedat neerukahjustust PTEN/AKT/mTOR-reguleeritud autofagia kaudu
Feb 28, 2022
Abstraktne. Varasemad uuringud on näidanud, et oksüdatiivne stress ja autofagia põhjustavad ägedatneerukahjustus (AKI) sepsise ajal ja mikroRNA (miR)-214 mängivad olulist rollineerudallutatud oksüdatiivsele stressile. Käesoleva uuringu eesmärk oli testida, kas miR-214 renoprotektsioon on seotud sepsise autofagiaga. Autofagia rolli uuriti umbsoole ligeerimise ja punktsiooni (CLP) hiiremudelis. MiR-214 ekspressiooni analüüsimiseks kasutati pöördtranskriptsiooni-kvantitatiivset polümeraasi ahelreaktsiooni (RT-qPCR). Struktuur ja funktsioonneerudhinnati hiirtelt kogutud.Neerautofagia tasemed tuvastati immunohistokeemilise, immunofluorestsents- ja Western blot analüüsiga. Leiti, et miR-214 võib leevendada AKI-d septilistel hiirtel, inhibeeridesneerudautofagia. Lisaks pärssis miR-214 autofagiat, vaigistades PTEN-i ekspressioonineerudseptiliste hiirte kuded. Need leiud näitasid, et miR-214 leevendas CLP-indutseeritud AKI-d, vähendades oksüdatiivset stressi ja pärssides autofagiat PTEN / AKT / mTOR raja reguleerimise kaudu.
Märksõnad:mikroRNA-214, sepsis, äge neerukahjustus, autofagia, neerud
Sissejuhatus Ägeneerukahjustus(AKI) on üks levinumaid sepsise tüsistusi ja seda esineb 40–50 protsendil septilistel patsientidel ning suremus on kuni 60 protsenti (1). Sepsisest põhjustatud AKI patogenees jääb siiski ebaselgeks. On teatatud, et autofagia mängib sepsise põhjustatud AKI-s võtmerolli ja autofagia pärssimine põhjustab AKI arengut sepsise ajal (2, 3). Varasemad uuringud (4, 5) on kinnitanud, et sepsis vallandab autofagiat mitmes elundis, sealhulgasneerud(6) ja autofaagilised protsessid on seotud kahjustatud mitokondrite ja oksüdatiivse stressi eemaldamisega (7). Kuid liigne autofagia võib põhjustada soovimatut ja kahjulikku rakusurma (8). Seetõttu on mõõdukas autofagia tase sepsise põhjustatud AKI vähendamise võti. Varasemad uuringud on teatanud, et miR-214 leevendab isheemia-reperfusioonist põhjustatud AKI-d, pärssides apoptoosi (9) ja miR-214 pärsib oksüdatiivset stressi diabeetilise nefropaatia korral reaktiivsete hapnikuliikide (ROS) / AKT / mTOR signaaliraja kaudu (10). Käesolevas uuringus leiti, et miR-214 võib autofagiat inhibeerides nõrgendada sepsisest põhjustatud müokardi düsfunktsiooni hiirtel (11). Siiski tuleb veel selgitada, kas miR-214 võib leevendada sepsise põhjustatud AKI-d. Käesolevas uuringus püstitati hüpotees, et miR-214 nõrgendab CLP-indutseeritud AKI-d, vähendades oksüdatiivset stressi ja pärssides autofagiat PTEN / AKT / mTOR raja reguleerimise kaudu.
CISTANCHE PARANDAB NEERU-/NEERUHAIGUST
materjalid ja meetodid
Loomad.Käesolevas uuringus kasutati kokku 100 Kunmingi isast hiirt (kaal, 20, 40 ± 2, 92 g; vanus, 6–8 nädalat), mida tarnisid Hebei meditsiiniülikooli (Shijiazhuang, Hiina) meditsiinilabori loomakeskus. Kõik hiired aklimatiseeriti 12-tunnise valguse/pimeduse tsükliga 24 °C juures 50-protsendilise õhuniiskusega ning neile anti vaba juurdepääs toidule ja veele vähemalt 1 nädal enne katseid. Kõik katseprotseduurid viidi läbi rangelt kooskõlas riikliku terviseinstituudi juhistega (NIH väljaanne nr 85-23, muudetud 1996) ja Cangzhou keskhaigla institutsionaalsete loomade hooldamise ja kasutamise komiteede heakskiidu (kinnitus nr 2017-020- 01). Kõik operatsioonid viidi läbi anesteesia all ja tehti kõik endast olenev, et kannatusi minimeerida.
