Metformiin parandab alamodulatsiooni abil inimese rasvkoest pärinevate tüvirakkude tüve

Palun võtke ühendustoscar.xiao@wecistanche.comrohkem informatsiooni

Abstraktne:Rasvkude mängib olulist rolli metaboolse homöostaasi reguleerimisel, säilitades liigse rasva ja kaitstes teisi organeid lipotoksilisuse eest. Vananemine on seotud tsentraalse rasvade ümberjaotumisega, mis kulmineerub insuliinitundliku nahaaluse vähenemise ja insuliiniresistentsete vistseraalsete rasvade depoode suurenemisega. Rasvast pärinevad tüvirakud (ASC) mängivad rasvkoe regenereerimisel olulist rolli. Vananenud ASC-del on vähenenud tüvi ja regeneratiivne potentsiaal oksüdatiivse stressi ja mitokondriaalse düsfunktsiooniga seotud rakukahjustuse kuhjumise tõttu. Metformiin on väljakujunenud diabeedivastane ravim, mis on näidanud vananemisvastast toimet erinevates organismides ja loommudelites. Selles uuringus analüüsisime metformiinravi mõju inimese ASC-de tüvele rakukultuuris ja kogu rasvkoekultuuri mudelites. Meie tulemused näitavad, et metformiin parandab ASC-de tüve, vähendades nende proliferatsiooni kiirust ja adipotsüütide diferentseerumist. Uurides võimalikku alusmehhanismi, täheldasime mTOR ja ERK aktiivsuse vähenemist metformiiniga töödeldud ASC-des. Lisaks täheldasime metformiinravi ajal autofagia aktiivsuse suurenemist. Me järeldame, et metformiinravi parandab ASC-de tüve, vähendades mTOR-i ja ERK-signaali ning suurendades autofagiat. Loommudelite ja inimeste tulevased in vivo hindamised sillutavad teed selle väljakujunenud ravimi kliiniliseks kohandamiseks vananenud tüvirakkude tüve taaselustamiseks.

Lisateabe saamiseks klõpsake siin

Märksõnad:rasvkoe tüvirakud; rasvkude; tüvelisus; diferentseerimine; levik; metformiin;mTOR; ERK; autofagia

1. Sissejuhatus

Rasvkude on dünaamiline organ, millel on oluline homöostaatiline roll toitainete tasakaalu, insuliinitundlikkuse ja immuunmodulatsiooni reguleerimisel. Rasvkude täidab seda rolli, säilitades ja oksüdeerides liigseid rasvhappeid, vältides seega steatoosi ja lipotoksilisust teistes elundites [1]. Vanusega seotud insuliiniresistentsus on kõige levinum ainevahetushaigus. Ligikaudu 25 protsenti USA üle 65-aastastest elanikkonnast kannatab diabeedi all, mille tulemuseks on kõrgem suremus, vähenenud funktsionaalne seisund, suurenenud risk haiglasse sattuda ja ülemäärane koormus tervishoiumajandusele [2]. Kuigi seost diabeedi ja rasvumise vahel on juba ammu tunnustatud, on seos vananemise ja II tüüpi diabeedi vahel endiselt tabamatu [3]. Esimene tähelepanek glükoositaluvuse languse ja vananemise kohta tehti 1921. aastal [4]. Mitmed uuringud on sellest ajast alates tuvastanud vähenenud insuliinitundlikkuse kui glükoosi metabolismi vanusega seotud kahjustuse peamise põhjuse [5, 6]. Anatoomilise lokaliseerimise põhjal võib rasvkoe jagada laias laastus kaheks depoosse: subkutaanseks ja vistseraalseks rasvkoeks. Insuliinitundlikkuse seisukohalt on oluline rasvkoe depoo asukoht ja funktsioon; Näiteks vistseraalne depoo on resistentsem, samas kui nahaalune depoo on insuliini suhtes tundlikum [7]. Vanusega seotud nahaaluse rasvkoe mahu järkjärguline vähenemine põhjustab glükoosi ja lipiidide omastamise vähenemist, mis põhjustab lipiidide ülevoolu ja lipiidide ektoopilist ladestumist lihastes ja maksas, mis aitab kaasa insuliiniresistentsuse tekkele [8].

Rasvkude koosneb erinevatest rakutüüpidest. Rasvkoe ensümaatilisel seedimisel kollagenaasiga saadakse kaks peamist fraktsiooni: adipotsüütide fraktsioon ja strooma vaskulaarne fraktsioon (SVF)[9]. SVF sisaldab rasvkoest pärinevaid tüvirakke (ASC), lümfotsüüte, endoteelirakke, peritsüüte ja fibroblaste [10]. ASC-d on immuunfenotüüpselt defineeritud kui mesenhümaalset päritolu CD34 pluss CD90 pluss CD29 pluss CD{7}}CD31 rakud, millel on kolmeliiniline diferentseerumisvõime luuks, kõhreks või rasvaks [11,12]. Valgetes rasvkoes asuvad need rakud peamiselt veresoonte stroomas väikeste veresoonte ümber ning võivad paljuneda ja diferentseeruda adipotsüütideks[11]. Rasvast pärinevad tüvirakud (ASC-d) mängivad olulist rolli rasvkoe regenereerimisel proliferatsiooni, eneseuuendamise ja diferentseerumise kaudu. Vananemine on seotud nende tüveomaduste kadumisega ASC-des [13,14]. Arvatakse, et vanusega seotud nahaaluse rasvadepoo suuruse vähenemine on tingitud ASC-de muutunud replikatsioonist ja diferentseerumisest[15-17]. Findeisen et al. viitavad oksüdatiivse stressi kuhjumisele rasvkoes vananemise ajal, mis mõjutab negatiivselt diferentseerumisvõimet; [15] siiski ei mõisteta ASC-de tüve kadumise täpset mehhanismi (mehhanisme). Hiljutised uuringud on näidanud, et autofagia vähenemine, rapamütsiini (mTOR) raja aktiivsuse kõrgem mehhaaniline sihtmärk ja reaktiivsete hapnikuliikide (ROS) akumuleerumine on seotud ASC-de tüve kadumise ja ASC-de enneaegse vananemise indutseerimisega [18-20].

