MikroRNA-d neerude arengus ja haigustes Ⅲ

MiRNA-d Wilmsi kasvajas

Wilmsi kasvaja,võinefroblastoom, on kõige tavalisem lapsepõlvneeruvähk, mille esinemissagedus on 1/10, 000 last Põhja-Ameerikas (111). See on peamiselt juhuslik haigus, kuigi perekondlikke vorme esineb ligikaudu 1–2% juhtudest (112, 113). Wilmsi kasvajad tekivad ebanormaalsest nefrogeneesist, kus pluripotentsed embrüonaalsed neeruprekursorid ei suuda diferentseeruda ja püsivadebanormaalselt sünnitusjärgsesse ellu(111, 114, 115). Need kasvajad on histoloogiliselt sarnasedarenevad neerudkooshäiritud morfoloogia(116) ning loote nefrogeneesiga seotud geenide, sealhulgas WT1 (117–119), CTNNB1 (120), SIX1/2 (121, 122) ja TP53 (123, 124), mutatsioonid on seotud ligikaudu 40% juhtudest. Wilmsi kasvajad (125). Hiljutised uuringud, milles kasutati Wilmsi kasvajate kogu genoomi ja terve eksoomi järjestust, tuvastasid uudsed mutatsioonid vähiriski geenides (REST, CHEK2, PALB2) (126, 127), geenides, mis kodeerivad valke, mis vahendavad histooni modifikatsioone nefrogeneesi ajal (BCOR, MAP3K4) (126). ) ja miRNA-d töötlevad geenid (121, 122, 128, 129).

KUI KAUA AJAB, ET CISTANCHE TÖÖTAB NEERUHAIGUSTE PATSIENTIDES?

MiRNA-d töötlevatest geenidest on teatatud mutatsioonidest DROSHA, DGCR8, DICER1, TARBP2 ja XPO5 (kodeerib eksportiini 5) puhul varem ravimata ja neoadjuvant keemiaravi saanud Wilmsi kasvajate puhul (joonis 3) (121, 122, 128, ). Umbes 33% uuritud Wilmsi kasvajatest näitavad miRNA-töötlusraja geenides kahjulikke mutatsioone (128). Korduv leviala mutatsioon (E1147K) DROSHA RNaasi IIIb domeeni met al-siduvas (Mg2+) jäägis, mis näib olevat ainulaadne Wilmsi kasvajale, kaotab selle domeeni katalüütilise aktiivsuse, mille tulemuseks on mittetäielik. pri-miRNA-de lõhustamine ja miRNA küpsemise vähenemine (128). Somaatilised leviala mutatsioonid, mis mõjutavad DICER1 RNaasi IIIb domeeni, kahjustavad 5p miRNA-de töötlemist (need, mis pärinevad pre-miRNA juuksenõela 5'-harust) (129) ja neid leitakse sageli kui "teise tabamuse" mutatsioone, mis toimivad koos DICER1-ga. idutee mutatsioonid Wilmsi tuumorigeneesi esilekutsumiseks DICER1 sündroomi korral (häire, mis suurendab vastuvõtlikkust mitmesugustele kasvajatele) (130–132). Jääb ebaselgeks, miks Wilmsi kasvajate kahjustatud DICER1 funktsioon põhjustab püsivat ja ebanormaalset nefrogeneesi, erinevalt Dicer1 kadumisest hiire nefroni eellasrakkudes, mis põhjustab suurenenud apoptoosi ja nefrogeneesi enneaegset lakkamist (72–75). Mõned potentsiaalsed võimalused hõlmavad seda, et geeniannuse aktiivsus võib olla otsustava tähtsusega rakkude ellujäämise määramisel või et mutatsioonid RNaasi IIIb domeenis võivad mõjutada DICER1 miRNA seondumise spetsiifilisust.