Umbsoole ligeerimine ja punktsioon (CLP).CLP viidi läbi hiirtel, et luua hiire sepsise mudel, nagu eelnevalt kirjeldatud (12). Pärast tuimastamist isofluraani sissehingamisega (indutseeriti 3% ja hoiti 0,5% juures) lõigati 1 cm keskjoone sisselõige. Avatud pimesool (1 cm kaugusel otsast) ligeeriti kahe torkega, kasutades 23-mõõtmelist nõela. Umbsool ekstrudeeris õrnalt väikese koguse väljaheiteid ja asetati tagasi oma anatoomilisse asendisse. Kõhu sein õmmeldi kihtidena 3-0 siidpunutisega. Pärast protseduuri süstiti subkutaanselt 1 ml 0,9% soolalahust. Hiirtele võimaldati tasuta juurdepääs ainult veele. Võltsmudeli hiiri käitati samal viisil nagu CLP mudelit ilma CLPta.
Eksperimentaalne disain. Hiired (n=6 näiliku kirurgia ja CLP jaoks) jaotati juhuslikult seitsmesse rühma: võltsrühm, CLP-rühm, adenoviiruse (Ad)-roheline fluorestseeruv valk (GFP) pluss CLP-rühm, Ad-miR-214 ja CLP-rühm. , anti-miR-214 pluss CLP rühm, PTEN inhibiitor pluss CLP rühm ja Ad-miR-214 pluss PTEN inhibiitor pluss CLP rühm. Sham-rühma hiired viidi läbi sama protseduuriga, kuid ilma ligeerimiseta ja pimesoole punktsioonita. Teiste rühmade hiired ligeeriti ja perforeeriti. Kõik hiired anesteseeriti kiiresti isofluraani sissehingamisega, et koguda verd, uriini janeerudproovid 24 tundi pärast viimast töötlemist.
Adenoviiruse vahendatud Ad-miR-214, anti-miR-214 või Ad-GFPgeeniülekanne in vivo ja PTEN inhibiitori süstimine. Ad-miR-214, anti-miR-214 või Ad-GFP (Shanghai GenePharma Co., Ltd.) viidi hiirte kõhuõõnde 4 päeva enne CLP-d. Lühidalt, hiired anesteseeriti isofluraani sissehingamise teel. Kateetrit, mis sisaldas 200 µl adenoviirust (2x1011 pfu, mis ekspresseerib miR-214, anti-miR-214 või Ad-GFP), manustati normaalsetele hiirtele intraperitoneaalse süstimise teel. PTEN-i inhibiitorit (VO-OHpic, intraperitoneaalne, Sigma-Aldrich; Merck KGaA) manustati CLP-hiirtele, kes olid saanud anti-miR-214 intraperitoneaalse süstina ühekordse annusena 10 µg/kg 30 minutit enne adenoviiruse manustamist. .
Neerufunktsiooni hindamine. Hiire südamest võeti vereproovid, millele järgnes seerumi kogumiseks tsentrifuugimine (toatemperatuuril 15 minutit 3, 000 xg). Vere uurea lämmastiku (BUN) ja seerumi kreatiniini (Cr) tasemed määrati Hitachi 7600 automaatse analüsaatoriga (Hitachi, Ltd.). ELISA-t kasutati tasemete analüüsimiseksneerukahjustusmolekuli-1 (KIM-1; kat. nr RKM100; R&D Systems, Inc.) ja neutrofiilide želatinaasiga seotud lipokaliini (NGAL; kat. nr DY3508; R&D Systems, Inc.) uriiniproovides.