Cistanche on vananemisvastane toime

Metformiin on diabeedivastane ravim, mida tavaliselt kasutatakse veresuhkru alandamiseks ja insuliinitundlikkuse parandamiseks. Seda saab kasutada mitmesuguste vananemisega seotud ainevahetushäirete, nagu südame-veresoonkonna haigused, vähid ja kognitiivne langus [21,22], raviks. Metformiini pikaealisust pikendavat toimet on demonstreeritud usside, hiirte ja rottide puhul toitumispiiranguga, mis jäljendab adenosiinmonofosfaadiga aktiveeritud proteiinkinaasi aktiivsuse (AMPK) stimuleerimise mõju[23]. Erinevad uuringud on näidanud, et metformiin pärsib imetajate rapamütsiini (mTOR) sihtmärki [24,25]. AMPK-mTOR signaalirajad reguleerivad spetsiifiliselt rakuliste homöostaaside omadusi, nagu autofagia, proliferatsioon, energia metabolism ja valkude süntees [26]. On näidatud, et metformiin pärsib proliferatsiooni, diferentseerumist ja põletikku, vähendades oksüdatiivset stressi ja mitokondriaalset potentsiaali ning parandades üldist tüve eri tüüpi täiskasvanud tüvirakkudes [27,28]. Metformiini mõju ASC-de metabolismile ja tüvele in vitro ja in vivo ei ole selge.

Selles uuringus kasutasime inimese ASC-de 2D-kultuuri ja kogu inimese rasvkoekultuuri tehnikaid, et simuleerida in vivo rakukorraldust ja koe mikrokeskkonda. Neid eksperimentaalseid mudeleid kasutades uurisime metformiinravi mõju ASC-de diferentseerumisele, proliferatsioonile ja tüvele ning uurisime nendes rakuprotsessides osalevaid molekulaarseid mehhanisme.

2. Materjalid ja meetodid

2.1. Doonori spetsifikatsioonid

Pittsburghi ülikooli meditsiinikeskuses (UPMC) koguti rasvkude viielt diabeedita naisdoonorilt vanuses 39 ± 13 ja BMI vahemikus 27 ± 4. Kudede kogumise protseduuri kiitis heaks Pittsburghi ülikooli institutsionaalne järelevalvenõukogu (IRB nr 0511186).

2.2. Inimese ASC-de isoleerimine ja kasvatamine

Rasva prekursorrakud eraldati järgmiselt [19, 29]. Rasvkoe biopsiad pärast kirurgilisi protseduure viidi laborisse steriilses suletud anumas. Kude loputati Dulbecco fosfaatpuhverdatud soolalahusega (PBS; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), millele järgnes kiulise materjali ja veresoonte eemaldamine dissektsiooni teel. Kude lõigati tükkideks (1-2 mg) ja seediti seedimispuhvris (HBSS, mis sisaldas 200 U/mL kollagenaase (CLS Type II, Worthington Biochemical Corp., Lakewood, NI). , USA) ja 2% w/o BSA (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)) segades 60 minutit 37 kraadi juures; 1 mg rasvkude / 3 ml seedimispuhvrit. Dispergeeritud kude tsentrifuugiti 10 minutit kiirusel 200 x g toatemperatuuril. Ujuvad adipotsüüdid aspireeriti ja strooma vaskulaarse fraktsiooni (SVF) granuleeritud rakud suspendeeriti erütrotsüütide lüüsipuhvris (0,155 M NH4CI, 5,7 mM K2HPO4, 0,1 mM EDTA, pH 7,3) ja inkubeeriti 10 minutit toatemperatuuril. Koejäätmete eemaldamiseks filtriti rakususpensioon läbi nailonvõrgu (poori suurus 100 um; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Pärast teist tsentrifuugimisetappi (10 minutit 200 × g juures) suspendeeriti pelleteeritud SVF ASC söötmes (Dulbecco modifitseeritud Eagle'i sööde (DMEM)/F-12 (1:1) koos HEPES-i ja L-glutamiiniga (Thermo Fisher). Scientific, Waltham, MA, USA), millele on lisatud 33 μM biotiin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), 17 μM pantotenaat (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), 10 ng/mL EGF,1 ng/mL bFGF, 500 ng/ml insuliini, 2,5 protsenti veise loote seerumit ja 12,5 μM/mL gentamütsiini (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) ning külvatud tihedusega 50,{46}} rakku /cm2 T175 kolbides.

Pärast 70-protsendilise konfluentsuse saavutamist pesti rakke PBS-iga ja trüpsiiniti 0,05-protsendilise trüpsiini-EDTA 1x lahusega (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Trüpsiin inaktiveeriti ASC söötme ja 10% FBS lisamisega ja eemaldati tsentrifuugimisega kiirusel 300 x g 5 minutit, enne kui rakud külvati tihedusega 5000 rakku/cm2. ASC-d kasvatati enne jagamist uuesti 70 protsendini. Selles uuringus kasutati lõikudes 3-4 olevaid ASC-sid. Rakke töödeldi erinevate kontsentratsioonidega metformiiniga (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), rapamütsiini (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) või U0126 inhibiitoriga vastavalt katseskeemile.