Mutatsioonid miRNA-d töötlevates geenides on seotud oluliste miRNA-de, sealhulgas miR-200 (121) ja let-7 perekonna liikmete (joonis 3) (121, 129) allareguleerimisega. Las-7 miRNA-d ja RNA-d siduv valk Lin28 toimivad koos, et kontrollida hiire nefrogeneesi lakkamise aega, võib-olla kasvu soodustava geeni Igf2 reguleerimise kaudu (133). Lin28 üleekspressioon neerude arengu ajal põhjustab nefrogeensete eellasrakkude laienemist, pärssides nende viimast diferentseerumislainet, mis kulmineerub neoplastilise transformatsiooniga, mis meenutab tugevalt inimese Wilmsi kasvajat (134). LIN28B DNA koopiate arvu suurenemist ja let-7a DNA koopiate kadumist täheldatakse vastavalt 25% ja 46% inimese Wilmsi kasvaja proovidest (126). Kooskõlas nende tähelepanekutega põhjustavad idutee mutatsioonid inimese DISL3L2 geenis, mis kodeerib eksoribonukleaasi, mis vastutab let-7 eeltöödeldud vormide lagundamise eest, Perlmani sündroomi ja eelsoodumuse Wilmsi kasvaja tekkeks (135, 136). Perlmani sündroom on kaasasündinud ülekasvu sündroom, mida iseloomustavad makrosoomia, polühüdramnion, näo düsmorfoloogia, neerude düsplaasia ja nefroblastomatoos (Wilmsi kasvaja eelkäija kahjustus) (137). Neonataalse perioodi ellujäänud Perlmani sündroomiga imikute seas areneb 64%-l Wilmsi kasvaja (138). Huvitaval kombel leiti täielikud või osalised DISL3L2 deletsioonid umbes 30% uuritud juhuslikest Wilmsi kasvajatest (136).

Hiljutine uuring tugevdas miRNA regulatiivse võrgu tähtsust Wilmsi kasvaja etioloogias. Autorid leidsid, et pleiomorfse adenoomi geen 1 (PLAG1) on üks järjekindlamalt ülesreguleeritud geene Wilmsi kasvajates, millel on mutatsioonid miRNA-d töötlevates geenides (125). PLAG1 ektoopiline ekspressioon arenevas hiire neerus põhjustab neoplaasiat, millega kaasneb selle sihtgeeni, Wilmsi kasvaja onkogeeni IGF2 transaktivatsioon. PLAG1 ekspressiooni potentsiaalsete regulaatoritena tuvastati miR-16 ja miR-34, mis on Wilmsi kasvajate puhul allareguleeritud (125). Tabelis 2 on kokku võetud muud uuringud, mis on teatanud Wilmsi kasvaja etioloogiaga seotud spetsiifiliste miRNA-de ebanormaalsest ekspressioonist. Huvitaval kombel võivad need miRNA-d toimida onkogeenide (nimetatakse oncomiR-ideks) või kasvaja supressoridena Wilmsi kasvaja arengu taustal, sõltuvalt nende sihtmärkide olemusest.

MiRNA-d kui potentsiaalsed biomarkerid ja raviained

Lisaks rakusisesele asukohale esinevad miRNA-d märkimisväärses koguses ka bioloogilistes vedelikes, sealhulgas veres, plasmas, uriinis, rinnapiimas ja süljes (139). Neid ringlevaid miRNA-sid leidub vananenud mikroosakestesse (eksosoomid, mikrovesiikulid ja apoptootilised kehad) (140, 141), konjugeerituna AGO (142) või nukleofosmiin 1 valkudega (143) või laetuna HDL-i (144), mis muudab need märkimisväärselt stabiilne isegi ebasoodsates tingimustes, nagu keemine, äärmuslikud pH kõikumised, pikaajaline säilitamine ja mitmed külmutamis-sulatustsüklid (145, 146). Seega võivad miRNA allkirjad bioloogilistes vedelikes peegeldada seoseid füsioloogiliste või haiguslike seisunditega (147). Need omadused koos muudavad tsirkuleerivad miRNA-d atraktiivseks kasutamiseks mitteinvasiivsete biomarkeritena haiguste diagnoosimisel ja prognoosimisel.

Tsirkuleerivaid miRNA-sid saab ekstraheerida otse fraktsioneerimata bioloogilistest vedelikest või ekstratsellulaarsetest vesiikulipreparaatidest, kasutades kaubanduslikult saadavaid ekstraheerimiskomplekte (148) või TRIzoli (149). Isoleerimisel saab miRNA-sid säilitada –70 kraadi juures ja need püsivad stabiilsena kuni 1 aasta (148). MiRNA profiilide koostamiseks on saadaval mitu platvormi, sealhulgas mikrokiibi hübridiseerimine, qPCR ja järgmise põlvkonna sekveneerimine (150). Microarray ja qPCR on teadaolevate miRNA-de ekspressiooni uurimiseks kõige sagedamini kasutatavad metoodikad (151). Mõlema meetodi eeliseks on lihtne kasutada, suhteliselt kiire RNA märgistamisest andmete genereerimiseni ja suhteliselt kuluefektiivne (152). Siiski sõltuvad nad sondi ja praimerite kavandamise andmebaasides miRNA järjestuste kättesaadavusest ja täpsest annotatsioonist (150). Kuigi järgmise põlvkonna sekveneerimine on kallim, võimaldab see samaaegselt tuvastada nii tuntud kui ka uusi miRNA liike ning pakub kõrget tundlikkust (153). Lisaks võimaldab järgmise põlvkonna sekveneerimise ühe nukleotiidi eraldusvõime tuvastada isomiR-e, mis on küpsed miRNA isovormid, mis erinevad kanoonilistest isovormidest pikkuse, järjestuse või mõlema poolest (154, 155), mis muudavad miRNA sihtimise spetsiifilisust ( 156).