Seerumi põletiku tsütokiini analüüs.Seerumi TNF- (kat. nr. H052) ja IL-6 (kat. nr. H007) uuriti, kasutades kaubanduslikke ELISA komplekte (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute) vastavalt tootja juhistele.Oksüdatiivse stressi markerite mõõtmine. Malondialdehüüdi (MDA) taseme mõõtmiseks ja superoksiidi dismutaasi (SOD) aktiivsuse testimiseks kasutati vastavat testikomplekti (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, Hiina) vastavalt tootja juhistele.
Histoloogia ja torukujulise vigastuse skoor. Kõik hiired allutatineerudperfusioon anesteesia all 24 tundi pärast CLP-d. Theneerudproovid fikseeriti 4% paraformaldehüüdis 72 tundi temperatuuril 4 °C. Seejärel dehüdreeriti koeproovid etanoolilahuste sorteeritud seerias, sisestati parafiini ja lõigati 4 µm osadeks. Lõigud (4 µm) lõigati mikrotoomi abil ja koelõigud värviti histoloogiliseks uurimiseks toatemperatuuril hematoksüliini (5 min) ja eosiiniga (1 min). Slaidid hinnati ja klassifitseeriti mikroskoobiga (BX51, Olympus Corporation).Neerudtissues with the following histopathological changes were judged injured: Loss of brush border, vacuolization, cast formation, tubular dilation and disruption, cell lysis and cellular necrosis. Tissue damage was checked in a blinded manner and scored by the percentage of damaged tubules: 0, no damage; 1, 0‑25; 2, 25‑50; 3, 50‑75; 4, >75 protsenti (13).
Transmissioonelektronmikroskoopia (TEM).Värskeneerudpesti fosfaatpuhverdatud soolalahuses, lõigati 1 mm kuubikuteks ja fikseeriti järjestikku 2,5% glutaaraldehüüdis 24 tundi temperatuuril 4 °C. Sektsioonid sukeldati 1% osmiumtetroksiidi 2 tunniks temperatuuril 4 °C, dehüdreeriti gradueeritud etanoolis ja sisestati epoksüvaiku. Lõpuks üliõhukesed lõigud (60 nm) värviti kahekordselt uranüülatsetaadi ja pliitsitraadiga temperatuuril 20 °C 60 minutit. Vaatlus viidi läbi ülekandeelektronmikroskoobiga (Tecnai; Hitachi, Ltd.) 80 kV juures, kasutades Electron Microscopy Film 4489 (ESTAR paks alus; Kodak).
Immunohistokeemia (IHC).Värskeneerudkuded fikseeriti 4% paraformaldehüüdis (72 tundi temperatuuril 4 °C) ja sisestati parafiini. Proovid lõigati 4 µm paksusteks osadeks ja deparafineeriti ksüleenis. Pärast koelõikude pesemist PBS-ga keedeti neid 10 mM tsitraatpuhvris (pH 60) 4 minutit antigeeni leidmiseks ja seejärel blokeeriti toatemperatuuril 10% kitse seerumiga PBS-is. 1 h. Primaarne antikeha (anti-LC3B; 1:400; kat. nr 4412; Cell Signaling Technology, Inc.) lisati vastavalt juhistele ja inkubeeriti 4 °C juures 12 tundi. Lisati sekundaarne antikeha (kitse küülikuvastane HRP; 1:2, 000; kat. nr BS13278; Bioworld Technology, Inc.) ja inkubeeriti toatemperatuuril 10 minutit. Lisati DAB (100 µl) ja värviti 5 minutit valgusmikroskoobi all jälgitava värvimisega (mudel CX31-P; Olympus Corporation). Positiivse värvumise intensiivsus, mis paistis pruunina, määrati pildianalüüsi tarkvara Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, Inc.) abil. Intensiivsuse esindamiseks arvutati integraalne optiline tihedus (IOD). IOD väärtused suurenesid valgu ekspressiooni suurenedes.