2.3. Adipogeenne diferentseerumine

Adipogeneesi indutseerimiseks külvati ASC-d tihedusega 50,000 rakku/cm² 6-süvendiga rakukultuuriplaatidele. Adipogenees indutseeriti diferentseerumissöötmega, mis koosnes 0,2 uM insuliinist (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), 0,5 mM 1-metüül{{9 }}isobutüülksantiin (IBMX) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), 0,25 μM deksametasoon (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) ja 10 ug/mL transferriin (St. Louis, MO, St. Louis, MO, USA) ASCmediumis. Pärast 3-päevast diferentseerumist söödet muudeti ja rakke kasvatati diferentseerumissöötmes ilma IBMX-ita 14 päeva.

2.4.Rasvkoe kultuur

Rasvkoe kultiveerimine viidi läbi 6-süvendiga rakukultuuriplaatidel, mõningate modifikatsioonidega, nagu avaldasid Harms et al. [30]. Terve rasvkude tükeldati väiksemateks tükkideks 3-5 mm suurusteks tükkideks ja kultiveeriti 5 ml rakukultuurisöötmes. Koefragmentide kohal hoiti 70 μM poorisuurusega rakusõele, et kude jääks söötmesse. Kudede fragmente lõigati kollagenaasiga, nagu eespool ASC-de eraldamise protseduuri jaoks selgitatud, ja SVF-i analüüsiti ASC-ga seotud tüvegeenide ekspressiooni suhtes.

2.5. Õlipunane O värvimine

Lipiiditilkade visualiseerimiseks fikseeriti rakud 4% paraformaldehüüdiga PBS-is 1 tund ja värviti 0,3% Oil Red O-ga (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) isopropanoolis/vees ( 60:40) 1 tund. Lõplik pesemine viidi läbi kaks korda destilleeritud veega. Imendunud Oil Red O kvantifitseerimiseks elueeriti plekki isopropanooliga (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) ja optilist tihedust mõõdeti 518 nm juures.

2.6. Keha värvimine

14. päeval pärast adipogeneesi esilekutsumist värviti rakke Bodipy (Invitrogen, Waltham, MA, USA) ja Hoechstiga (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 30 minutit 37 kraadi juures. Pildid saadi fluorestsentsmikroskoobi abil ja analüüsiti ImageJ tarkvaraga.

2.7. Floutsütomeetria

Kolmandas lõigul olevaid ASC-sid kasutati voolutsütomeetrilisteks analüüsideks CD29 (Biolegend, San Diego, CA, USA), CD90 (Biolegend, San Diego, CA, USA), CD45 (BD, Franklin Lakes, NJ, USA) pinnaekspressiooniks. , CD24 (Biolegend, San Diego, CA, USA) ja CD31 (BD, NJ, USA). Rakud trüpsiiniti, pesti PBS-ga ja värviti antikehadega FACS-i värvimispuhvris (1% BSA PBS-s). Kontrollina kasutati värvimata ASC-sid. Fluorestsentssignaali mõõdeti voolutsütomeetriga (Fortessa, BD, Franklin Lakes, NJ, USA) ja andmeid analüüsiti FlowJo tarkvara abil (BD, Franklin Lakes, NJ, USA).

2.8. Osteogeenne diferentseerumine

ASC-sid kasvatati {{0}}süvendiplaatidel liitumiseni ja osteogeenne diferentseerumine kutsuti esile osteogeense söötmega (DMEM 10 protsenti FBS, 0,1 uM deksametasoon, 10 mM glütseroolfosfaat ja 50 µM askorbiinhape). 21. päeval pärast diferentseerumist fikseeriti rakud 4% paraformaldehüüdis (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) ja värviti Alizarin Red Stain'iga (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Värvimise kvantifitseerimine viidi läbi Image J tarkvara abil.

2.9.Apoptoosi tuvastamine anneksiin V-APC/PI värvimisega

Apoptootilise rakusurma määramiseks kasutati anneksiin V-APC/PI komplekti (Biolegend, San Diego, CA, USA). Kokku 10,000(rakud/süvend) ASC-d külvati 6-süvendiga plaatidele ja inkubeeriti 37 kraadi juures 5% CO2-ga. Rakke töödeldi metformiiniga (0,25 mM, 0,5 mM, 1 mM, 2,5 mM ja 5 mM) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Pärast 72-tunnist töötlemist rakud koguti trüpsiniseerimisega ja värviti 2,5 µl AnnexinV-APC ja 2,5 µL PIin sidumispuhvriga, inkubeeriti pimedas toatemperatuuril 15–20 minutit ja analüüsiti voolutsütomeetria abil (Fortessa, BD, NJ, USA).

2.10. Reaktiivsete hapnikuliikide tuvastamine

ROS-i tasemed määrati fluorestseeruva värvaine 2',7'-diklorofluorestseiindiatsetaadi (DCFH2-DA) sondiga (Invitrogen, Waltham, MA, USA). ASC-sid (10, 000 rakku süvendi kohta) kultiveeriti 6-süvendiga plaadil ja inkubeeriti metformiiniga (5 mM) 37 kraadi juures 5% CO2 72 tundi. Pärast inkubeerimist trüpsiiniti ASC-sid ja värviti 50 μM DCFH2-DA värviga 30 minutit 37 kraadi juures ning analüüsiti fluorestsentsmikroskoobiga.

2.11. TMRM värvimine

ASC-sid (10,000 rakku süvendi kohta) kultiveeriti 6-süvendiga plaadil, töödeldi erinevate metformiini annustega (5 mM) 72 tundi ja inkubeeriti 37 kraadi juures 100 nM TMRM-iga (Sigma-Aldrich). , St. Louis, MO, USA) 30 minutit temperatuuril 37 °C. Pärast inkubeerimist vaadeldi rakke fluorestsentsmikroskoobi all. Image] kasutati mikroskoopiliste kujutiste fluorestsentsi kvantifitseerimiseks.

