MikroRNA-d kujundavad sotsiaalset immuunsust: termiidi Reticulitermes Chinensise bioloogilise kontrolli potentsiaalne sihtmärk

Abstraktne

Eusotsiaalsed putukad võivad kasutada erinevaid käitumuslikke ja füsioloogilisi haiguste kaitsemehhanisme, et vältida, vastu seista ja taluda patogeensete infektsioonide teket nende lähedalt seotud ja kokkusurutud kolooniates, mida nimetatakse sotsiaalseks immuunsuseks. Hiljutised uuringud on näidanud, et mitmed molekulid teenivad putukate sotsiaalset immuunsust, sealhulgas keemilised lõhnad, putukamürgid, immuunsüsteemiga seotud valgud jne. Kas ja kuidas mikroRNA-d (miRNA-d), mille lähteaineid Dicer töötleb-1, mõjutavad sotsiaalset puutumatus putukakolooniates on siiani teadmata. Siin kasutasime "peremees-patogeeni" süsteemi (peremees: Reticulitermes chinensis; patogeen: Metarhizium anisopliae), et uurida miRNA-de mõju sotsiaalsele immuunsusele termiitide kolooniates. Leidsime, et Dicer-1 RNAi-vahendatud vaigistamine põhjustas miRNA kontsentratsiooni vähenemise, inhibeeris oluliselt süsivesikute ja energia metabolismi ning mõjutas muid eluprotsesse, nagu immuunvastus ja oksüdatsiooni-redutseerimisreaktsioonid kogu termiidi kehas. . Käitumiskaitses vähendas Diceri vaigistamine{4}} märkimisväärselt kaitsvat sotsiaalset käitumist, nagu liikumine, hooldamine, kannibalism ja termiitide rühmade matmine seensaaste korral. Füsioloogilises kaitses vähendasid Dicer-1 vaigistamine ja miR- 71-5 stimulatsioon termiitide seenevastast toimet oluliselt. Lisaks oli nii Dicer-1-vaigistatud kui ka miR-71-5 stimulantidega töödeldud termiitide rühmades kõrge suremuse tase seentega saastumise ajal. Meie leiud näitasid miRNA-de olulist rolli sotsiaalse immuunsuse kujundamisel termiitide kolooniates, pakkudes teadmisi, mis on vajalikud putukate käitumuslike ja füsioloogiliste haiguste kaitsemehhanismide mõistmiseks ja seega aluse miRNA-põhisele kahjuritõrjele.

cistanche tubulosa - parandab immuunsüsteemi

Märksõnad Eusotsiaalne putukas · Entomopatogeensed seened · Kaitsemeetmed haiguste vastu · Dicer-1 · miR-71-5

Võtmesõnum

• miRNA-d vahendasid sotsiaalse immuunsüsteemiga seotud geeniekspressiooni.

• miRNA-d mõjutasid termiitide rühmade käitumishaiguste kaitsevõimet.

• miRNA-d mõjutasid termiitide isendite füsioloogilist kaitset haiguste vastu.

• miRNA-põhiseid termititsiide võiks pidada bioloogilise kahjuritõrje uudseks juurdepääsuks.

Sissejuhatus

Termiidid on majanduslikult olulised kahjurid, mis maksavad kogu maailmas 30 miljardit dollarit ja põhjustavad ülemaailmset kahju põllukultuuridele, puudele, puitkonstruktsioonidele ja tselluloosmaterjalidele. Keemilised pestitsiidid pakuvad tõhusat kontrolli termiidikahjurite vastu, kuid tekitavad ka tõsiseid probleeme, mis ohustavad inimeste tervist ja keskkonda. Bioloogiline tõrje on väärtuslik alternatiiv nende probleemide lahendamiseks. Mitmeid entomopatogeene, nagu Metarhizium ja Beauveria, on edukalt kasutatud bioloogiliseks kahjuritõrjeks, mis on mõistlik ja tõhus (Verma et al. 2009; Kumar ja Upadhyay 2021). Termiitide bioloogiline tõrje on siiski ebarahuldav, peamiselt termiitide kolooniate ainulaadsete haiguste kaitse tõttu. Termiidid, mis on eusotsiaalsed putukad, on arendanud välja kollektiivse käitumusliku ja individuaalse füsioloogilise kaitse, et neutraliseerida nakkuslike patogeenide leviku kõrget riski tihedalt pakitud ja lähedalt seotud pesakaaslaste seas (nimetatakse "sotsiaalseks immuunsuseks") (Van Meyel et al. 2018; Liu et al. . 2019a). On hästi dokumenteeritud, et termiidid kasutavad laia käitumiskaitsevahendite repertuaari: vältimine on esimene kaitseliin ja aitab vältida termiitide sattumist saastatud aladele (Yanagawa et al. 2015); häirekäitumist eksponeeritakse kiire pikisuunalise võnkuva liikumisega, et hoiatada pesakaaslasi patogeenide esinemise eest (Rosengaus et al. 1999); patogeeniga saastunud pesakaaslaste hooldamine võib tõhusalt eemaldada patogeenid pesakaaslaste küünenahast (Liu et al. 2019b); matmine ja kannibalistlik käitumine piiravad patogeenide levikut surnukehadelt vastuvõtlikele pesakaaslastele (Sun et al. 2016). Füsioloogilised reaktsioonid, nagu immuunvastused ja oksüdatsiooni-redutseerimisreaktsioonid, kaitsevad ka termiitide vastu. Immuunvastuste hulka kuuluvad humoraalsed immuunsuse vahendatud antimikroobsed peptiidid (AMP) ja rakulise immuunsuse poolt vahendatud fagotsütoos ja kapseldamine, mis on võimelised inhibeerima patogeenide replikatsiooni ja levikut putuka kehaõõnes (Hussain et al. 2013; Liu jt 2015; Lopez-Uribe jt 2016; Hong jt 2018). Oksüdatsiooni-redutseerimisreaktsioonid leevendavad toksiinide ja reaktiivsete hapnikuliikide (ROS) põhjustatud kahjustusi patogeensete infektsioonide ajal, aidates kaasa putukate taluvusele (Liu et al. 2015; Zhao jt 2020; Zhou jt 2021). Lisaks on varasemad termiitide haiguse kaitset käsitlevad uuringud näidanud, et mõned soolesümbiondid olid peremeesorganismi füsioloogilise kaitse oluliseks komponendiks (Rosengaus et al. 2014). Mõnda AMP-d võib kasutada väliste desinfitseerimisvahenditena küünenaha pinnal ja pesamaterjalides, kui need on seotud selliste käitumisviisidega nagu hooldamine ja pesitsemine (Bulmer et al. 2009; Hamilton ja Bulmer 2012). Seetõttu võib termiitide käitumusliku ja füsioloogilise kaitse nõrgenemine olla peamine samm termiitide biokontrolliefekti suurendamiseks.

Tistanche kasulikud omadused meestele - tugevdavad immuunsüsteemi

Cistanche Enhance Immunity toodete vaatamiseks klõpsake siin

【Küsi lisa】 E-post:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Üha rohkemates uuringutes on kirjeldatud sotsiaalse immuunsuse molekulaarset alust. Mitmed molekulid, sealhulgas keemilised lõhnad, välised sekretsioonid, antibiootikumid, immuunvalgud ja kemoretseptorid, mis teenivad putukate käitumis- ja füsioloogilisi kaitsemehhanisme, on tuvastatud mitme oomika tehnika ja gaasi-/vedelikkromatograafia-massispektromeetria abil (Seipke et al. 2011; Hussain et al. 2013; Terrapon jt 2014; Liu jt 2015; Sun jt 2016; He jt 2018). Termiitide rühmades kutsub patogeenidest tulenev kopitanud lõhn esile parema hoolduskäitumise (Yanagawa et al. 2011). Termiitide surnukehade surmajuhised kutsuvad esile kas kannibalismi või matmiskäitumise (Sun et al. 2016). Ees- ja süljenäärmete välised eritised ning kasulike mikroorganismide poolt vahendatud antimikroobne toime aitavad termiitidel kaitsta end, pesakaaslasi ja isegi kolooniaid (Bulmer jt 2009; Rosengaus jt 2000, 2014; Chouvenc jt 2013). Putukate sotsiaalset immuunsust juhtivate geneetiliste ja biokeemiliste mehhanismide jaoks võib kasutada RNAi ja geenide redigeerimise tehnoloogiaid. Termiitidel on tõestatud, et termiitide, gramnegatiivse siduva valgu 2 (GNBP2), seleeni siduva valgu ja transglutaminaasi (TG) geenide RNAi-vahendatud vaigistamine vähendab oluliselt termiitide seenevastast toimet ja suurendab seega infektsioonide suremust (Hamilton ja Bulmer 2012; Zhao jt 2020; Zhou jt 2021). Isotsitraatdehüdrogenaas (IDH) võib mõjutada termiitide metabolismi ja selle düsregulatsioon kutsub esile apoptootiliste kahjustuste suurenemise, mis viib kõrge infektsioonide ja suremuseni (Liu et al. 2020). Lisaks kaitsevad GNBP2 ja TG termiitide käitumist, mõjutades vastavalt kannibalistlikku ja hooldavat käitumist (Zhao et al. 2020; Esparza-Mora jt 2020). Siiski tuleb veel selgelt mõista sotsiaalse immuunsuse molekulaarset alust, eriti molekulaarset mehhanismi, mis juhib keerulist sotsiaalset käitumist vastuseks nakkuslikele patogeenidele. Lisaks keskendub sotsiaalse immuunsuse geneetiline ja biokeemiline mehhanism kodeerivale RNA-le, mis juhib putukate sotsiaalset immuunsust, kuid see, kas mittekodeerivad RNA-d, nagu miRNA-d, osalevad putukate sotsiaalse immuunsuse reguleerimises, on endiselt ebaselge.