Erinevad uuringud on uurinud ringlevate miRNA-de potentsiaali laste neeruhaiguste biomarkeritena (157–160). Näiteks ühes uuringus tuvastati 14 miRNA-d, mis olid Wilmsi kasvajaga patsientide seerumis märkimisväärselt ülesreguleeritud. Huvitaval kombel võib miR-100-5p ja miR-130-3p ekspressioonil põhinev signatuur eristada neid patsiente tervetest kontrollidest täpsuse, tundlikkuse ja spetsiifilisusega (159). Kuigi selle uuringu ja paljude teiste uuringute tulemused on andnud kaaluka motivatsiooni uurida tsirkuleerivate miRNA-de potentsiaali biomarkeritena, tuleb enne laialdast kliinilist kasutamist ületada mitmed tõkked. Esiteks puudub uuringute vahel konsensus, mis on tõenäoliselt tingitud standardiseeritud metoodika puudumisest proovide puhastamiseks (161) ja analüüsiks (nt erinevused miRNA profiilide koostamise platvormides, viited 162, 163 või erinevused smRNA-Seq raamatukogus valmistamismeetodid, viide 164). Teiseks on suurte valimimahuliste uuringute ja konkreetsete üksikasjalike uuringute puuduminehaigused.Teine oluline aspekt on see, et segadusttekitavate muutujate, nagu vanus, sugu ja välistegurid (nt tubakas, alkohol jne) mõju miRNA profiilidele ei ole täielikult uuritud (põhjaliku ülevaate saamiseks vaadake viidet. 165).

Terapeutilise poole pealt on mitmed miRNA-põhised ravimid praegu kliinilistes uuringutes, kuid neile pole veel FDA heakskiitu antud (166, 167). MiRNA-ravi peamised lähenemisviisid hõlmavad miRNA taseme taastamist miRNA jäljendajate abil või spetsiifiliste miRNA-de inhibeerimist antagomiR-ide abil (168). Üks miRNA-põhiste ravimite väljatöötamisega seotud väljakutsetest on iga haiguse miRNA kandidaatide tuvastamine. Kuna iga haiguse korral on mitu miRNA-d reguleerimata, tuleks patsiendi proovide hoolikas analüüs koos in vitro ja in vivo analüüsidega, mis käsitlevad kõnealuste miRNA-de poolt mõjutatud patofüsioloogilisi mehhanisme, et kitsendada terapeutilise sekkumise jaoks kandidaatide miRNA-sid (168, 169). Teine väljakutse hõlmab strateegiate väljatöötamist, et parandada in vivo stabiilsust ja kohaspetsiifilist ravimite kohaletoimetamist minimaalse toksilisuse ja sihtmärgiväliste mõjudega. RNA molekulid on keemiliselt ebastabiilsed, kuna pentoositsüklis on 2'-hüdroksüülrühm. Suurema stabiilsuse ja kaitse tagamiseks seerumis või rakkude endotsüütilises osas esinevate nukleaaside eest on biotehnoloogiaettevõtted loonud RNA molekulid, mille selgroos on keemilisi modifikatsioone (2'-O-metüülrühm, fosforotioaat või lukustatud nukleiinhapped) (166). In vivo kohaletoimetamise puhul hõlmavad tehnoloogiad paljude muude strateegiate hulgas lipiidipõhiseid (nt lipiidide nanoosakesi ja neutraalseid liposoome) ja dendrimeere, mis on konjugeeritud sihtrühmaga. MiRNA kohaletoimetamissüsteemidega seotud peamised väljakutsed on immunotoksilisus ja sihtmärgispetsiifiline afiinsus haiguskoha suhtes (170). Erinevate manustamismeetodite (intraperitoneaalsed, intravenoossed ja subkutaansed süstid) või neeruspetsiifilisi ja indutseeritavaid promootoreid sisaldavaid vektoreid kasutades on edukalt kasutatud manustamisstrateegiaid neerude selektiivseks sihtimiseks ja võimalike kahjulike mõjude vältimiseks teistes kudedes ja elundites (171, 172). ).

