Neferiini allergia- ja põletikuvastane toime RBL-2H3 Cells Plusile

Palun võtke ühendustoscar.xiao@wecistanche.comrohkem informatsiooni

3. Arutelu

Atoopilise dermatiidi (AD) patogenees ei ole täielikult teada, kuid haigust vahendab ebanormaalne immuunglobuliin E (IgE) immuunvastus naha barjääri düsfunktsiooni korral. Nende hulgas võivad nuumrakud (MC) põhjustada IgE-vahendatud allergilisi haigusi, sealhulgas AD. Kui nuumrakud on aktiveeritud, vabastavad nad oma membraaniga seotud tsütoplasmaatilised osakesed, mis viib mitmesuguste molekulide vabanemiseni. Need molekulid mängivad olulist rolli AD patogeneesis ja peremeesorganismi kaitses [27]. Kuna nuumrakkude aktivatsiooni või degranulatsiooni pärssimine aitab reguleerida erinevaid IgE-vahendatud ülitundlikkusreaktsioone, on nuumrakud üks ideaalseid sihtmärke allergiavastaste ravimite uurimisel. Meie uuringus degranuleeritakse nuumrakud vastusena ühendile 48/80 ja kaltsiumionofoorile A23187 ning anti-DNP/IgE pluss DNP/HSA. Leidsime, et viide pärssis tõhusalt nuumrakkude degranulatsiooniefekti, näidates selle allergiavastast reaktsiooni. Veelgi enam, intratsellulaarse kaltsiumi suurenemine ja MAPK aktiveerimine inhibeeriti võrdlusena. Lisaks vähenes ka DNCB põhjustatud naha nuumrakkude infiltratsioon ja ühendi 48/80 põhjustatud kriimustuskäitumine. Seetõttu on neferiini atoopilise dermatiidi mehhanismil keratinotsüütidele ja nuumrakkudele kordistav toime.

La patogenia de la dermatitis atópica (DA) no se comprende por completo, pero la enfermedad está mediada por una respuesta inmunitaria anormal de la inmunoglobulina E (IgE) en la disfunción de la barrera cutánea. Entre ellos, los mastocitos (MC) pueden causar enfermedades alérgicas mediadas por IgE, sealhulgas EA. Cuando los mastocitos se activan, liberan sus partículas citoplásmicas unidas a la membrana, lo que lleva a la liberación de una variedad de moléculas. Estas moléculas juegan un papel fontose en la patogénesis de la EA y la defensa del huésped [27]. Debido a que la inhibición de la activación o desgranulación de los mastocitos ayuda a regular varias reacciones de hipersensibilidad mediadas por IgE, los mastocitos son uno de los objetivos ideales para explorar fármacos antialérgicos. En nuestro estudio, los mastocitos se desgranulan en respuesta al compuesto 48/80 y al ionóforo de calcio A23187, y anti-DNP/IgE plus DNP/HSA. Encontramos que la referents inhibió efectivamente el efecto de desgranulación de los mastocitos, mostrando su reacción antialérgica. Además, el aumento de calcio intracellular y la activación de MAPK fueron inhibidos por reference. Además, también se redujeron la infiltración de mastocitos en la piel causada por DNCB y el comportamiento de rascado causado por el compuesto 48/80. Por lo tanto, el mecanismo de la dermatitis antiatópica de la neferina tiene un efecto multiplicador sobre los queratinocitos y los mastocitos.

Lisateabe saamiseks klõpsake siin

Kudedes leiduvate nuumrakkude tsütoplasma on täidetud suurte, tihedate eelnevalt moodustunud põletikumediaatorite osakestega[28]. Nende vahendajate vabastamise protsessi nuumrakkude sekretoorsetest graanulitest nimetatakse degranulatsiooniks. Kuna nuumrakkude degranulatsiooni pärssimine võib reguleerida erinevaid IgE-vahendatud ülitundlikkusreaktsioone, on nuumrakud üks ideaalseid sihtmärke allergiavastaste ravimite uurimisel [29,30]. Meie tulemused näitavad, et referentsil on väga hea mõju nuumrakkude degranulatsioonile, sõltumata antigeeni, retseptori stimulaatori või ionofoori kasutamisest. See näitab, et referents on potentsiaalne allergiavastane aine (joonis 2).