Dicer-1, RNaasi III endonukleaas, on miRNA biosünteesi viimases etapis hädavajalik. miRNA-d on endogeensed, 18–25 nt mittekodeerivad RNA-d, mis reguleerivad negatiivselt geeniekspressiooni posttranskriptsiooni tasemel, moodustades aluspaari miRNA-de külvipiirkonna ja sihtmärk-mRNA-de sobitatud piirkonna vahel (Gomez-Orte ja Belles 2009; Wang et al. 2013; Yang jt 2014; Lucas jt 2015). Kuna miRNA tootmine sõltub Dicer-1-st, saab miRNA-de funktsioone putukate bioloogiliste protsesside moduleerimisel uurida Dicer-1 funktsionaalsete kadude abil. Kasutades äädikakärbeste Dicer-1 mutante, on tõestatud, et miRNA-d toimivad embrüogeneesis ja haistmisneuronite morfogeneesis (Lee et al. 2004; Berdnik jt 2008). Dicer-1 RNAi-vahendatud vaigistamise abil on teadlased kinnitanud, et miRNA-d mängivad võtmerolli putukate, näiteks prussakate ja jaaniussiliste metamorfooside arenguprotsesside reguleerimisel (Gomez-Orte et al. 2009; Wang et al. 2013). Lisaks on miRNA-d seotud ka putukate käitumise moduleerimisega. miR-8 ja miR-429 reguleerivad vatitupsude viirusest põhjustatud ronimiskäitumist, kontrollides otseselt BrZ2 ekspressiooni (Zhang et al. 2018). miR-133 reguleerib dopamiini sünteesi ja pärsib seega jaaniussi käitumise agregatsiooni (Yang et al. 2014). Tuginedes sellistele tõenditele miRNA-de funktsiooni kohta putukate füsioloogias ja käitumises, püüdsime määrata miRNA-de mõju termiitide füsioloogiale ja sotsiaalse immuunsusega seotud käitumisele, kasutades peremees-patogeeni süsteemi (peremees: Reticulitermes chinensis; patogeen: Metarhizium anisopliae). Meie uuring hõlmas peamiselt kolme sotsiaalse immuunsuse uurimise aspekti: miRNA-de mõju (1) sotsiaalset immuunsust juhtivatele in vivo molekulidele; (2) käitumuslik kaitsereaktsioon, nagu liikumine seentega saastunud aladel, seentega saastunud pesakaaslaste poole püüdlemine ja kannibalism/matmine seentega saastunud surnukehade suunas; ja (3) füsioloogiline kaitsereaktsioon, nagu seenevastane toime. Lisaks testisime miRNA düsregulatsiooni mõju seentega saastunud termiitide suremusele, et hinnata miRNA-de mõju termiitide bioloogilisele kontrollile. Meie uuring näitas potentsiaalset mehhanismi, mis on aluseks käitumuslike ja füsioloogiliste haiguste kaitsemehhanismidele, ning uudsed eesmärgid kahjuritõrjeks.

cistanche tubulosa - parandab immuunsüsteemi

materjalid ja meetodid

Termiidid

Kõik meie uuringu eksperimentaalsed termiidid olid termiidi R. chinensis töötajad. Need koguti Hiinas Hubei provintsis Wuhani linnas asuvalt Shizi mäelt. Termiite kasvatati laboris väikeseid männiplokke sisaldavates plastmahutites (40 × 20 × 20 cm) temperatuuril 25 ± 1 kraadi, suhtelise õhuniiskuse juures 80% ja pimeduses 24 tundi.

Entomopatogeenid, saastunud termiidid ja surnukehad

Entomopatogeenset seent M. anisopliae (tüvi IBCCM321.93) kasvatati kartulidekstroosagaris (PDA) 2 nädalat temperatuuril 25 ± 1 kraadi, suhtelise õhuniiskuse juures 80% ja 24 tundi pimedas. Seenekoniidid suspendeeriti 1% Tween 80-ga ja säilitati temperatuuril 4 kraadi maksimaalselt 3–4 nädalat. Enne iga katset testiti koniidisuspensiooni idanemist. Leidsime, et termiitide saastamiseks kasutatud konidiaalse suspensiooni idanemismäär oli üle 90%. Seentega saastunud termiitide valmistamiseks saastati termiitide kõht pipeti (0,1–2,5 μL, Transferpette) abil 0,3 μl koniidisuspensiooni tilgaga (108 koniidi/ml). Seejärel asetati seenega saastunud termiidid kohe üheks tunniks külmkappi 4 kraadi juurde, et pärssida nende liikumist ja sadestada nende küünenahale seenkoniidid (Liu et al. 2015). Seentega saastunud surnukehade valmistamiseks koguti termiidid 1,5 ml tsentrifuugitorusse ja külmutati seejärel 20 sekundiks vedelas lämmastikus, et termiidid tappa. Surnukehad kasteti koniidisuspensiooni (108 koniidi/mL) ja asetati seejärel 0 ja 2 päevaks kultiveerimiseks niiske filterpaberiga steriilsesse Petri tassi (Sun et al. 2016).

dsRNA ja miRNA simulandi süntees

Dicer-1 fragment (1697 bp; lisamaterjal 1-tekst S1) amplifitseeriti spetsiifiliste praimeritega (edasi: 5'-CTG CGA CAG ATC ATT GCA CG-3'; tagurpidi: 5' -CAC TGG CTG TTT TGG CAC TC-3′) ja nende PCR tooted puhastati AxyPrepTM DNA Gel Extraction Kit (Axygen Scientific, USA) abil, mis klooniti pMD 18-T vektorisse (TaKaRa, Jaapan) ja seejärel transformeeriti DH5 keemiliselt pädeva raku abil (Tsingke Biotechnology, Hiina). Üks koloonia lüsogeense puljongi (LB) söötmest koos ampitsilliiniga saadeti Tsingke Biotechnology Co. Ltd.-le sekveneerimiseks. Järjestuse joondamine näitas, et meie fragment oli Dicer-1. T7 promootorjärjestus (5'-GGA TCC TAA TAC GAC TCA CTA TAG G-3') lisati Dicer-1 (519 bp; edasi: 5') amplifikatsioonipraimerite 5' otsa -GTG ATG CTG GAG TTG GGT TT-3′; Tagurpidi: 5′-AGA ATG AGT CGC CCA ATG TC-3′) ja GFP (467 bp; edasi: 5′-CTT GAA GTT GAC CTT GAT GCC-3′; Tagurpidi: 5′-TGG TCC CAA TTC TCG TGG AAC- 3′) dsRNA mallid (lisamaterjal 1-tekst S1). DsRNA matriitside PCR produktid ekstraheeriti hüdroksübenseeni/kloroformi/isoamüülalkoholiga (25:24:1) (Solarbio, Hiina). dsRNA genereeriti T7 RNAi transkriptsioonikomplekti (Vazyme Biotech, Hiina) abil ja seejärel puhastati hüdroksübenseeni/kloroformi/isoamüülalkoholiga (50:49:1) (Solarbio). Lõpuks hinnati dsRNA-d agaroosgeelelektroforeesi ja NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, USA) abil ning säilitati 80 kraadi juures.