Tabel 2. Wilmsi kasvajas muudetud miRNA-de loend

MiRNA-de loend, analüüsitud proovid/proovid, nendes proovides/proovides täheldatud miRNA tasemed, võrreldes sobivate kontrollidega, sihtgeen, miRNA muutuste tagajärjed ja viited. CAMKK2, kaltsium/kalmoduliinist sõltuv proteiinkinaasi kinaas 2; CDC7, raku jagunemise tsükkel 7; CDH1, kadheriin 1; CREB1, cAMP-vastuse elementi siduv valk 1; EYA1, silmad puuduvad homoloog 1; E2F3, E2F transkriptsioonifaktor 3; FRS2, FGF retseptori substraat 2; Glut1, glükoosi transporter 1; IGF1R, IGF1 retseptor; Jag1, sakiline1; MET, mesenhümaal-epiteeli üleminek; MKNK1, MAPK-ga interakteeruv seriini/treoniini kinaas 1; PTEN, fosfataasi ja tensiini homoloog; PUMA, p53-ülereguleeritud apoptoosi modulaator; p73, kasvaja valk p73; SIX1, sineoculis homeobox homoloog 1; TGFBR1, TGF-retseptor 1; WT, Wilmsi kasvaja.

Kokkuvõte

Alates miRNA-de esmasest avastamisest 1993. aastal on olnud plahvatuslikult palju teavet miRNA biogeneesi, miRNA ekspressiooni reguleerimise ja miRNA funktsiooni kohta (6, 7). Sellega on kaasnenud üha kasvav arusaam sellest, kuidas miRNA-d toimivad nii normaalses füsioloogias kui ka paljude haiguste patofüsioloogias. On saanud selgeks, et miRNA ekspressiooni düsregulatsioon häirib neerude varajast arengut ja on seotud arenevate neeruhaiguste, nagu CAKUT ja Wilmsi kasvaja, patogeneesiga. Arvestades hiljutisi arenguid miRNA-de kasutamisel biomarkeritena ja uudsete ravimite sihtmärkidena, on arusaam sellest, kuidas miRNA-d reguleerivad neerude arengut ja haigusi, kriitilise tähtsusega, et mõista, kuidas neid saaks kasutada nende haiguste uudsetes diagnostilistes ja terapeutilistes lähenemisviisides. Nende jõupingutuste täielikuks realiseerimiseks on kriitilised tulevased uuringud, mis tuvastavad spetsiifiliste miRNA-de funktsiooni neerude arengus, lisaks tehnoloogiatele, mis optimeerivad väikeste oligonukleotiidravimite sihtimist neerudesse.

Tänuavaldused

JH laboratooriumit toetavad NIH riikliku diabeedi ja seede- ja neeruhaiguste instituudi stipendiumid (R01DK125015 ja R01DK102843). DMC-d toetasid nefrootilise sündroomi uuringuvõrgustiku karjääriarengu auhind ja Pittsburghi lastehaigla teadusnõuandla järeldoktorantuuri stipendium. MT-d toetas Pittsburghi ülikooli suveuuringute praktikaprogramm (R25DK119180). Figuurid loodi BioRender.com-iga. Aadressi kirjavahetus: Jacqueline Ho, Pittsburghi UPMC lastehaigla pediaatriaosakonna nefroloogia osakond, Rangose ​​uurimiskeskus, 4401 Penn Ave., Pittsburgh, Pennsylvania 15224, USA. Telefon: 412 692 9440; E-post: jacqueline.ho2@chp.edu.

1. Kozomara A et al. miRBase: mikroRNA järjestustest funktsioonini. Nucleic Acids Res. 2019;47(d1): D155–D162.

2. Friedman RC et al. Enamik imetajate mRNA-sid on mikroRNA-de konserveerunud sihtmärgid. Genome Res. 2009;19(1):92–105.

3. Ghildiyal M, Zamore PD. Väikesed vaigistavad RNA-d: laienev universum. Nat Rev Genet. 2009;10(2):94–108.

4. Djuranovic S et al. miRNA-vahendatud geeni vaigistamine translatsioonilise repressiooniga, millele järgneb mRNA deadenüülimine ja lagunemine.

Teadus. 2012;336(6078):237–240.

5. Huntzinger E, Izaurralde E. Gene vaigistamine mikroRNA-de poolt: translatsioonilise repressiooni ja mRNA lagunemise panus. Nat Rev Genet. 2011;12(2):99–110. 6.Lee RC et al. C. elegansi heterokrooniline geen lin-4 kodeerib väikseid RNA-sid, millel on antisenss-komplementaarsus lin-14-ga. Kamber.