Pöördtranskriptsioon-kvantitatiivne(RT-q) PCR. Kogu RNA ekstraheeritineerukudepärast mudeli indutseerimist, kasutades TRIzol reaktiivi (Thermo Fisher Scientific, Inc.). TaqMani pöördtranskriptsioonikomplekti (kat. nr. N8080234; Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.) juhiste kohaselt pöördtranskribeeriti RNA cDNA-ks. Kasutati järgmisi termotsükli tingimusi (miR-214): esialgne denatureerimine 95˚C juures 5 min; millele järgneb 40 denatureerimistsüklit temperatuuril 95 °C 30 sekundit, lõõmutamist 60 °C juures 30 sekundit ja pikendamist 72 °C juures 30 sekundit. RT-qPCR viidi läbi, kasutades ABI Prism 7500 Sequence Detection System (PerkinElmer, Inc.) ja standardset SYBR Green PCR komplekti (Toyobo Life Science). U6 kasutati miR-214 sisekontrollina. Praimeri järjestused olid järgmised: miR-214, edasi, 5'-AGCATAATACAGCAGGCACAGAC-3' ja tagurpidi, 5'-AAAGGTTGTTCTCCACTCTCTCAC-3'; U6, edasi, 5'-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3 ja tagasi, 5'-GGAACGCTTCACGAATTTG-3'. Neid katseid korrati kuus korda. Tulemusi analüüsiti 2-ΔΔCq meetodil (14). LC3, p62, PTEN, AKT ja mTOR mRNA ekspressioonitasemeid hinnati RT-qPCR abil. Aktiini kui nende geenide sisemise võrdlusalusena kasutati sihtgeenide suhtelise ekspressiooni mõõtmiseks 2-ΔΔCq. Tabelis I näidatud praimerijärjestused sünteesis Sangon Biotech Co., Ltd.
Western blotting. Neerkude segati homogeniseerimiseks RIPA lüsaadiga (Beyotime Institute of Biotechnology) ja lüüs peatati, kui nähtavat kudet ei täheldatud. Proove tsentrifuugiti 13, 000 xg juures 10 minutit temperatuuril –4 ˚C ja supernatant koguti Western blot analüüsi jaoks. Lühidalt öeldes määrati valgu kontsentratsioonid mikro-BCA valguanalüüsi komplekti (Thermo Fisher Scientific, Inc.) abil. Valguproovid (80 µg proovi kohta) eraldati 12% naatriumdodetsüülsulfaadi ja polüakrüülamiidgeeli redutseerimise teel ja kanti seejärel üle öö temperatuuril 4 °C polüvinülideendifluoriidmembraanidele. Eraldatud valgud kanti üle PVDF membraanidele. Pärast 5-protsendilise lõssi blokeerimist toatemperatuuril 2 tundi inkubeeriti membraane üleöö (temperatuuril 4 °C) primaarsete antikehadega. Kasutati järgmisi primaarseid antikehi (kõik Cell Signaling Technology, Inc.): kerge ahel 3B (1:1, 000; kat. nr 4412), p62 (1:1, 000; kat. . nr 4412), anti-PTEN (1:1, 000; kat. nr 9188), anti-fosforüülitud (p)-AKT (Ser473) (1:1, 000; kass . nr 4060), anti-AKT (1:1,000; kat. nr 9272), anti-p-mTOR (Ser 2448) (1:1, 000; kat. nr. . 5536), anti-mTOR (1:1, 000; kat. nr 2972) ja -aktiin (1:2, 000; kat. nr 4970). Pärast pesemist inkubeeriti membraane (toatemperatuuril 2 tundi) HRP-ga konjugeeritud küülikuvastaste sekundaarsete antikehadega (1:3, 000; kat. nr A0208; Beyotime Institute of Biotechnology). Valguribad tuvastati Immobilon Westerniga (MilliporeSigma) ja analüüsiti tarkvara Total-Lab TL120 (Nonlinear Dynamics, 2.01) abil. Valgu ekspressioon normaliseeriti -aktiiniks.