miR-71-5 simulant oli väike kaheahelaline RNA, mis oli kujundatud vastavalt miR-71-5 järjestusele (21 nt, lisamaterjal 1-tekst S1). MiR-71-5 simulandi matriits koosnes kahest kaheahelalisest DNA-st, mis sisaldasid T7 promootorit: ühe genereeris oligonukleotiid A1 (5'-GAT CAC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT GAA AGA CAT GGG TAA TGA GAA A -3′) ja oligonukleotiid A2 (5′-TTT CTC ATT ACC CAT GTC TTT CAC CCT ATA GTG AGT CGT ATT AGT GAT C-3′), kasutades maandumis-PCR-i; teise genereerisid oligonukleotiid B1 (5'-GAT CAC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT CTC ATT ACC CAT GTC TTT CAA A-3') ja oligonukleotiid B2 (5'-TTT GAA AGA CAT GGG TAA TGA GAC CCT ATA GTG AGT CGT ATT AGT GAT C-3′), kasutades touchdown-PCR-i. Kontrollsimulant kavandati vastavalt GFP järjestusele (19 nt, lisamaterjal 1-tekst S1). Kontrollsimulandi matriitsi omandas ka kaks kaheahelalist DNA-d, mis sisaldasid T7 promootorit: ühe genereeris oligonukleotiid C1 (5'-GAT CAC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGG CAA GCT GAC CCT GAA GTT AA{33} }′) ja oligonukleotiid C2 (5'-TTA ACT TCA GGG TCA GCT TGC CCC TAT AGT GAG TCG TAT TAG TGA TC-3'), kasutades touchdown-PCR-i; teise genereerisid oligonukleotiid D1 (5'-GAT CAC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA ACT TCA GGG TCA GCT TGC AA-3') ja oligonukleotiid D2 (5'-TTG CAA GCT GAC CCT GAA GTT CCC TAT AGT GAG TCG TAT TAG TGA TC-3′), kasutades touchdown-PCR-i. MiR-71-5 ja kontroll-simulandid genereeriti T7 RNAi transkriptsioonikomplekti kasutades ja ekstraheeriti seejärel hüdroksübenseeni/kloroformi/isoamüülalkoholiga (50:49:1). Ekstrakti hinnati agaroosgeelelektroforeesi ja NanoDrop 2000 abil ning säilitati temperatuuril -80 kraadi.

Tistanche kasulikud omadused meestele - tugevdavad immuunsüsteemi

dsRNA toitmine

Termiite näljutati enne toitmist 12 tundi (Zhou et al. 2008; Hamilton ja Bulmer 2012). Kokku 18 termiiti pandi Petri raku tassi (D =35 mm) koos filterpaberi tükiga (D =18 mm), mida niisutati 60 µl RNaasivaba veega, mis sisaldas 80 ug. dsDicer-1, 80 ug dsGFP, 60 ug miRNA simulant või 60 ug kontrollmudelant. Dicer-1 dsRNA toitmise biotestide jaoks lasti termiitidel enne katseid 24 tundi niisutatud paberit alla neelata. GFP-ga töödeldud termiite peeti kontrollideks. MiRNA simulandiga toitmise biotestide jaoks lasti termiitidel enne katseid 48 tundi niisutatud paberit alla neelata. Kontroll-simulandiga töödeldud termiite peeti kontrollideks.

RT-qPCR

Geeniekspressiooniks kasutati RT-qPCR abil viit või kuut replikatsiooni kolmest kolooniast. Kolm termiiti korduse kohta töötlemise kohta ühendati RNA täielikuks ekstraheerimiseks, kasutades Direct-zol™ RNA Miniprep komplekti (Zymo Research, USA). Ekstraheeritud RNA puhtus ja kontsentratsioon määrati NanoDrop 2000 abil. RNA konverteeriti cDNA-ks, kasutades PrimeScript™ RT reaktiivikomplekti koos gDNA kustutuskummiga (Perfect Real Time) (Takara, Jaapan). RT-qPCR viidi läbi QuantStudio™ 3 reaalajas PCR süsteemiga (Thermo Scientific), kasutades ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix (Vazyme Biotech). Konkreetsed praimerid on loetletud lisamaterjali 2-tabelis S1.

miRNA kontsentratsioon

MiRNA-de kontsentratsiooni määramiseks kasutati kolme koloonia kuut kordust, kasutades MiPure Cell/Tissue miRNA komplekti (Vazyme Biotech, Hiina). MiRNA-de jaoks ühendati kolm termiiti korduse kohta ravi kohta. Ekstraheeritud miRNA-de puhtus ja kontsentratsioon määrati NanoDrop 2000 abil.

De novo sekveneerimine ja transkriptsioonianalüüs

Fifteen termites from three colonies per treatment were pooled for total RNA extraction using TRIzol Reagent (Invitrogen Life Technologies, USA). The concentration, quality, and integrity of the total RNA were determined using a NanoDrop spectrophotometer (Thermo Scientific). Sequencing libraries were generated using the TruSeq Stranded mRNA Sample Prep Kit (Illumina, USA) and sequenced on a HiSeq platform (Illumina) by Shanghai Personal Biotechnology Cp. Ltd. (China). Sequencing data were filtered by Cutadapt (v1.15) software. For the transcriptome sequencing project without a reference genome, Trinity (v2.5.1) software was used to montage clean reads for the transcripts for later analysis. NR (NCBI non-redundant protein sequences), GO (Gene Ontology), KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genome), Egg NOG (Evolutionary genealogy of genes: Non-supervised Orthologous Groups), and Swiss-Prot databases were used for gene functional annotation. Furthermore, DESeq (1.30.0) was used to analyze the differentially expressed genes under the condition of |log2FoldChange(FC)|>1 ja p<0.05. The genes were then mapped to GO terms, and the terms with significant enrichment were calculated by hypergeometric distribution under the condition of p<0.05 to reveal the possible functions of the candidate genes. Additionally, the genes were mapped to KEGG pathways to determine their possible functions. 

cistanche tubulosa - parandab immuunsüsteemi

Liikumine

Analüüsiti üheksat kordust kolmest kolooniast, et võrrelda Dicer{0}}vaigistatud ja GFP-ga töödeldud termiitide liikumiskaugust. Pärast dsDicer-1 või dsGFP ühepäevast suukaudset söötmist pandi üks termiit korduse kohta töötlemise kohta uude raku-Petri tassi (D =90 mm) koos koniidisuspensiooniga niisutatud filterpaberitükiga. (108 koniidi/ml). Seejärel kasutasime musta markerit, et jälgida termiidi liikumist läbipaistval kaanel 10 sekundi jooksul. Liikumiskaugust mõõdeti ruudustikpaberiga (1 × 1 mm).

Hoolitsemine

Analüüsiti üheksat koopiat kolmest kolooniast, et võrrelda Dicer{0}}vaigistatud ja GFP-ga töödeldud termiitide hoolduskäitumiste arvu. Pärast ühepäevast suukaudset söötmist dsDicer-1 või dsGFP-ga pandi kolm termiiti iga korduse kohta töötlemise kohta uude raku-Petri tassi (D =35 mm) koos niisutatud filterpaberi tükiga (D{{). 4}} mm) ja seejärel saastunud seente koniididega (108 koniidi/mL). Käitumist salvestati 15 minuti jooksul HD-digitaalkaameraga (SONY, Jaapan). Videoid skanniti iga 10 sekundi järel, et jälgida, kas seentega saastunud termiitide vahel toimus hoolduskäitumine (termiitide suud pesakaaslaste kehade poole).

Kannibalism

Kolmest kolooniast pärit üheksat kordust analüüsiti Dicer{{0}} ja GFP mõju suhtes kannibalistlikule käitumisele seentega saastunud surnukehade suhtes. Kuus termiiti iga korduse kohta ühe ravi kohta asetati raku-Petri tassi (D=35 mm) niiske filterpaberi tükiga (D=18 mm), mis sisaldas dsDicer-1 või dsGFP-d. Neile lubati üks päev dsRNA-d suukaudselt toita ja seejärel asetati üks seentega saastunud surnukeha, mida inkubeeriti 0 päeva, raku-Petri tassi, kus kuus töödeldud termiiti kasvatati. Pärast ühepäevast kooskasvatamist söödi seenega saastunud surnukeha kas täielikult ära (kõrge testiskoor{8}}), söödi osaliselt (madal testiskoor=1) või ei söödud (testi tulemust polnud{10) }}) (Täiendav materjal 1-Joon. S1) kuue termiidi poolt.

Matmine

Kahest kolooniast pärit üheksat kordust analüüsiti Dicer-1 vs. GFP mõju osas seentega saastunud surnukehade matmiskäitumisele. Kuus termiiti iga korduse kohta ühe ravi kohta asetati raku-Petri tassi (D=35 mm) niiske filterpaberi tükiga (D=18 mm), mis sisaldas dsDicer-1 või dsGFP-d. Neile lubati üks päev dsRNA-d suukaudselt toita. Seejärel inkubeeriti ühte seentega saastunud surnukeha 2 päeva ja Petri tassile, milles kuus töödeldud termiiti kasvatati, lisati mulda. Pärast ühepäevast kooskasvatamist maeti seenega saastunud surnukeha kas täielikult (kõrge testiskoor=2), osaliselt (madal testiskoor=1) või ei maetud (katsetulemus puudub{10). }}) (Täiendav materjal 1-Joon. S2) kuue termiidi poolt.