2.12. Kvantitatiivne RT-PCR geeniekspressioon

Kogu RNA eraldati RNeasy Micro Kitiga (Qiagen, Hilden, Saksamaa) ja cDNA süntees viidi läbi RevertAid First Strand cDNA sünteesikomplektiga (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Geenispetsiifilised praimerid osteti firmast Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA. Kvantitatiivne ekspressioonianalüüs viidi läbi, kasutades Quantstudio 3 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). MRNA kvantifitseerimine viidi läbi, kasutades normaliseerimiseks -aktiini. Iga geeni transkripti andmed normaliseeriti, arvutades erinevuse (ACt) Ct-housekeeping ja Ct-Target geenide vahel. Ekspressiooni suhteline suurenemine või vähenemine arvutati võrdlusgeeni võrdlemisel sihtgeeniga (AACT), kasutades suhtelise ekspressiooni valemit (=24ACt).

2.13. Western Blot

Western blot analüüs viidi läbi põhimõtteliselt nagu kirjeldatud [19]. Valgutaseme normaliseerimiseks kasutati "Pierce BCA Protein Assay Kit" (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) meetodit. Rakulüsaadid (15 ug üldvalku raja kohta) valmistati naatriumdodetsüülsulfaadi (SDS) proovipuhvris, eraldati SDS-PAGE abil ja blotiti polüvinülideendifluoriidmembraanidele. Kasutati järgmisi antikehi: hiire anti-inimese -aktiin (Proteintech, IL, USA), perilipiin (Cell Signaling, MA, USA), fosfor-P70S6K (Cell Signaling, MA, USA), kogu P70S6K (Cell Signaling, MA, USA), pERK1/2 (Cell Signaling, MA, USA), kogu ERK1/2 (Cell Signaling, MA, USA), hiirevastane IgG HRP konjugaat (Proteintech, IL, USA) ja küüliku rotivastane IgG HRP ( Proteintech, IL, USA). Densitomeetrilisteks analüüsideks kasutati Image J tarkvara. 2.14.Statistiline analüüs

Statistilised analüüsid viidi läbi GraphPad Prismis (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA). FACS analüüsiks kasutati FlowJo. Keskmiste erinevuse olulisust hinnati Studenti t-testi või dispersioonanalüüsiga. Tühja vea väärtus on esitatud keskmisena ± SEM. Väärtused olid olulised p väärtuste juures<><0.01 and=""><>

3. Tulemused

Metformiin on väljakujunenud diabeedivastane ravim, mis on näidanud olulist rolli pikaealisuse pikendamisel [31]. Metformiinravi mõju uurimiseks rasvkoest pärinevate tüvirakkude tüvele eraldasime ASC-d inimdoonorite rasvkoest kollagenaasi seedimise teel. Eraldatud ASC-d olid plastist kleepuvad ja neil oli fibroblastiline või spindlikujuline morfoloogia. Voolutsütomeetria analüüs näitas, et ASC-d olid positiivsed mesenhümaalsete tüvirakkude markerite, nagu CD29, CD90 ja CD24, suhtes, kuid negatiivsed hematopoeetilise liini markeri CD45 ja endoteeli liini markeri CD31 suhtes (joonis 1A). Lisaks ASC tüüpilise fenotüübi kuvamisele, ASC-d näitasid tugevat adipogeenset ja osteogeenset diferentseerumispotentsiaali, mis tuvastati vastavalt Bodipy ja Alizarin Red S värvimisega (joonis 1B).cistanche แอ ม เว ย์Iseloomulikke ASC-sid kasutati meie uuringu edasistes katsetes.

Kirjanduses on teatatud, et metformiin vähendab tüvirakkude adipogeenset diferentseerumist. Meie eesmärk on uurida ASC-de adipotsüütide diferentseerumise reguleerimist metformiinravi korral. ASC-sid töödeldi 1, 2, 5 ja 5 metformiiniga, alustades 2 päeva enne adipogeenset induktsiooni ja kogu diferentseerumisprotsessi vältel. Õlitilkade visualiseerimiseks 14. päeval pärast diferentseerumise esilekutsumist kasutati Bodipy ja Oil Red Ostains. Oil Red O (joonis 1C) ja Bodipy värvimise (joonis 1D) tulemused näitavad, et metformiinravi pärsib oluliselt adipogeenset diferentseerumist annusest sõltuval viisil võrreldes kontrollrakkudega. Adipogeense diferentseerumise pärssimist kinnitati täiendavalt, kasutades adipotsüütide diferentseerumismarkervalgu perilipiini Western blot analüüsi. Selleks koguti adipogeense diferentseerumise 14. päeval diferentseerunud rakkudest rakulüsaadid ja analüüsiti perilipiini ekspressiooni. Meie Western blot tulemused näitavad perilipiini ekspressiooni olulist allareguleerimist metformiinravi ajal adipogeense diferentseerumise ajal (joonis 1E), mis korreleerus Bodipy ja Oil Red O plekkide vähenemisega. Me järeldame, et metformiinravi pärsib inimese ASC-de adipogeenset diferentseerumist, kusjuures inhibeerimise ulatus on positiivses korrelatsioonis metformiini raviannusega.