MC aktiveerimise indikaatoritena saab kasutada kõiki eelsalvestatud graanuleid, äsja sünteesitud vahendajaid ja isegi graanuleid ja nende komponente [31]. Lisaks on standardmeetodiks intratsellulaarse Ca4t kontsentratsiooni mõõtmine. Enamik MC sekretsiooni suurendavaid aineid (nt antigeen, ühend 48/80), mida on üldiselt laboris kasutatud, põhjustas intratsellulaarse Ca2 pluss kontsentratsiooni tõusu. Tegelikult võib intratsellulaarse Ca2 pluss kontsentratsiooni suurenemine samuti vallandada MC degranulatsiooni. Tavaliselt indutseeritakse intratsellulaarse Ca4t suurenemine MC aktiveerimisega selliste ühenditega nagu thapsigargin (täpsemalt blokeerib Sarco/endoplasmaatilist Ca2 pluss ATPaasi, SERCA) pumpade ja ionofooridega (st ionomütsiin ja A23187) [32,33]. Seetõttu peetakse Ca2t-sõltuva MC aktiveerimise korral Ca2t sissevoolu mõõtmist ka MC aktiveerimistingimuste määramise meetodiks. MC-uuringutes kasutatakse Fura{15}} laialdaselt intratsellulaarse Ca2 pluss muutuste määramiseks. Meie katsetes leidsime, et aktiveeritud nuumrakkude fluorestsentsi intensiivsus oli pärast viitega töötlemist oluliselt alla surutud (joonis 3). Varasemad aruanded näitasid, et intratsellulaarse Ca4t kontsentratsiooni tõus oli kooskõlas histamiini vabanemisega [34]. Seetõttu järeldame, et võrdlusravi pärsib ka histamiini vabanemist. Selle hüpoteesi kontrollimiseks on õigustatud täiendavad katsed.

Nuumrakkudel on oluliselt erinevad funktsionaalsed väljundid.cistanche dosage redditNeed hõlmavad degranulatsiooni, arahhidoonhappe prekursorite moodustumist, kemotaksist ja tsütokiinide tootmist ning kõik sõltuvad teatud määral kaltsiumi signaalidest, sõltumata stimulantidest [32]Aktiveeritud MC vabastab tsütokiine, mis on allergiate ja põletikuliste haiguste peamised vahendajad [32] 35]. Tsütokiinide tootmine aktiveeritud nuumrakkude poolt on nendes rakkudes tsütokiini geenide transkriptsiooni indutseerimise tulemus. Nuumrakkude stimuleerimine viib NF-kB ja AP-1 aktiveerumiseni ning paljude tsütokiinide tootmiseni [36]. MAPK kaskaadsignaaliradadel on oluline roll tsütokiinide ekspressiooni reguleerimisel. Nende radade aktiveerimine PKC aktiveerimise kaudu PI-ga põhjustab erinevate geenide, sealhulgas põletikuliste tsütokiinide, nagu IL-1, IL-6 ja TNF [37], aktiveerimise. Meie hiljutised uuringud on näidanud, et võrdlus võib pärssida keratinotsüütide aktiveerimisel vabanevaid tsütokiine. Samal ajal avastasime ka, et MAPK aktivatsiooni rada pärsib ka võrdlusravi [18]. Meie praeguses uuringus näitasime, et viide võib vähendada ka tsütokiinide ekspressiooni MAPK aktivatsiooni pärssimise kaudu nuumrakkudes (joonised 4 ja 5). NFkB aktivatsioon väheneb ka MAPK aktivatsiooni pärssimise tõttu (joonis 6).

Cistanche on vananemisvastane toime

Mitmed uuringud on teatanud, et AD-patsientidel on mitmesuguste tsütokiinide taseme tõus, mis põhjustab nahabarjääri düsfunktsiooni, sealhulgas keratinotsüütide ja Th{0}}tuletatud tsütokiinide poolt sekreteeritud tsütokiinid [38,39]. Lisaks on teatatud, et need sekreteeritud tsütokiinid võivad samuti alla reguleerida tiheda ühenduse (T]) valkude ja terminaalsete diferentseerumisgeenide, sealhulgas filagriini (FLG), lorikriini (LOR) ja involukriini (IVL) ekspressioone [39,40 ](Pro)filaggriini ekspressioon on AD korral vähenenud ja on vastupidiselt seotud MC trüptaasi ja IL-ga-6[41]. IL-1 vahendab kroonilist põletikku kahjustatud nahabarjääriga hiirtel [35]. Eelmises uuringus teatati, et FLG, IVL ja LOR ekspressioonid olid pärast DNCB manustamist NC/Nga hiirte seljanahale alla reguleeritud [42,43]. Käesolevas uuringus olid FLG, IVL ja LOR ekspressioonid kontrollrühma seljanahas märkimisväärselt vähenenud, mis näitas, et epidermaalne barjäär oli kahjustatud. Võrdlusravi manustamine taastas pärast DNCB ravi märkimisväärselt FLG, IVL ja LOR ekspressioonide vähenemist, samas kui võrdlusmanustamine suurendas veidi IVL ja LOR ekspressiooni võrreldes kontrollrühmaga (joonis 8). On teada, et ühend 48/80 on tõhus naha nuumrakkude aktivaator. Ühendiga 48/80 stimuleeritud naha reaktsioon võib esile kutsuda kriimustuskäitumist, vabastades nuumrakkudest histamiini [44]. Aktiveeritud nuumrakkudest vabanev histamiin mängib olulist rolli ühendi 48/80 põhjustatud veresoonte läbilaskvuse suurenemises. Inimese sügeluse ajal võetakse arvesse ka nuumrakkudest erinevate stiimulite kaudu vabanenud histamiini. oluliseks vahendajaks. Seetõttu on nuumrakkude degranulatsiooni pärssimine oluline samm histamiini vabanemise reguleerimisel kriimustuskäitumise ajal. Selles uuringuühendis põhjustas 48/80 naha nuumrakkude tõhusa aktiveerimise. Kuid eeltöötlus viitega vähendas oluliselt nuumrakkude degranulatsiooni taset (joonis 2).cistanche ekstrakti eelisedNeed tulemused näitavad, et kriimustusvastane käitumuslik mõju võib olla tingitud veresoonte läbilaskvuse vähenemisest nuumrakkude degranulatsiooni reguleerimise kaudu (joonis 9).