Seenevastane toime

Kolmest kolooniast pärit kuut kordust analüüsiti Dicer{{0}} ja miR-71-5 mõju osas termiitide võimele pärssida seente kasvu. Viis termiiti töötluse korduse kohta ühendati ja purustati vedela lämmastikuga ning seejärel lahustati 100 μL 0,9% soolalahuses. Homogenaati tsentrifuugiti 6000 x g juures viis minutit 4 kraadi juures, et saada 80 µl supernatanti. Seejärel tsentrifuugiti supernatanti uuesti, et saada 50 µl supernatanti. Seenevastase toime jaoks kasutati 96-süvendiga mikroplaati proovide, kasvukontrollide ja standardsete tühikatsete neeldumise mõõtmiseks, et arvutada seente kasvu vähenemine: (1) 50 μL kartulidekstroosi (PD), 2 Proovi jaoks segati μl seenkoniidide (108 koniidi/mL) ja 5 μl supernatanti süvendi kohta; (2) 50 μL kartulidekstroosi (PD), 2 μL seenkoniidide (108 koniidi/mL) ja 5 μL 0,9% soolalahust süvendi kohta segati seente kasvu kontrollimiseks; (3) 50 µl kartulidekstroosi (PD) ja 7 µl 0,9% soolalahust segati standardse tühikatse kohta. Pärast 24-tunnist kultiveerimist konstantse temperatuuriga loksutis (150 pööret minutis 25 ± 1 kraadi juures) viidi läbi mõõtmine mikroplaadi spektrofotomeetriga (600 nm; Thermo Scientific).

Ellujäämine

Et määrata dsDicer{0}} suukaudse söötmise mõju termiitide ellujäämisele, kasutati kolmest kolooniast pärit termiite, et määrata Dicer-1-vaigistatud (kokku 42 termiiti, 14 termiiti koloonias) ja GFP- töödeldud (kokku 42 termiiti, 14 termiiti koloonias) seentega saastumise ajal. Kontrollide jaoks kasutati 56 termiiti kahest kolooniast, et määrata vaigistatud Dicer{8} (kokku 28 termiiti, 14 termiiti koloonias) ja GFP-ga töödeldud termiiti (kokku 28 termiiti, 14 termiiti koloonias). Katsete läbiviimisel kasvatati seitset termiiti raku-Petri tassis (D =35 mm) filterpaberitükiga (D =18 mm), mis oli niisutatud RNaasivaba veega, mis sisaldas dsDicer{{17}. } või dsGFP, samas kui termiidid olid seentega saastunud ja neid kasvatati seejärel kümme päeva, et nende ellujäämist igapäevaselt jälgida. Et teha kindlaks miR-71-5-simulandi suukaudse söötmise mõju termiitide ellujäämisele, kasutati kolme koloonia termiite, et määrata miR-71-5 (kokku 42 termiiti, 14 termiiti koloonias) ja kontrolli ( Kokku 42 termiiti, 14 termiiti koloonias) simulandiga töödeldud termiite seensaastumise ajal. Lisaks kasutati 56 termiiti kahest kolooniast, et määrata miR- 71-5 (kokku 28 termiiti, 14 termiiti koloonias) ja kontrolltermiiti (kokku 28 termiiti, 14 termiiti koloonias) simulandiga töödeldud termiitide ellujäämise määramiseks. Katsete läbiviimisel kasvatati seitset termiiti raku-Petri tassis (D=35 mm) filterpaberitükiga (D=18 mm), mis oli niisutatud miR{{35} sisaldava RNaasivaba veega. } simulant või kontrollmudel. Pärast kahepäevast suukaudset toitmist olid termiidid seentega saastunud ja neid kasvatati kümme päeva, et igapäevaselt jälgida nende ellujäämist. Surnud termiidid eemaldati õigeaegselt.

Statistiline analüüs

Kõik andmeanalüüsid viidi läbi IBM SPSS-i versioonis 19. Shapiro-Wilki testi kasutati selleks, et tuvastada, kas andmekogumid olid normaalselt jaotunud. Arvestades, et geeniekspressiooni, kannibalismi ja matmisandmed olid ebanormaalselt jaotunud, kasutati Wilcoxoni testi. Teise võimalusena jaotati tavaliselt andmed miRNA kontsentratsiooni, liikumise, hoolduse ja seenevastase aktiivsuse kohta ning kasutati paaris-t-testi. Ellujäämist analüüsiti Kaplan-Meieri meetodil eluea jaoks erinevates ravitingimustes. Olulisuse tase oli p<0.05 in this study.

Tulemused

Dicer-1-ga vaigistatud termiitide mRNA ekspressiooniprofiil

Dicer{{0}} mõju määramiseks termiitide geeniekspressiooniprofiilile viidi läbi Dicer-1-vaigistatud termiitide mRNA sekveneerimine. Pärast 1-päevast dsDicer-1 suukaudset söötmist ilmnes Dicer-1 ekspressioon (joonis 1A; n=6, p < 0,05; Wilcoxoni test) ja seega ka miRNA kontsentratsioon (joonis 1B; df =5, lk<0.05; paired t-test) were significantly decreased in termites. A total of 1262 mRNAs were significantly altered in the whole bodies of Dicer-1-silenced termites (upregulated: 562 mRNAs; downregulated: 700 mRNAs; Fig. 1C and Supplementary material 2-Table S2). The differentially expressed genes (DEGs) were mapped to the salivary secretion, glycolysis, citrate cycle, and 29 other KEGG pathways (Fig. 1D–F and Supplementary material 2-Table S3). In addition, the DEGs were clustered into the ATP generation from ADP, structural constituent of the cuticle, defense response, glutathione transferase activity, oxidation–reduction process, and 171 other GO terms (Fig. 2 and Supplementary material 2-Table S4).

Joonis 1. Geeniekspressiooni profiil Dicer-1-litsentseeritud termiitide kogu kehas. Dicer-1 väljend. Andmed on näidatud kui keskmine ± SEM. *lk<0.05. B The concentration of miRNAs. The data are shown as the mean±SEM. *p<0.05. C The number of diferentially expressed genes (DEGs). D The DEGs mapped to salivary secretion. ATP1B, Sodium/potassium-transporting ATPase subunit beta; ATP2B, Plasma membrane calcium-transporting ATPase 1; PKC, Protein kinase C alpha type; CALM, Calmodulin-like protein; LYZ, Lysozyme C. E The DEGs mapped to glycolysis. GPI, Glucose-6-phosphate isomerase; PFKC, ATP-dependent 6-phosphor fructokinase; TIM, Triosephosphate isomerase; GAPDH, Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase; PGK, Phosphoglycerate kinase; MINPP1, Multiple inositol polyphosphate phosphatase 1; GPMA, 2,3-bisphosphoglycerate-dependent phosphoglycerate mutase; ENO, Enolase. F DEGs mapped to citrate cycle. PCK, phosphoenolpyru vate carboxykinase [GTP]; PYC, pyruvate carboxylase; MDH1, malate dehydrogenase; SUCD, succinate–CoA ligase [ADP-forming]. Red letters indicate upregulation; blue letters indicate downregulation

Joon. 2 Soojuskaardid DEGs rühmitatud kaitsega seotud GO mõisteid. ATP põlvkond ADP-st. B Küünenaha struktuurne koostisosa. C Kaitsereaktsioon. D Glutatioontransferaasi aktiivsus. E Oksüdatsiooni-redutseerimise protsess

mRNA-seq DEG-de RT-qPCR kontrollimine

Glükolüüs, tsitraaditsükkel ja ATP teke ADP-st olid seotud süsivesikute ja energia metabolismiga, milles kaheksa DEG-d (glütseraldehüüd{0}}fosfaatdehüdrogenaas, 2,3-bisfosfoglütseraadist sõltuv fosfoglütseraadi mutaas, enolaasi, triosefosfaadi isomeraasi, ATP-sõltuva 6-fosfofruktokinaasi, fosfoenoolpüruvaadi karboksükinaasi [GTP], suktsinaat-CoA ligaasi [ADP-d moodustav] alfa-2 ja malaatdehüdrogenaasi) reguleerimine kontrolliti pärast seda, kui Diceri tase on oluliselt vähenenud. -1 vaigistamine (joonis 3A–H; n=6, p < 0,05; Wilcoxoni test), mis viitab glükolüüsi, tsitraaditsükli, ATP tekke ja seega ka süsivesikute ja energia metabolismi häiretele kogu kehas Dicer{12}}vaigistatud termiitidest. DEG-d (defensiin ja terminitsiin) kaitsereaktsioonis kodeeritud AMP-des. Nende geenide ekspressioon oli märkimisväärselt suurenenud Dicer-1-vaigistatud termiitidel võrreldes GFP-ga töödeldud termiitidega (joonis 3I, J; n=5 või 6, p<0.05; Wilcoxon test). In the oxidation–reduction process, cytochrome P450 9e2 and peroxiredoxin-4 were significantly altered after Dicer-1 silencing in termites (Fig. 3K, L; n = 6, p<0.05; Wilcoxon test). These results implied an important effect of Dicer-1 on the immune response and oxidation–reduction reaction in whole-body of the termites. The effect of Dicer‑1 on behavioural disease defences in termite groups 