Suurem diferentseerumise ja leviku määrad põhjustavad varre kadumise. Kuna me täheldasime, et metformiin vähendab adipogeenset diferentseerumist, olime huvitatud metformiinravi mõju uurimisest ASC-de proliferatsioonile in vitro. ASC-sid töödeldi metformiiniga ja rakud loendati 4. päeval pärast kultiveerimist metformiini juuresolekul või puudumisel. Meie tulemuste põhjal täheldasime, et metformiin vähendab oluliselt rakkude proliferatsiooni kiirust võrreldes kontroll-ASC-dega (joonis 2A). Tüvirakud mängivad olulist rolli kudede regenereerimisel ja hooldamisel.kui palju tsistanši võttaOma regenereeriva rolli tõhusaks täitmiseks peavad tüvirakud säilitama oma tüveomadused. Analüüsime metformiinravi mõju tüvegeenide ekspressioonile ASC-des. Sel eesmärgil kasutasime ASC-des tüve säilitamisega seotud geenide analüüsimiseks kvantitatiivset reaalajas PCR-i. Täheldasime, et metformiin reguleeris oluliselt rasvkoe tüvirakkude markerite, nagu BMP7, DPP4, Sox2, Oct3/4, Wnt2, ICAM1, CD90 ja DLK1, ekspressiooni võrreldes kontroll-ASC-dega (joonis 2B). Meie tulemused näitavad, et metformiinravi aeglustab tõhusalt ASC-de proliferatsiooni, vältides seega rakkude proliferatsiooni ammendumist, suurendades tüve allkirjageenide ekspressiooni.

Joonis 1. Metformiinravi pärsib ASC-de adipogeenset diferentseerumist annusest sõltuval viisil. (A) ASC-sid testiti CD29, CD90, CD24, CD31 ja CD45 ekspressiooni suhtes voolutsütomeetria abil. Esitatakse nii histogrammides näidatud protsentuaalne positiivsus kui ka keskmine fluorestsentsi intensiivsus (MFI), mis on näidatud kontrolli (värvimata ASC-d) ja värvitud (vastavate antikehadega töödeldud ASC-d) tabelis. (B) ASC-d allutati adipogeensele või osteogeensele diferentseerumisele, kasutades liinispetsiifilisi diferentseerumiskokteile. Diferentseerumist adipotsüütide liinist kinnitas Bodipy värvimine ja osteogeneesi kinnitas värvimine Alizarin Rediga. Alizariini punasega värvitud ala protsent arvutati pildi J abil. (C) ASC-sid töödeldi adipotsüütide diferentseerumiskokteiliga metformiini erinevate annuste juuresolekul või puudumisel 14 päeva jooksul. Adipotsüütide arengut 14. päeval pärast induktsiooni hinnati lipiiditilkade värvimisega Oil Red O värviga. Imendunud Oil Red O plekk ekstraheeriti ja mõõdeti optiline tihedus. Kontroll-ASC-de optiliseks tiheduseks võeti 100 protsenti ja graafikule kanti suhteline muutus metformiinravi ajal (n =3). (D) Lipiidide sisaldus 14. päeval määrati Bodipy värviga (roheline). Tuumade värvimiseks kasutati Hoechsti (sinist).mis on cistanche(E) Perilipiini valgu ekspressiooni Western blot analüüs. - Laadimiskontrollina kasutati aktiini. Perilipiini valguribade tiheduse kvantifitseerimine, mis on normaliseeritud -aktiinile. Kasutatud pilt J. Pildid ja graafikud esindavad kolme sõltumatut replikatsiooni (n=3). *lk<0.05,**><0.01,***p><0.001 and="" ***=""><0.0001 as="" compared="" with="">

Välistamaks, et diferentseerumise ja proliferatsiooni vähenemine ei ole tingitud metformiini tsütotoksilistest mõjudest ASC-dele, analüüsisime metformiiniga töödeldud rakkude elujõulisust. AnneksiinV/PI värvimise analüüsid voolutsütomeetria abil ei näidanud apoptootiliste või nekrootiliste rakkude olulist suurenemist, kui metformiini kontsentratsiooni suurenes kuni 5 µM võrreldes rakukultuurisöötme kontrolliga (joonis 3A). Mitokondriaalne aktiivsus ja reaktiivsete hapnikuliikide (ROS) teke on rakkude diferentseerumise jaoks olulised ning adipogeense diferentseerumise ajal on täheldatud mitokondriaalse metabolismi ja ROS-i tekke suurenemist [32]. Meie tulemuste põhjal täheldasime, et metformiinravi vähendab ASC-de adipogeenset diferentseerumist. Järgmisena uurisime mõju mitokondriaalsele aktiivsusele ja ROS-i tootmisele. ASC-sid töödeldi metformiiniga ja värviti TMRM-iga, et hinnata mitokondriaalse membraani aktiivsust, ja DCF2DA-ga ROS-i kontsentratsiooni hindamiseks. Fluorestsentsmikroskoobi kujutised ja fluorestsentssignaali kvantifitseerimine näitasid, et metformiinravi vähendab oluliselt mitokondriaalset aktiivsust (joonis 3B, C) ja ROS-i tootmist (joonis 3D, E). Me järeldame, et metformiini poolt vahendatud mitokondriaalse aktiivsuse ja ROS-i tootmise vähenemine aitab kaasa ASC-de tüve suurenemisele.