Statistiline analüüs. Statistiline analüüs viidi läbi programmiga GraphPad Prism 9.0 (GraphPad Software, Inc.). Kõik andmed esitati pidevate muutujate keskmiste ± standardhälbe või mediaanidena (kvartiilide vahemikud), olenevalt nende jaotusest. Algtaseme omadusi ja tulemusi võrreldi ühesuunalise ANOVA-ga, millele järgnes Tukey posthoc-test või Kruskal-Wallise testi, millele järgnes Dunni test. P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">
Tulemused
Ajapunkt 24 tundi pärast CLP-d. Varasemad uuringud on teatanud (6, 15, 16), et biokeemiline (st LC3 ja p62) analüüs näitab, et autofagia voog pärsib sepsise progresseerumist pärast 6–8 tundi CLP-d. Käesolevas uuringus on autolüsosoomide arvneerudCLP-ga ravitud hiirte arv suurenes 24 tunni jooksul pärast operatsiooni. Lisaks markerite analüüsneerukahjustusnäitas sedaneerufunktsioonoli kõige tõsisemalt kahjustatud 24 tundi pärast CLP-d. Seetõttu valiti järgmiste katsete jaoks ajapunkt 24 tundi pärast CLP-d.
Reguleeriv toime miR-214-le neerukudedes. RT-qPCR analüüsi kasutati miR-214 ekspressiooni tuvastamiseks CLP-ga töödeldud hiirtel. Leiti, et miR-214 ekspressioon oli piirkonnas pisut ülesreguleeritudneerudkudedes pärast CLP-operatsiooni 24 tundi, võrreldes võltsrühmaga (1,47 korda, P<0.01, fig.="" 1a).="" the="" present="" study="" examined="" the="" reactive="" increase="" in="" mir‑214="" expression="" during="" sepsis="" as="" a="" compensatory="" protective="" mechanism.="" therefore,="" it="" evaluated="" the="" role="" of="" mir‑214="" in="" aki="" during="" sepsis="" by="" regulating="" its="" expression.="" as="" shown="" in="" fig.="" 1b,="" ad‑mir‑214="" increased="" mir‑214="" expression="" by="" 4.13‑fold="" 4="" days="" after="" intraperitoneally="" injecting="" 2x1011="" pfu/mice="" adenovirus,="" whereas="" anti‑mir‑214="" decreased="" mir‑214="" expression="" by="" 81.16%="" in="" the="">neerudkude, võrreldes võltsrühmaga (mõlemad P<0.01). by="" contrast,="" ad‑gfp="" as="" a="" control="" group="" did="" not="" affect="" mir‑214‑3p="" expression,="" compared="" with="" the="" sham="" group="" (both="" p="">0.05).
CISTANCHE PARANDAB neeru-/NEerupuudulikkust
MiR-214 mõju neerufunktsiooni häiretele septilistel hiirtel.Kõik hiired ohverdati vere, uriini janeerudproovid 24 tundi pärast CLP-operatsiooni. BUN ja Cr on haiguse tõsiduse olulised näitajadneeru-väärtuse langus (17). Lisaks on NGAL ja KIM-1 tuvastatud spetsiifiliste biomarkeritenaneerukahjustusja nende suurenenud ekspressioon on seotud varajaseneeru-torukujuline vigastus AKI-s (17). Nagu on näidatud joonisel 2A-D, tõusid BUN, Cr, KIM-1 ja NGAL tasemed pärast CLP-operatsiooni oluliselt võrreldes võltsrühmaga. Kuid Ad-miR-214 vähendas oluliselt BUN, Cr, KIM-1 ja NGAL taset võrreldes CLP rühmaga (kõik P<0.01), whereas="" anti‑mir‑214="" exhibited="" opposite="" effects="" in="" these="">neerufunktsioonparameetrid. Kuid pärast eeltöötlust PTEN-i inhibiitoriga suurenes Ad-miR-214 kaitseefekt. Tulemused näitavad, et miR-214 nõrgendab septilistel hiirtel neerufunktsiooni häireid.