Et teha kindlaks Diceri{0}} mõju käitumuslikule reaktsioonile seensaastusele, testisime Diceri-1-vaigistatud termiitidel nelja olulist käitumiskaitset – liikumist, hooldust, kannibalismi ja matmist. Meie tulemused näitasid, et liikumine (joonis 4A, t=7.013, df=8, p<0.01; paired t-test; Supplementary material 1-Fig. S3 and Video S1), grooming (Fig. 4B, t=5.949, df=8, p<0.01; paired t-test; Supplementary material 1-Fig. S4 and Video S2), cannibalistic (Fig. 4C, n =9, p<0.05; Wilcoxon test; Supplementary material 1-Fig. S1 and Video S3) and burial (Fig. 4D; n=9, p<0.05; Wilcoxon test; Supplementary material 1-Fig. S2 and Video S4) behaviors were significantly reduced in Dicer-1-silenced termites compared to GFP-treated termites, suggesting an important role of Dicer-1 in driving behavioral disease defenses in termite colonies.

Joonis 3 mRNA-seq DEG-de RT-qPCR kontrollimine. A-H Süsivesikute ja energia metabolismiga seotud geenid. I-J Immuunvastusega seotud geenid. K-L Oksüdatsiooni-redutseerimisreaktsioonidega seotud geenid. Andmed on näidatud kui keskmine ± SEM. *lk<0.05

Dicer-1 ja miR-71-5 mõju termiitide seenevastastele võimetele

Et teha kindlaks miRNA-de mõju füsioloogilisele reaktsioonile seensaastusele, testisime Dicer{0}}vaigistatud termiitide kogu seenevastast toimet. Meie tulemused näitasid, et seenevastane toime oli oluliselt vähenenud (joonis 5A; t=−3,046, df=5, p<0.05; paired t-test) in Dicer-1-silenced termites. Furthermore, miR-71-5 was selected for further testing to determine its role in physiological defense, which was chosen according to the comparative profiling of miRNAs and mRNAs in fungus-contaminated versus naive termites and miRNA-mRNA analysis (data unpublished). We found that the antifungal activity (Fig. 5B; t=−4.000, df=5, p<0.05; paired t-test) was significantly reduced in termites treated with miR-71-5 simulants compared to those treated with simulant controls. These results suggested that miRNAs played an important role in driving physiological disease defenses in termites.

Joon. 4 MiRNA düsregulatsiooni mõju kaitsvatele sotsiaalsetele käitumistele termiidirühmades. Diceri liikumine, B hooldamine, C kannibalistlik ja D matmiskäitumine{1}}vaigistatud võrreldes GFP-ga töödeldud termiidirühmadega. Andmed on näidatud kui keskmine ± SEM. *lk<0.05, **p<0.01

Joonis fig 5 miRNA düsregulatsiooni mõju termiitide indiviidide füsioloogilisele kaitsele. Dicer{1}}vaigistatud vs. GFP-ga töödeldud termiitide seenevastane toime. B MiR-71-5 seenevastane toime võrreldes simulantidega töödeldud termiitidega. Andmed on näidatud kui keskmine ± SEM. *lk<0.05

Dicer-1 ja miR-71-5 mõjutasid seentega saastunud termiitide ellujäämist

Kuna nii dsDicer-1 kui ka miR-71-5 simulandid vähendasid termiitide seenevastast aktiivsust, testisime nende potentsiaali termiitide bioloogiliseks tõrjeks. Leidsime, et seentega saastunud Dicer-1-vaigistatud termiitide elulemus vähenes oluliselt võrreldes teiste ravitud termiitidega (dsDicer-1+seen vs. dsGFP+seen: χ2=81.839, lk<0.001; dsDicer-1+fungus vs dsDicer-1+Tween 80: χ2=63.070, p<0.001; dsDicer-1+fungus vs dsGFP+Tween 80: χ2=65.474, p<0.001). GFP-treated termites contaminated with fungus showed significantly decreased survival compared to the termites without fungal contamination (dsGFP+fungus versus dsDicer-1+Tween 80: χ2=58.636, p<0.001; dsGFP+fungus versus dsGFP+Tween 80: χ2=68.849, p<0.001). There was no significant difference between dsDicer-1- and dsGFP-treated termites without fungal contamination (χ2=2.037, p=0.154) (Fig. 6A). Additionally, the survival of fungus-contaminated termites treated with the miR- 71-5 simulant was signifcantly decreased compared to that of other treated termites (miR-71-5+fungus vs. control+fungus: χ2=63.593, p<0.001; miR-71-5+fungus vs. miR- 71–5+Tween 80: χ2=60.585, p<0.001; miR-71-5+fungus vs. control+Tween 80: χ2=67.129, p<0.001). The survival of fungus-contaminated termites treated with the simulant control was significantly decreased compared to that of the termites without fungal contamination (control+fungus vs. miR-71-5+Tween 80: χ2=61.065, p<0.001; control+fungus vs. control+Tween 80: χ2=68.064, p<0.001). There was no significant difference in survival between termites treated with the miR-71-5 simulant and simulant control without fungal contamination (miR-71-5+Tween 80 vs. control+Tween 80: χ2=1.000, p=0.317) (Fig. 6B). These results suggested a good effect of miRNAs coupled with entomopathogens in biologically controlling termites.

Arutelu

miRNA-d täidavad mitmeid funktsioone, näiteks reguleerivad süsivesikute ja energia metabolismi, immuunvastust, oksüdatsiooni-redutseerimisreaktsioone ja muid eluprotsesse termiitide terves kehas. Ootuspäraselt põhjustas termiitidele allaneelatud dsDicer-1 Dicer-1 vaigistamise ja seejärel vähendas miRNA kontsentratsiooni, mis viitab miRNA düsregulatsiooni edukale esilekutsumisele. Transkriptsioonianalüüs näitas, et Dicer{2}} vaigistamine oli seotud 32 KEGG raja ja 175 GO terminiga. Sotsiaalsetes putukate kolooniates võib süljesekret toimida välise desinfitseerimisvahendina ja toimida koos sotsiaalse käitumisega, nagu trofallaksia, hooldamine ja pesitsemine, et hoolitseda järglaste, pesakaaslaste ja kolooniate eest (Bulmer et al. 2009; Hamilton jt 2011). Hamilton ja Bulmer 2012). Glükolüüs, tsitraaditsükkel ja ADP tootmine ADP-st on seotud süsivesikute ja energia metabolismiga. Kuna immuunvastuste tugevdamine ja sotsiaalse käitumise elluviimine on energeetiliselt kulukas, mõjutavad süsivesikute ja energia metabolismi häired neid protsesse negatiivselt (Liu et al. 2020; Hassan jt 2021a, b; Xu jt 2021a, b). Küünenaha struktuurne koostisosa seostub putukate küünenahaga, moodustades esimese barjääri, mis takistab patogeenide tungimist hemocoeli (Syazwan et al. 2021). Mitmed kaitsereaktsioonis, glutatioontransferaasi aktiivsuses ja oksüdatsiooni-redutseerimise protsessis osalevad DEG-d on võimelised kodeerima antimikroobseid peptiide (AMP), detoksifitseerimisvalke ja antioksüdantseid ensüüme, et suurendada putukate resistentsust ja tolerantsust patogeenide suhtes (Liu et al. 2015, 2019a). Need kaitsega seotud funktsioonid aitavad tõenäoliselt kaasa sotsiaalsele immuunsusele termiitide kolooniates. Ülejäänud KEGG rajad ja GO terminid olid seotud närvisüsteemi, seedesüsteemi, pikaealisuse, arenguga jne (täiendav materjal 2-tabel S3 ja S4). Lisaks pärinesid Dicer{17}} vaigistatud termiitide mõned DEG-d (nt süsivesikute ja energia metabolismi geenid) mikroobidest (täiendav materjal 2-tabel S2), mis võivad olla soolestiku sümbiontid ja võivad olla olulised komponendid. osalemine peremeeste eluprotsessides. Seetõttu avaldavad miRNA-d tõenäoliselt globaalset mõju termiidi kogu kehale.