Et mõista võimalikku signalisatsioonikaskaadi, mis vastutab adipotsüütide diferentseerumise, proliferatsiooni ja tüvigeenide ülesreguleerimise eest ASC-des metformiinravi korral, keskendusime mTOR-ile, autofagiale ja rakuvälisele signaaliga reguleeritud kinaasi (ERK) signaaliülekande kaskaadidele. Varasemad uuringud on näidanud nende radade olulist rolli ASC-de tüve säilitamisel [19, 33]. Nii ERK kui ka mTOR signaalimine mängib olulist rolli rakkude proliferatsiooni ja diferentseerumise edendamisel. Pärast ASC-de töötlemist erinevate metformiini annustega koguti rakulüsaadid ja analüüsiti Western blot analüüsiga LC3, fosforüülitud-p70S6 kinaasi, kogu p70S6 kinaasi, fosforüülitud-ERK42/44 ja ERKp42/44 koguantikehade suhtes. Beeta-aktiini kasutati majapidamisgeenina. Western blot analüüs näitas, et võrreldes kontroll-ASC-dega reguleeris metformiinravi fosforüülitud p70S6K ja fosforüülitud-ERK42/44 kinaasi ekspressiooni (joonis 4A, B, D). Nii ERK kui ka mTOR signaalimine mängivad olulist rolli autofagia raja reguleerimisel.bioflavonoididWestern blot tulemused näitasid, et ravi metformiiniga suurendab autofagia aktiivsust ASC-des (joonis 4A, C). Lisaks analüüsisime autofagia raja geenide ekspressiooni metformiiniga töötlemisel mRNA tasemel, kasutades kvantitatiivset reaalajas PCR-i. QPCR analüüsiga täheldasime metformiinravi korral autofagia raja geenide VMP1, P62, ATG5 ja ATG7 olulist suurenemist (joonis 4E), mis on kooskõlas meie Western blot tulemustes näidatud autofagia aktiivsuse suurenemisega. Meie analüüsides täheldati ka ATG 9 ekspressiooni mitteolulist suurenemist. Me järeldame, et metformiinravi vähendab ERK ja mTOR aktiivsust ning suurendab autofagiat ASC-des kui võimalikku alusmehhanismi proliferatsiooni ja diferentseerumise vähendamiseks ning tüve suurenemiseks.

Et rõhutada ERK ja mTOR signaaliülekande otsest rolli metformiinravi vahendatud diferentseerumise ja tüve suurenemise pärssimisel ASC-des, inhibeerisime eraldi ERK signaaliülekannet ja mTOR rada, kasutades vastavalt ERK inhibiitorit U0126 ja rapamütsiini, ning analüüsisime mõju ASC-le. diferentseerumine ja tüvilisus [19,33]. ERK inhibiitori U0126 lisamine ASC-de adipotsüütide diferentseerumise ajal vähendas oluliselt diferentseerumist, nagu näitasid Bodipy värvitud kujutised ja fluorestsentsi kvantifitseerimine (joonis 5A, B). Kvantitatiivsed reaalajas PCR tulemused näitavad tüve geenide ülesreguleerimist inhibiitori poolt vahendatud spetsiifilise inhibeerimise korral. ERK signaalimine (joonis 5C) toetas veelgi meie järeldust, et ERK raja alareguleerimine metformiinraviga aitab kaasa tüve suurenemisele.

Seejärel kasutasime rapamütsiini, tuntud mTOR raja inhibiitorit, mis võib aktiveerida autofagiat, ja hindasime mõju adipogeneesile ja tüve geeniekspressioonile [19]. Rapamütsiiniga töödeldud ASC-de rakulüsaadid koguti ja sondeeriti fosforüülitud-p70S6 kinaasi, kogu p70S6 kinaasi ja -aktiini antikehadega. Me täheldasime, et rapamütsiin reguleeris fosforüülitud-p70S6 kinaasi ekspressiooni alla (joonis 6A). Funktsionaalse rolli määramiseks adipogeenses diferentseerumises töödeldi ASC-sid rapamütsiiniga ja indutseeriti adipogeense söötmega. 14 päeva pärast värviti rakud adipogeneesi hindamiseks Bodipy värviga. Me täheldasime, et ravi rapamütsiiniga vähendas oluliselt adipogeenset diferentseerumist (joonis 6B, C). Järgmisena analüüsisime mTOR signaali ülekande blokeerimise mõju ASC-de tüvele. Sel eesmärgil töödeldi ASC-sid rapamütsiiniga ja tüvega seotud transkriptide ekspressiooni mõõtmiseks kasutati reaalajas PCR-i. Me täheldasime, et rapamütsiin reguleeris oluliselt tüvega seotud markerite ekspressiooni (joonis 6D). Me järeldame, et nii ERK kui ka mTOR radade inhibeerimine aitab kaasa adipotsüütide diferentseerumise vähenemisele ja tüve suurenemisele inimese ASC-des.

Järgmisena katsetasime, kas suudame reprodutseerida metformiiniga ravi tüve suurendavaid mõjusid 2D-kultuuritud ASC-dele keerukamas ja in vivo transleeritavas kogu rasvkoekultuuri mudelis. Selleks muutsime rasvkoekultuuri protokolli, mille on avaldanud Harms et al.30], kasutades transwell insertide asemel rakufiltreid, et hoida rasvkoe fragmendid söötme all (joonis 7A). Pärast 3-5 mm inimese rasvkoe fragmentide kultiveerimist metformiiniga või ilma metformiinita 5 päeva jooksul eraldasime rasvkoe fragmentide kollagenaasiga lagundamise teel stromaalse vaskulaarse fraktsiooni (SVF) ja analüüsisime tüvega seotud geenide ekspressiooni. Reaalajas PCR-andmed näitasid, et metformiiniga töödeldud rasvkoe SVF näitas olulist ülesreguleerimist tüvemarkerite nagu BMP7, DLK1, MYC1, DPP4, OCT3/4, Sox2, Nanog, KLF4, PDGFR ja Wnt2 ekspressioonis (joonis 7B). ).