MiR-214 mõju neerupõletikule ja oksüdatiivsele stressile.Nagu on näidatud joonistel 3A ja B, tõstis CLP oluliselt TNF- ja IL-6 taset, samas kui Ad-miR-214 vähendas oluliselt nende markerite taset. Võrreldes
MiR-214 mõju neeru autofagiale septilistel hiirtel.Käesolevas uuringus uuriti LC3 muutusi aastalneerudkudesid IHC värvimise teel. Nagu on näidatud joonisel fig 6, suurenes positiivse värvumise LC3 intensiivsus oluliselt CLP rühmas võrreldes võltsrühmaga (P<0.01) due="" to="" the="" activated="" autophagy.="" the="" expression="" level="" of="" lc3="" was="" lower="" in="" the="" ad‑mir‑214="" group="" and="" higher="" in="" the="" anti‑mir‑214="" group="" in="" comparison="" with="" the="" clp="" group=""><0.01). however,="" the="" administration="" of="" pten="" inhibitor="" enhanced="" the="" inhibition="" of="" autophagy="" effect="" of="">
miR-214 aktiveerib inhibeerimiseks AKT/mTOR rajaautofagia, vaigistades PTEN-i neerukudedes.CLP mõju autofagialeneerudkudesid uuriti, hinnates LC3-II/I ja p62 taset. PTEN/AKT/mTOR signaalirada mängib autofagias olulist rolli (18). MiR-214 mõju uurimiseks PTEN-AKT/mTOR rajale analüüsiti LC3-II/I, p62, AKT, p-AKT, mTOR, p-mTOR ja PTEN valgu taset Western blot analüüsi ja RT- abil. qPCR analüüs. Nagu on näidatud joonisel 7A-C, toimuvad nendes valkudes kiiresti muutused, millega kaasneb LC3-II/LC3-I kiiruse suurenemine ja p62 taseme langus (mõlemad P<0.01) in="" the="" clp‑induced="" sepsis="" group.="" compared="" with="" the="" clp="" group,="" the="" rate="" of="" lc3‑ii/lc3‑i="" was="" significantly="" decreased,="" while="" the="" level="" of="" p62="" (both=""><0.01) was="" significantly="" increased="" in="" the="" ad‑mir‑214="" group.="" however,="" the="" inhibition="" of="" mir‑214="" displayed="" an="" opposite="" tendency="" to="" the="" above="" indicators="" (both=""><0.01). by="" contrast,="" the="" negative="" control="" had="" no="" effect="" on="" the="" changes="" in="" the="" rate="" of="" lc3‑ii/lc3‑i="" and="" the="" levels="" of="" p62="" in="">neerud tissues (both P>0.05). The two indicators of LC3‑II/LC3‑I and p62 had no significant difference among the Ad‑miR‑214 group, the PTEN inhibitor group and the Ad‑miR‑214 + PTEN inhibitor group (all P>0.05). Need tulemused näitasid, et CLP indutseeris autofagiat ja miR-214 üleekspressioon võib seda osaliselt pärssida.
Nagu on näidatud joonistel 7A ja D-F, on PTEN ekspressioonitase (P<0.01) was="" increased,="" and="" the="" expression="" levels="" of="" p‑akt="" (ser473)="" and="" p‑mtor="" (ser2448)=""><0.01) were="" decreased="" by="" clp.="" compared="" with="" the="" clp="" group,="" the="" expression="" level="" of="" pten="" was="" reduced,="" while="" those="" of="" p‑akt="" and="" p‑mtor="" (all=""><0.01) were="" subsequently="" increased="" in="" the="" ad‑mir‑214="" group.