Joonis 6 miRNA düsregulatsiooni mõju seentega saastunud termiidirühmade ellujäämisele. Dicer{2}}vaigistatud vs. GFP-ga töödeldud termiitide ellujäämine koos või ilma seenreostuseta; B MiR-71-5 ellujäämine võrreldes simulandiga töödeldud kontrolltermiitidega koos seentega või ilma. Erinevad tähed tähistavad olulisi erinevusi, lk<0.05

Süsivesikute ja energia metabolism, immuunvastus ja oksüdatsiooni-redutseerimisreaktsioonid on miRNA-de jaoks sotsiaalse immuunsuse suurendamisel olulised. Loomade käitumine on energiast sõltuv protsess ja seetõttu põhjustavad mõned energiainhibiitorid loomi aeglaselt ja isegi surevad (Davidson 1930; Schuler ja Casida 2001). Termiitide kolooniates põhjustavad glükolüüsi või tsitraaditsükli häired ATP taseme langust ja pärsivad liikumiskäitumist (Hassan et al. 2021a, b; Xu jt 2021a, b). Tsitraaditsükli häired vähendavad ka termiitide seenevastast aktiivsust, mis suurendab nakatumist ja suremust (Liu et al. 2020). Lisaks, kuna teatati, et termiitide soolestikus olevad sümbiondid osalevad peremeesorganismi haiguste kaitses, pakkudes ensüüme (Rosengaus et al. 2014) ja metaboliite (Inagaki ja Matsuura 2018), vähendasid soolestiku sümbiontide ainevahetushäired tõenäoliselt sümbiontidest tulenevat immuunpädevust. ja seega vähenenud kaitsevõime termiitide vastu. Meie uuringus leiti, et kaheksa metaboolset geeni on oluliselt alareguleeritud, mis viitab glükolüüsi ja tsitraaditsükli häiretele Dicer{{9}summutatud termiitide kogu kehas. Soovitasime, et miRNA-vahendatud süsivesikute ja energia metabolism oli oluline biokeemiline mehhanism sotsiaalse immuunsuse suurendamisel ning selle protsessi katkestamine vähendas tõenäoliselt termiitide kolooniate käitumist ja füsioloogilisi haigusi. Putukate immuunsüsteem indutseerib suure hulga efektormolekule, et võidelda patogeenidega in vivo. Defensiinid on kompaktsed, tsüsteiinirikkad ja proteaasiresistentsed AMP-d, millel on laia toimespektriga toime bakterite, seente ja muude parasiitide vastu (Weber 2021). Termitsiin on termiidispetsiifiline seenevastane defensiin, mille vaigistamine vähendab seenevastast toimet ja suurendab seega seentega saastunud termiitide suremust (Hamilton ja Bulmer 2012). Putukate detoksikatsiooni- ja antioksüdantide süsteemid toimivad sageli koos immuunsüsteemiga, mis vähendab tõhusalt toksiinide ja ROS-i riski peremees-patogeeni interaktsioonide ajal (Syazwan et al. 2021). Tsütokroom P450 monooksügenaasid vastutavad patogeensete toksiinide oksüdatsiooni ja metabolismi katalüüsimise ning vabade radikaalide ehk ROS-i tootmise eest (Shankar ja Mehendale 2014). Peroksiredoksiini perekonda kuuluvad antioksüdatiivsed ensüümid, mis katalüüsivad ROS-i redutseerimist (Xu et al. 2021a; b). Meie tulemused kinnitasid, et Dicer-1 vaigistamine muutis oluliselt defensiini, tritsiini, tsütokroom P450 9e2 ja peroksiredoksiini-4 geeniekspressiooni, mis näitab, et miRNA-d mängisid olulist rolli immuunvastuse ja immuunvastuse reguleerimisel. oksüdatsiooni-redutseerimisreaktsioonid kogu termiidi kehas. Seetõttu soovitame, et süsivesikute ja energia metabolism, immuunvastus ja oksüdatsiooni-redutseerimisreaktsioonid võivad osaleda miRNA-kujulise sotsiaalse immuunsuse juhtmehhanismis ning nende katkemine võib termiitide kolooniate sotsiaalset immuunsust negatiivselt mõjutada.

cistanche tubulosa - parandab immuunsüsteemi

Tõepoolest, miRNA düsregulatsioonil on negatiivne mõju liikumisele ja seega ka käitumuslikule kaitsele termiitide kolooniates. Erinevalt üksikutest putukatest on sotsiaalsed putukad arendanud välja rikkaliku käitumise kaitsemehhanismide repertuaari, avastades ühiselt patogeenide olemasolu, piirates patogeenide levikut ja vähendades isendite nakatumisriski (Van Meyel et al. 2018; Liu jt 2019a). Vanemad töötajad täidavad ohtlikke pesaväliseid ülesandeid ja on kergesti saastunud. Kui nad on saastunud, kipuvad pesakaaslased saastunud töötajate poole ühinema ja neid peibutama (Liu et al. 2019b). Nii saastunud töötajad kui ka nende hooldajad suurendavad kaugust ülejäänud naiivsetest pesakaaslastest. Õdede töötajad viivad haudmed sügavamale koloonia sügavusse, et suurendada kaugust saastunud töötajatest (Stroeymeyt et al. 2018). Need tulemused näitavad, et koloonialiikmete vahelise füüsilise kauguse suurendamine on tõhus strateegia patogeenide leviku piiramiseks [nimetatakse organisatsiooniliseks immuunsuseks (Liu et al. 2019a)] ning liikumine peaks olema oluline sotsiaalne käitumine, kuna see kohandab adaptiivselt patogeenide levikut. vahemaa saastunud isendite ja naiivsete pesakaaslaste vahel. Hassan ja tema kolleegid leidsid, et termiidid suurendasid oluliselt oma liikumist seentega saastumise ajal, näidates veelgi liikumist vastusena patogeenidele (Hassan et al. 2021a, b). Lisaks on saastunud isendite ja surnukehade haldamisel sotsiaalsetes putukate kolooniates hästi tuntud hooldus-, kannibalistlik- ja matmiskäitumine. Seentega saastunud termiitide puhul toimub hoolduskäitumine vahetult enne idanemist (Liu et al. 2019b). Seevastu kannibalistlik käitumine ilmneb alles pärast seda, kui saastunud isikud jäävad nähtavalt haigeks (Davis et al. 2018). Surnukehade haldamisel peetakse värskeid surnukehasid sageli toiteväärtuseks ja kutsuvad esile kannibalismi, andes märku varajasest surmast. Seevastu lagunenud surnukehasid peetakse nakkusriskiks ja need kutsuvad esile matmise, tekitades hilise surma märke (Sun et al. 2016). Siin avastasime, et Dicer{12}} vaigistamine pärssis oluliselt liikumist ja muid liikumisi, nagu peibutamine, kannibalistlik ja matmiskäitumine, mis viitab sellele, et miRNA düsregulatsioon avaldas üldist mõju termiitide liikumisele ja mõjutas järelikult käitumuslikku kaitset patogeenide, patogeenide vastu. saastunud pesakaaslased ja patogeenidega saastunud surnukehad termiitide kolooniates. Juhtmehhanismi jaoks võib miRNA vahendatud süsivesikute ja energia metabolismi pidada üheks olulisemaks biokeemiliseks teguriks (vt ülaltoodud arutelu). Seetõttu võivad miRNA-d kujundada termiitide käitumuslikku kaitset.

miRNA düsregulatsioonil oli negatiivne mõju ka termiitide füsioloogilisele kaitsevõimele. Termiidid suurendavad tavaliselt oma seenevastast võimet immuungeenide ülesreguleerimisega, et tugevdada nende füsioloogilist kaitsevõimet (Liu et al. 2015). Soolestiku sümbiontidest saadud seenevastased ained annavad termiitidele võime pärssida seente kasvu, et tugevdada nende füsioloogilist kaitsevõimet (Rosengaus et al. 2014). Seetõttu oli kogu seenevastane aktiivsus termiitide füsioloogilise kaitsevõime tõhus näitaja. Hiljutised uuringud näitasid, et mitte ainult immuungeenid, vaid ka süsivesikute ainevahetus ja antioksüdantsed geenid olid olulised komponendid, mis mõjutavad termiitide seenevastast toimet (Liu et al. 2020; Zhao jt 2020; Zhou jt 2021). Defauneeritud termiidid olid seente saastumise suhtes haavatavamad (Rosengaus et al. 2014). Kuigi immuungeenide, nagu defensiini ja tritsiini, ekspressioonid suurenesid, vähendas Dicer-1-vahendatud miRNA düsregulatsioon süsivesikute metabolismi ja antioksüdantsete geenide ekspressiooni termiitides või soolestiku sümbiontides ning vähendas seega oluliselt termiitide kogu seenevastast toimet. Lisaks vähenes miR-71-5-simulandiga töödeldud termiitide kogu seenevastane toime, mis viitab veelgi miRNA düsregulatsiooni negatiivsele mõjule termiitide füsioloogilisele kaitsevõimele. Lisaks olid termiidirühmad, kellele toideti kas dsDicer-1 või miR-71-5 mudelainet, seensaaste suhtes haavatavamad, mis näitab infektsioonide suremuse suurenemist. Seetõttu võivad miRNA-d kujundada sotsiaalset immuunsust, juhtides termiitide kolooniates nii käitumuslikku kui ka füsioloogilist haiguskaitset.