4. Arutelu

Rasva tüvirakud (ASC-d) taastavad rasvkoe iseenesliku uuenemise ja diferentseerumise kaudu, säilitades seega koe tüvirakkude kogumi. Vananemist ja rasvumist seostatakse aga ASC-de tüveomaduste kadumisega. Metformiin on diabeedivastane ravim ja on näidanud paljulubavaid tulemusi vananemisvastase ainena. Keskendusime metformiini mõju analüüsimisele ASC-de tüvele ja selle aluseks oleva mehhanismi mõistmisele, eesmärgiga luua metformiin kui potentsiaalne vahend ASC-de tüve säilitamiseks vanusega. Meie tulemuste inimsubjektidele hõlpsamaks tõlkimiseks kasutasime inimese ASC-de 2D rakukultuuri mudelit ja kasutasime keerulisema koekeskkonna simuleerimiseks inimese rasvkoekultuuri meetodit. Me kasutasime oma uuringutes koeallikana nahaalust rasvkude. Kasutades neid erinevaid rakke ja koekultuuri meetodeid, uurisime metformiinravi mõju ASC-de tüvele.

Rasvumine põhjustab muutusi ASC diferentseerumise kineetikas, mis vähendab tüvirakkude kogumit. Meie tulemused näitasid, et võrreldes töötlemata ASC-dega vähendas metformiinravi adipogeneesi kiirust annusest sõltuval viisil. See tähelepanek on kooskõlas varasemate aruannetega, mis näitasid, et metformiin pärsib adipogeneesi rasva tüvirakkudes, luuüdi stroomarakkudes, periodontaalse sideme tüvirakkudes ja 3T3 rakuliinides [34-37]. Tüvirakkude proliferatsioonikiirus mängib olulist rolli tüvirakkude kogumi, tüvirakkude ja eneseuuendusvõime säilitamisel. Me täheldasime, et metformiin inhibeeris ASC-de proliferatsiooni, põhjustamata ASC-dele tsütotoksilist toimet, mis on kooskõlas teiste hiirte rasvkoest pärinevate tüvirakkude [28], stroomarakkude ja fibroblastide [38,39] kohta avaldatud uuringutega.osta cistancheHiljutine uuring, milles kasutati hobuste rasvkoest pärinevaid tüvirakke, näitas metformiini proliferatsiooni soodustavat toimet [27]. Nende vastuoluliste tähelepanekute kõige tõenäolisem seletus on erinevus doonoriliikides ja rakkude kogumise anatoomilises kohas, kuna hobuse ASC-d koguti sabast. Agnieszka Smieszek jt. täheldas, et metformiin pärsib rakkude proliferatsiooni ja soodustab rakusurma suurenevate annustega (5 ja 10 mM) hiire luuüdist pärinevates stroomarakkudes ja Balb/3T3 embrüonaalses fibroblasti rakuliinis [40]. Lisaks pärsib metformiin hiire lihastest eraldatud satelliitrakkude proliferatsiooni |41. Meie vaatlust toetavad Min-lung Park jt. teatas, et metformiin parandab inimese ASC-de põletikuvastast omadust, vähendades IL-1, IL-6 ja TGF- ekspressioonitaset; metformiin suurendab ka siirdatud ASC-de ellujäämist ja kaitseb apoptootilise rakusurma eest [42]. Need tulemused näitavad metformiinravi erinevat mõju erinevatest liikidest pärinevate rakkude elujõulisusele ja sellele, et inimese ASC-d on resistentsed metformiinravi võimalike tsütotoksiliste mõjude suhtes.

ASC-de diferentseerumine adipotsüütideks on seotud suurema energiavajaduse ja ainevahetuse kiirusega, mille tulemuseks on suurem mitokondriaalne aktiivsus ja ROS-i tootmine. ROS mängib kriitilist rolli täiskasvanud tüvirakkude vaikuse ja tüvisuse säilitamisel, kuna kõrgem ROS-i tase surub rakke diferentseerumise ja lõpuks tüvirakkude vananemise ja rakusurma suunas [43]. Me täheldasime, et metformiin vähendab oluliselt mitokondriaalse membraani potentsiaali ja reaktiivsete hapnikuliikide teket. Kooskõlas meie andmetega teatasid varasemad uuringud ka, et metformiin vähendab oksüdatiivset stressi ja parandab antioksüdantide ekspressiooni hiire embrüonaalsetes fibroblastides [44], hiire ASC-des [38] ja inimese aordi endoteelirakkudes [45]. Lisaks teatasid Chien-Hung Lin jt kooskõlas meie uuringuga, et metformiin toimib neuroprotektiivse ainena, vähendades oksüdatiivset stressi inimese närvi tüvirakkudes [46]. Mitmed teised uuringud kinnitavad, et metformiin toimib antioksüdandina, vähendades oksüdatiivset stressi ja suurendades antioksüdantsete ensüümide ekspressiooni, nagu superoksiiddismutaas hiire ASC-des, hiire C2C12 müoblastides ja tsirkuleerivates inimese endoteeli eellasrakkudes [38, 47, 48]. Veelgi enam, Alejandro Martin-Montalvo et al. toetab meie tähelepanekut, mis näitab, et metformiin inhibeerib märkimisväärselt mitokondriaalset kompleksi, pärssides hiirte mitokondriaalset hingamist [49] Metformiini mõju vähenenud reaktiivsete hapnikuliikide tekkele on tõenäoliselt vahendatud redutseeritud glutatiooni [50] suurenemisest mehhanismis, mis hõlmab redoks- tundlik transkriptsioonifaktor Nrf2 [51].