="" by="" contrast,="" the="" negative="" control="" had="" no="" effect="" on="" the="" changes="" in="" the="" expression="" levels="" of="" pten,="" p‑akt="" and="" p‑mtor="">neerud tissues (all P>0.05). There was no signifi‑ cant difference in the above indicators among the Ad‑miR‑214 group, the PTEN inhibitor group and the Ad‑miR‑214 + PTEN inhibitor group (all P>0.05). Need leiud viitavad sellele, et CLP indutseeribneerudkudede autofagia, inhibeerides AKT / mTOR rada. Ad-miR-214 aktiveeris AKT/mTOR raja, vaigistades sisse PTEN-ineerudkoed. Kuid võrreldes CLP rühmaga ei inhibeerinud anti-miR-214 oluliselt mTOR ekspressiooni. Seetõttu kasutati RT-qPCR-i täiendavalt PTEN/AKT/mTOR signaalirajaga seotud geenide mRNA ekspressiooni määramiseks. Vastavalt RT-qPCR tulemustele (joonis 8) suurenesid võltsrühmaga võrreldes p62, LC3 ja PTEN mRNA ekspressioonitasemed märkimisväärselt, samas kui AKT ja mTOR mRNA ekspressioon vähenes CLP rühmas. Võrreldes CLP-rühmaga, on Ad-miR-214, PTEN
inhibiitori ja Ad-miR-214 pluss PTEN inhibiitori rühmad vähendasid LC3 ja PTEN mRNA ekspressiooni, kuid suurendasid p62, AKT ja mTOR mRNA ekspressiooni (kõik P<0.05); in="" the="" anti‑mir‑214="" group,="" an="" opposite="" changing="" tendency="" was="" observed="" (all=""><0.05). there="" was="" no="" significant="" difference="" in="" the="" above="" indicators="" among="" the="" ad‑mir‑214="" group,="" the="" pten="" inhibitor="" group="" and="" the="" ad‑mir‑214="" +="" pten="" inhibitor="" group="" (all="" p="">0.05). Seega võib p62 mõju autofagiale ilmneda pigem transkriptsiooni kui transkriptsioonijärgsel tasemel. Praegused tulemused näitasid, et miR-214 reguleeris PTEN ekspressiooni alla ja aktiveeris AKT / mTOR signaaliraja.
Arutelu
Käesolevas uuringus leiti, et liigne autofagia oli kahjulikneerufunktsioonseptilistel hiirtel. Varasemad uuringud on näidanud, et miR-214 on seotud suurenenud proliferatsiooni, metastaaside ja invasiooniga ning toimib rakkude ja kudede onkogeenina (19-22). Uuringud näitavad, et miR-214 toimib AKI vastu kaitsva rollina apoptoosi, oksüdatiivse stressi ja põletikuliste tegurite allareguleerimise kaudu (21, 23). Käesolevas uuringus uuriti täiendavalt mehhanisme, mis on seotud miR-214 kaitsva toimega sepsise põhjustatud AKI-le, keskendudes miR-214 võimalikule osalemisele autofagia moduleerimisel. Tulemused näitasid, et oksüdatiivne stress tekkisneerudpärast CLP-operatsiooni manustamist. Samal ajal toimub autofagia aktiveerimineneerud.Kõrgenenud LC3 II/I ja p62 vähenemineneerudtäheldati pärast ravi CLP-operatsiooniga. Nagu oodatud, nõrgenes miR-214 üleekspressioon oluliseltneerudpatoloogilised vigastused janeerudsepsisest põhjustatud düsfunktsioon. MiR-214 inhibeerimine näitas aga vastupidist tendentsi renoprotektsioonile. Lisaks suurendas Ad-miR-214 kaitseefekti PTEN-i inhibiitor.
SeptikusneerudLiigse põletikuga kaasneb ROS-i tootmise massiline suurenemine ja suur hulk ROS-i põhjustab muutusi mitokondriaalses struktuuris ja kahjustab mitokondriaalset funktsiooni, mis põhjustab organismi sattumist nõiaringi, mis süvendabneerudkahju (24,25). Seetõttu võib oksüdatiivne stress olla sepsisest põhjustatud AKI üks peamisi patoloogilisi mehhanisme. Käesolev uuring andis täiendavaid tõendeid ülemäärase oksüdatiivse stressi kohta, millele viitas suurenenud MDA tootmine ja vähenenud SOD aktiivsus veres.neerudkudedes pärast CLP-operatsiooni. Lisaks leiti, et miR-214 üleekspressioon võib kaitstaneerudCLP-indutseeritud oksüdatiivse kahjustuse vastu, mis on seotud autofaagilise inhibeerimisega. See on kooskõlas varasemate uuringutega, et miR-214 kaitseb erinevaid rakke ja kudesid oksüdatiivse stressi eest (26, 27).