Joonis 7 Termiitide kolooniate sotsiaalse immuunsuse aluseks olevad potentsiaalsed mehhanismid ja bioloogilise kahjuritõrje uued sihtmärgid. miRNA-d mõjutavad laialdaselt kogu termiitide keha, sealhulgas A-süsivesikute ja energia metabolismi, B-immuunvastust, C-oksüdatsiooni-redutseerimisreaktsioone jne. D Süsivesikute ja energia metabolismil on teadaolevalt oluline roll termiitide käitumise ja seenevastase aktiivsuse reguleerimisel. Seetõttu oli miRNA-vahendatud süsivesikute ja energia metabolism tõenäoliselt üks geneetilisi ja biokeemilisi tegureid, mis juhivad termiitide kolooniates käitumist (nagu liikumine, hooldamine, kannibalism ja matmine) ja füsioloogilisi (seenevastane aktiivsus) kaitsemehhanisme. E Immuunvastus aitas termiitidel pärssida patogeenide paljunemist ja levikut kehaõõnes. Oksüdatsiooni-redutseerimise reaktsioon kaitses termiite toksiinide ja ROS-i tekitatud kahjustuste eest peremees-patogeeni vastastikmõjude eest. Seetõttu mängib miRNA-vahendatud immuunvastus ja oksüdatsiooni-redutseerimisreaktsioon olulist rolli termiitide füsioloogilise haiguste kaitse juhtimisel. F miRNA-d kujundasid sotsiaalset immuunsust, juhtides termiitide kolooniates käitumis- ja füsioloogilisi haiguskaitseid. Sihtides miRNA-sid, saaksime kunstlikult suurendada termiitide kolooniate vastuvõtlikkust entomopatogeenide suhtes ja seega tõhustada termiitide bioloogilist kontrolli.

Meile teadaolevalt on see esimene aruanne sotsiaalse immuunsuse aluseks olevate miRNA-de potentsiaalsest mehhanismist termiitide kolooniates. miRNA-d võivad mõjutada sülje sekretsiooni, süsivesikute ja energia metabolismi, küünenaha teket, immuunvastuseid, oksüdatsiooni-redutseerimisreaktsioone jne. Nende hulgas on süsivesikute ja energia metabolism tõenäoliselt oluline biokeemiline tegur käitumise kaitsemehhanismide, nagu liikumine, hooldus, kannibalism, juhtimisel, ja matmine termiitide kolooniatesse. Lisaks osalevad süsivesikute ja energia metabolism, immuunvastus ja oksüdatsiooni-redutseerimisreaktsioonid tõenäoliselt termiitide füsioloogilistes kaitsemehhanismides, näiteks seenevastases aktiivsuses.

Seetõttu võib miRNA-kujuline sotsiaalne immuunsus mõjutada termiitide kolooniate vastuvõtlikkust entomopatogeensete seente suhtes; seega võivad miRNA-d olla termiitide bioloogilise tõrje tõhusad sihtmärgid (joonis 7). Arvukad uuringud on tõestanud, et sihtgeenide RNAi-vahendatud vaigistamine võib viia putukate surmani, millel on märkimisväärne potentsiaal putukate kahjuritõrjeks. Termiitide kahjuritõrjes on Zhou et al. (2008) olid kõigepealt suunatud endoglükanaasi ja heksameeride geenidele dsRNA söötmise kaudu, näidates RNAi-põhiste termititsiidide teostatavust. Surmava toime suurendamiseks termiitide kolooniates on kasutatud RNAi-põhiseid termitsiide, mis on ühendatud nakkuslike entomopatogeensete seentega. Tritsiini, GNBP2, TG, IDH ja teiste kodeerivate geenide RNAi-vahendatud vaigistamine koos Metarhiziumiga võib märkimisväärselt suurendada pesakaaslaste vastuvõtlikkust sotsiaalselt ülekantud seenkoniidide suhtes ja seega suurendada infektsioonide suremust (Hamilton ja Bulmer 2012; Liu et al. 2020; Zhao jt 2020; Zhou jt 2021). Oma uuringus näitasime väikeste mittekodeerivate RNA-de sihtimise teostatavust söötmise kaudu, et optimeerida termiitide bioloogilist kontrolli Metarhiziumi abil. Võrreldes spetsiifiliselt geenile suunatud dsRNA-dega, suutsid miRNA-d sihtida mitmeid samade või erinevate funktsioonidega geene, avaldades seega laia spektrit mõju termiitide eluprotsessidele. Seetõttu näitasid termiitide rühmad miRNA-de sihtimisel vähenenud käitumis- ja füsioloogilisi haiguskaitseid nii rühma kui ka üksikisiku tasandil, mis viitab termiitide sotsiaalse immuunsuse laia spektriga pärssimisele. MiRNA-sid sihtides näitasid termiitide rühmad seentega saastumise ajal kõrget suremust, mis viitab sellele, et miRNA-sid saab kasutada termititsiididena, et tõhustada termiitide bioloogilist kontrolli, vähendades nende sotsiaalset immuunsust. Seetõttu võib miRNA-sid pidada potentsiaalseteks uuteks sihtmärkideks putukate kahjuritõrjeks.

Viited

Berdnik D, Fan AP, Potter CJ, Luo L (2008) MikroRNA töötlemise rada reguleerib haistmisneuronite morfogeneesi. Curr Biol. 18:1754-1759. https://doi.org/10.1016/j.cub.2008.09.045

Bulmer MS, Bachelet I, Raman R, Rosengaus RB, Sasisekharan R (2009) Antimikroobse toime sihtimine putukate immuunsuses kahjuritõrjestrateegiana. Proc Natl Acad Sci USA 106:12652–12657. https://doi.org/10.1073/pnas.0904063106

Chouvenc T, Efstathion CA, Elliott ML, Su NY (2013) Maa-aluse termiidi väljaheidete pesast ilmnev pikendatud haigusresistentsus. Proc R Soc B 280:20131885. https://doi.org/10.1098/ rspb.2013.1885

Davidson WM (1930) Rotenoon kontaktinsektitsiidina. J Econ Entomol 23:868–874. https://doi.org/10.1093/JEE/23.5.{8}}

Davis HE, Meconcelli S, Radek R, McMahon DP (2018) Termiidid kujundavad oma kollektiivse käitumisreaktsiooni nakkuse staadiumi alusel. Sci Rep 8:14433. https://doi.org/10.1038/ s41598-018-32721-7

Esparza-Mora MA, Davis HE, Meconcelli S, Plarre R, McMahon DP (2020) Sekreteeritud immuunmolekuli pärssimine häirib termiitide sotsiaalset immuunsust. Eesmine Ecol Evol 8:75. https://doi.org/10. 3389/fevo.2020.00075

Gomez-Orte E, Belles X (2009) MikroRNA-st sõltuv metamorfoos hemimetaboolsete putukate puhul. Proc Natl Acad Sci USA 106:21678–21682. https://doi.org/10.1073/pnas.0907391106

Hamilton C, Bulmer MS (2012) Molekulaarne seenevastane kaitse maa-aluste termiitide puhul: RNA interferents näitab terminuse ja GNBP-de in vivo rolli looduslikult esineva patogeeni vastu. Dev Comp Immunol. 36:372-377. https://doi.org/10.1016/j.dci. 2011.07.008

Hamilton C, Lejeune BT, Rosengaus RB (2011) Trophallax ja profülaktika: puusepa sipelga sotsiaalne immuunsusCamponotus pennsylvanicus. Biol Lett 7:89–92. https://doi.org/10.1098/rsbl. 2010.0466

Hassan A, Huang Q, Mehmood N, Xu H, Zhou W, Gao Y (2021a) Termiitide liikumise ja allogroomide muutumine vastuseks patogeensete seente nakatumisele. J Econ Entomol 114:1256–1263. https://doi.org/10.1093/jee/toab071

Hassan A, Huang Q, Xu H, Wu J, Mehmood N (2021b) Vaigistaminefosfofruktokinaasgeen kahjustab glükolüüsi ja põhjustab maa-aluses termiidis ebanormaalset liikumistReticulitermes chinensisSnyder. Insect Mol Biol 30:57–70. https://doi.org/10. 1111/imb.12672