On näidatud, et metformiin soodustab satelliitrakkude rahuolekut, vähendades proliferatsiooniks ja diferentseerumiseks vajalikku metabolismi. Erinevad uuringud kinnitavad ka, et metformiin soodustab tugevalt tüvirakkude tüve ja noorenemist [23,39,41,49,52,53]. Samuti on teada, et see parandab oluliselt ja suurendab tüvirakkude markerite ekspressioonitasemeid. Kuna me täheldasime, et metformiin pärsib proliferatsiooni ja adipogeneesi, pärssides oksüdatiivset stressi ja mitokondriaalset aktiivsust, püüdsime kinnitada, kas metformiin parandab tüve ASC-des või in vitro rasvkoekultuuri mudelis. Sellest lähtuvalt täheldasime, et metformiin parandas oluliselt DPP4, Wnt2, THP1, DLK1, PDGFR, ICAM1, anneksiin3, Oct3/4, Nanog, BMP4, SOX2 ja Mycl tüvega seotud markerite ekspressiooni 2D ASCculture ja rasvkoekultuuri mudelites. . Terve rasvkoekultuuri kasutamine pakub ainulaadset võimalust simuleerida inimese koe mikrokeskkonda in vivo, kus rakud on orienteeritud nagu oma loomulikus arhitektuuris ja neil on koemaatriksisse kootud interaktiivne tugi erinevatelt rakutüüpidelt. Meie teadmiste kohaselt demonstreerib meie uuring esimest korda metformiini ravi tüve suurendavat toimet inimese ASC-dele nii 2D kui ka tervete rasvkoekultuuride puhul. Leiame, et meie tulemused, mis näitavad tüvegeenide signatuuri ülesreguleerimist metformiiniga töödeldud rasvkoe fragmentidest eraldatud ASC-des, toetavad metformiini kasutamise edasist uurimist vananemisprotsessi aeglustamiseks ja vananenud rasvkudede noorendamiseks.

Rapamütsiini (mTOR) mehhaaniline sihtmärk mängib tüvirakkude proliferatsioonis ja diferentseerumises võtmerolli. MTOR-i aktiivsuse alamoduleerimine geneetilise manipuleerimise, terapeutilise sekkumise või elustiiliga seotud muutuste abil suurendab tüve ja pikaealisust [19, 20]. Kuna me täheldasime, et metformiin inhibeerib adipogeneesi, testisime metformiini mõju mTOR signaaliülekandele. Huvitaval kombel näitasid tulemused, et metformiin reguleerib oluliselt PS70S6 kinaasi fosforüülimise taset, mis on mTOR-ist allavoolu peamine signaalimolekul ja mTOR-raja aktiivsuse reporter. Varasemad uuringud viitavad ka sellele, et metformiin pärsib adipogeneesi, pärssides mTOR-i signaaliülekande rada hiire embrüonaalsetes fibroblastides (MEF), C3H10T1/2 hiire mesenhümaalsetes tüvirakkudes ja 3T3-L1 preadipotsüütides [34]. Rapamütsiini mehaaniline sihtmärk koosneb kahest kompleksist, mTORCl ja mTORC2, ning signaalimine mängib olulist rolli adipogeneesis. On näidatud, et mTORC1 signaaliülekande inhibeerimine rapamütsiiniga kahjustab adipogeneesi, kuna väheneb PS6 kinaasi fosforüülimine 3T3-L1 preadipotsüütides. Need uuringud näitasid ka, et mTOR-i signaaliülekande pärssimine pärsib adipogeneesi, vähendades adipotsüütide liini markerite, nagu PPARgamma, CEBPI, CEBP1 ja adiponektiin, ekspressioonitasemeid [54-56]. Lisaks vahendab mTOR signaaliülekannet S6 kinaasi fosforüülimine. Näidati, et S6 kinaasi pärssimine on adipogeneesi kahjustuse tõttu vastupidav rasvumise ja kehakaalu tõusule kõrge rasvasisaldusega dieedi tingimustes [57]. Kinnitasime oma tähelepanekut metformiini poolt vahendatud mTOR aktiivsuse allareguleerimise kohta kui tüve suurenemise ja ASC-de diferentseerumise vähenemise võimalikku vahendajat, kasutades rapamütsiini, mis blokeerib spetsiifiliselt m TOR raja aktiivsust.

Lisaks mTOR-ile mängib ERK signaalirada proliferatsioonis ja adipogeneesis olulist rolli. Xiaomin Ning jt väidavad oma väljaandes, et adipogeneesi aktiveerib ERK signaalimine [58]. Kuna me täheldasime, et metformiin inhibeeris adipogeneesi ja proliferatsiooni, otsustasime uurida metformiini mõju ERK signaaliülekandele. Kooskõlas varasemate aruannetega viitasid meie tulemused ka sellele, et metformiin võib pärssida adipogeneesi, pärssides ERK signaaliülekannet koos tüvega seotud geeniekspressiooni suurenemisega. mTOR signaaliülekanne on vajalik rakkude proliferatsiooniks ja diferentseerumiseks ning see on autofagia negatiivne regulaator [{{2 }}]. Kuid autofagia kadumine on seotud tüve kadumisega, kuigi metformiinravi parandas tüvega seotud geeniekspressiooni, aktiveerides autofagiaga seotud markerite ekspressiooni, nagu LC3Il. Seega näitavad meie tulemused, et metformiin kahjustab adipogeneesi, parandades inimese ASC või inimese rasvkoekultuuri mudelite tüve autofagia aktiveerimise ja mTOR signaaliradade pärssimise kaudu. Tulevased in vivo loomade ja inimeste uuringud, mis keskenduvad metformiini mõju hindamisele ASC-de bioloogiale, juhivad metformiini kui tüvirakkude vananemisvastase ainena kasutamise kohandamist.

See artikkel on välja võetud ajakirjast Biomedicines 2021, 9, 1782. https://doi.org/10.3390/biomedicines9121782 https://www.mdpi.com/journal/biomedicines