Autofagia toimib sepsise tekkes kahe teraga mõõgana: Basaalautofagia võib avaldada kaitsvat toimet, eemaldades toksilised oksüdatiivsed valgud, kuid liigne autofagia võib põhjustada autofaagilist rakusurma tõsise stressi korral, näiteks ROS-i purse (28, 29) . On näidatud, et autofagia aktiveeritakse algselt sepsise korral, millele järgneb autofagilisest rakusurmast tingitud düsfunktsiooni faas (30), mis süvendab sepsisest põhjustatud oksüdatiivset kahjustust. Käesolevas uuringus näitas PTEN-i inhibiitor või miR-214 üleekspressioon CLP-ga ravitud hiirtel antioksüdatiivset renoprotektsiooni. MiR-214 inhibeerimine näitas aga vastupidist tendentsi antioksüdatiivsele renoprotektsioonile. Nii võib liigne või ebapiisav autofagia põhjustadaneerukahjustus; mõlemad on halvasti kohanevad ja põhjustavad lõpuks rakusurma. Seega on autofagia mõõduka taseme hoidmine septilise seisundi oksüdatiivsete vigastuste leevendamise võti.
CISTANCHE PARANDAB NEERU/NEERU VALU
Koguvad tõendid on näidanud, et miR-214 pärsib autofagiat erinevates rakkudes ja kudedes (31-33). Käesolevas uuringus leiti, et miR-214 üleekspressioon pärsib CLP-indutseeritud autofagiatneerukuded,nagu näitavad muutused valgumarkerites, nagu LC3-II/I ja p62. Lisaks näitasid tulemused, et miR-214 üleekspressioon nõrgendas CLP-indutseeritud oksüdatiivset kahjustust, inhibeerides liigset autofagiat. Käesolevas uuringus uuriti ka molekulaarseid mehhanisme, mille abil miR-214 moduleeribneerudautofagia sepsise põhjustatud AKI korral. PTEN/AKT/mTOR on oluline signaalirada, mis reguleeribneerudautofagia (34, 35) ja millel on sepsise põhjustatud AKI võtmeroll, ja PTEN on PI3K / AKT / mTOR signaaliraja negatiivne inhibiitor. Varasemad uuringud teatasid, et miR-214 võib reguleerida autofagiat PI3K / AKT / mTOR signaaliraja kaudu erinevates mudelites (36-38). Ma jt (39) leidsid, et miR-214 võib diabeetiliste neerude autofagiat allapoole reguleerida. Seetõttu oletati, et miR-214 mõju CLP-indutseeritud AKI-le võib olla seotud PTEN / AKT / mTOR raja reguleerimisega. Nimelt näitasid käesoleva uuringu tulemused, et CLP-operatsioon tõstis märkimisväärselt PTEN-i taset, kuid vähendas p-AKT ja p-mTOR-i taset, mis näitab, et CLP-operatsioon inaktiveeris AKT / mTOR-raja. Lisaks aktiveeris miR-214 üleekspressioon AKT / mTOR raja PTENi vaigistamise tõttu CLP-indutseeritud autofagiasneerudkoed. Kuid anti-miR-214 ei inhibeerinud oluliselt mTOR-i ekspressiooni Western blot analüüsides. Seega kasutati RT-qPCR-i täiendavalt PTEN/AKT/mTOR signaalirajaga seotud geenide mRNA ekspressiooni määramiseks. Käesolevas uuringus tuvastati, et miR-214 vähendas PTEN ekspressiooni ja aktiveeris AKT / mTOR signaaliraja autofagia pärssimiseks. Siiski tuleks läbi viia täiendavad põhjalikud uuringud, et saada täiendavaid üksikasju mehhanismi kohtaneerudautofagia septilises seisundis.
Kokkuvõtteks võib öelda, et käesoleva uuringu tulemused näitasid, et miR-214 kaitses sepsise eest.neerukahjustusvähendades oksüdatiivset stressi ja pärssides autofagiat PTEN / AKT / mTOR raja reguleerimise kaudu. Praegused leiud viitasid sellele, et miR-214 võib olla sepsise põhjustatud AKI potentsiaalne terapeutiline sihtmärk. Käesolevas uuringus kasutati aga 6–8 nädala vanuseid hiiri, seega on täiskasvanud hiirtel vaja täiendavaid uuringuid miR-214 mehhanismi kohta.