He S et al (2018) Termiitide sõdurid aitavad kaasa sotsiaalsele immuunsusele, sünteesides tugevatoimelisi suusekreete. Insect Mol Biol 27:564-576. https://doi.org/10.1111/imb.12499

Hong M, Hwang D, Cho S (2018) Hemotsüütide morfoloogia ja rakuline immuunvastus termiitidel (Reticulitermes speratus). J Insect Sci 18:46. https://doi.org/10.1093/jisesa/iey039

Hussain A, Li YF, Cheng Y, Liu Y, Chen CC, Wen SY (2013) Immuunsüsteemiga seotud transkriptoomCoptotermes formosanusShiraki töötajad: kaitsemehhanism. PLoS ONE 8:e69543. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0069543

Inagaki T, Matsuura K (2018) Termiitide ja soolestiku mikroobide vaheline laiendatud vastastikune seos: toitumissümbiondid aitavad kaasa pesahügieenile. Sci Nat 105:52. https://doi.org/10.1007/ s00114-018-1580-y

Kumar S, Upadhyay RK (2021) Erinevate bioorgaaniliste koostisosade termiidivastane potentsiaal, pöörates erilist tähelepanu Asteraceae perekonnale. WJPR 10:1109–1149. https://doi.org/10.20959/wjpr2 0213-19977

Lee YS jt (2004) Erinevad rollidDrosophilaDicer-1 ja Dicer-2 siRNA/miRNA vaigistamise radadel. Cell 117:69–81. https://doi.org/10.1016/S0092-8674(04)00261-2

Liu L, Li GH, Sun PD, Lei CL, Huang QY (2015) Termiitide seenpatogeenide vastase aktiivse immuniseerimise eksperimentaalne kontrollimine ja molekulaarne alus. Sci Rep 5:15106. https://doi.org/ 10.1038/srep15106

Liu L, Wang W, Liu YL, Sun PD, Lei CL, Huang QY (2019a) Allogrooming käitumise mõju individuaalsele kaasasündinud immuunsusele maa-aluses termiidisReticulitermes chinensis(Isoptera: Rhinotermitidae). J Insect Sci 19:6. https://doi.org/10.1093/jisesa/ iey119

Liu L, Zhao XY, Tang QB, Lei CL, Huang QY (2019b) Sotsiaalse immuunsuse mehhanismid eusotsiaalsete putukate seennakkuste vastu. Toksiinid 11:244. https://doi.org/10.3390/toxins11050244

Liu L, Wang CC, Zhao XY, Guan JX, Lei CL, Huang QY (2020) Isotsitraatdehüdrogenaasi poolt vahendatud ainevahetushäired häirivad aktiivset immuniseerimist eusotsiaalsete termiitide seenpatogeenide vastu. J Pest Sci 93:291–301. https://doi.org/10.1007/ s10340-019-01164-y

Lopez-Uribe MM, Sconiers WB, Frank SD, Dunn RR, Tarpy DR (2016) Vähendatud rakuline immuunvastus sotsiaalsetes putukate liinides. Biol Lett 12:20150984. https://doi.org/10.1098/rsbl.2015. 0984

Lucas KJ, Zhao B, Liu S, Raikhel AS (2015) Füsioloogiliste protsesside reguleerimine mikroRNA-de abil putukates. Curr Opin Insect Sci 11:1–7. https://doi.org/10.1016/j.cois.2015.06.004

Rosengaus RB, Jordan C, Lefebvre ML, Traniello JFA (1999) Patogeeni häirekäitumine termiidis: uus suhtlusvorm sotsiaalsetes putukates. Naturwissenschaften 86:544–548. https://doi.org/ 10.1007/s001140050672

Rosengaus RB, Lefebvre ML, Traniello JFA (2000) Seente spooride idanemise pärssimine nasutitermesiga: tõendid sõduri kaitsvate sekretsioonide võimaliku antiseptilise rolli kohta. J Chem Ecol. 26:21–39. https://doi.org/10.1023/A:1005481209579

Rosengaus RB, Schultheis KF, Yalonetskaya A, Bulmer MS, DuComb WS, Benson RW, Thottam JP, Godoy-Carter V (2014) Symbiontist tuletatud -1,3-glükanaasid sotsiaalses putukas: vastastikune suhtlemine väljaspool toitumist . Front Microbiol 5:607. https://doi.org/10.3389/fmicb. 2014.00607

Schuler F, Casida JE (2001) Insektitsiidide sihtmärk kompleksi I PSST allüksuses. Pest Manag Sci 57:932-940. https://doi.org/10. 1002/ps.364

Seipke RF et al (2011) ÜksStreptomycessymbiont toodab seente kasvatamise sipelga toetamiseks mitmeid seenevastaseid aineidAcromyrmex octospinosus. PLoS ONE 6:e22028. https://doi.org/10.1371/journ al.pone.0022028

Shankar K, Mehendale HM (2014) Cytochrome P450. In: Wexler P (ed) Encyclopedia of toxicology. Academic Press, pp 1125–1127 Stroeymeyt N, Grasse AV, Crespi A, Mersch DP, Cremer S, Keller L (2018) Sotsiaalse võrgustiku plastilisus vähendab haiguse levikut eusotsiaalses putukas. Science 362:941–945. https://doi.org/10.1126/ science.aat4793

Sun Q, Haynes KF, Zhou XG (2016) Dünaamilised muutused surmanähtustes moduleerivad sotsiaalse putuka surnukehade haldamise riske ja hüvesid. Funct Ecol 31:697–706. https://doi.org/10.1111/1365- 2435.12754

Syazwan SA, Lee SY, Sajap AS, Lau WH, Omar D, Mohamed R (2021)Metarhizium anisopliaeja selle peremees maa-alune termiitCoptotermes curvignathusnakkusprotsessi ajal. Bioloogia 10:263. https://doi.org/10.3390/biolo gy10040263

Terrapon N et al (2014) Alternatiivse sotsiaalse organisatsiooni molekulaarsed jäljed termiidi genoomis. Nat Commun 5:3636. https://doi.org/10. 1038/ncomms4636

Van Meyel S, Körner M, Meunier J (2018) Sotsiaalne immuunsus: miks peaksime uurima selle olemust, evolutsiooni ja funktsioone kõigis sotsiaalsetes süsteemides. Curr Opin Insect Sci 28:1–7. https://doi.org/10.1016/j. cois.2018.03.004

Verma M, Sharma S, Prasad R (2009) Bioloogilised alternatiivid termiitide tõrjeks: ülevaade. Int Biodeter Biodegr 63:959–972. https:// doi.org/10.1016/j.ibiod.2009.05.009

Wang YL, Yang ML, Jiang F, Zhang JZ, Kang L (2013) MikroRNA-st sõltuv areng, mille paljastas RNA interferentsi poolt vahendatud geenide vaigistamineLmDicer1rändtirtsus. Insect Sci 20:53–60. https://doi.org/10.1111/j.{5}}.2012.01542.x

Weber F (2021) Viirusevastane kaasasündinud immuunsus: sissejuhatus. In: Bamford DH, Zuckerman M (eds) Encyclopedia of virology. Elsevier, lk 577–583 Xu H, Huang QY, Gao YY, Wu J, Hassan A, Liu YT (2021a)IDHknockdown muudab termiidi toitumiskäitumistOdontocetes formosanuserinevates sotsiaalsetes kontekstides. Curr Zool 67:609. https://doi.org/10.1093/cz/zoab032 Xu Z, Zeng X, Li M, Liao J, Chen Q (2021b) MicroRNA-383 soodustab reaktiivsete hapnikuliikide poolt indutseeritud autofagiat, vähendades peroksiredoksiini 3 inimese glioomides U87 rakud. Exp Ther Med 21:439. https://doi.org/10.3892/etm.2021.9870

Yanagawa A, Fujiwara-Tsujii N, Akino T, Yoshimura T, Yanagawa T, Shimizu S (2011) Entomopatogeenide kopitanud lõhn suurendab termiitide haigusi ennetavat käitumistCoptotermes formosanus. J Invertebr Pathol 108:1–6. https://doi.org/10.1016/j.jip.2011. 06.001

Yanagawa A, Imai T, Akino T, Toh Y, Yoshimura T (2015) Patogeense seente haistmismärgid mõjutavad termiitide liikumissuunda,Coptotermes formosanus. J Chem Ecol 41:1118–1126. https://doi.org/10.1007/s10886-015-0649-8

Yang ML jt (2014) MicroRNA-133 pärsib käitumuslikku agregatsiooni, kontrollides dopamiini sünteesi jaaniussilindudel. PLoS Genet 10:e1004206. https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1004206