Üldiselt on kindlaks tehtud, et AD-patsientidel on nahabarjääri düsfunktsioon, nahapõletik või mõlemad, mistõttu on raske leida sobivaid ravimeetodeid. Seetõttu on tavaliselt soovitatav kombineeritud ravi. Meie hiljutised uuringud on tõestanud, et sellel pole kunagi immunomoduleerivat funktsiooni ega barjääri parandamise võimet. Seetõttu on tulevikus AD-ravi oluliseks võrdlusaluseks naha funktsiooni säilitamine ning naha niisutatuse ja barjääri parandamise parandamine. Viide võib vähendada ka allergeenide ja ärritajate poolt põhjustatud kriimustuskäitumist. Pealegi on atoopiline marss nähtusega seotud haigus, mis tekib ja progresseerub samm-sammult. Atoopilist dermatiiti täheldatakse sageli imikueas. Toiduallergia tekib sageli pärast 1-2eluaastat. Allergiline riniit võib sageli alata enne ja pärast kooli. Astma sümptomid ilmnevad erinevatel aegadel, kuid enamik neist on pärast allergilist nohu. Pärast lapsepõlve võib atoopiline dermatiit ja teatud toiduallergiad paraneda või kaduda. Allergiline riniit ja astma ei ole kergesti ravitavad[45,46]. Seetõttu on need haiguste puhul kaasuvad nähtused. Loodustoodetel, sealhulgas viidetel, on kaasuvate haiguste ravipotentsiaal ja nende tõhusust seotud haiguste puhul tasub edaspidi uurida.

4. Materjalid ja meetodid

4.1. Roti basofiilsed leukeemiarakud

Roti basofiilsed leukeemiarakud (RBL{0}}H3) kinkis Taiwani Taoyuani Chang Gungi ülikooli TLHwang. RBL-2H3 rakud on limaskesta nuumrakud, mida kasutatakse antigeeni või kaltsiumionofoori poolt indutseeritud degranulatsiooni, rakusisese Ca4t ja signaaliülekande uurimiseks [29]. Rakke kultiveeriti EMEM-is, mis sisaldas 10 protsenti FBS-i, koos penitsilliini ja streptomütsiiniga 37 kraadi juures 5 protsenti CO2. Iscove'i modifitseeritud Dulbecco sööde (IM) ja veiseloote seerum (FBS) osteti ettevõttest Thermo Fisher Scientific (GIBCOTM, New York, NY, USA).

4.2.MTT analüüs

Mõõtmiseks kasutatakse 3-(4,5-dimetüültiasool-2-üül)-2,5-difenüül-2H-tetrasooliumbromiidi (MTT) testi rakkude metaboolne aktiivsus. RBL-2H3 rakud külvati 24-süvendiga kultuuriplaadile 5 × 10 pluss süvendi kohta. Pärast 24-tunnist ravimiga töötlemist lisati 30 µl MTI süvendi kohta ja pandi 2-4 tunniks 37-kraadisesse rakuinkubaatorisse, seejärel lahustati purpursed formatsaani kristallid DMSO-ga. ELISA lugejat kasutati neeldumise intensiivsuse mõõtmiseks lainepikkusel 550 nm rakkude elujõulisuse testina.

4.3. Intratsellulaarse Ca2 pluss taseme mõõtmine

[Ca2t] Mind mõõdeti fura-2-ga, nagu eelnevalt kirjeldatud[47]. RBL-2H3 rakud resuspendeeriti IMDM-is, mis sisaldas 5 uM Fura 2-AM ja 1,2 mM CaClz 37 kraadi juures. 30 min. Pärast Fura{11}} laadimist keratinotsüüdid sadestati ja resuspendeeriti värskes DMEM-is. Alikvoot (2 ml) kanti üle segatavasse küvetti, mis sisaldas 1,2 mM CaClz. Fura-2-Ca fluorestsentsi analüüsiti ergastuslainepikkustel 340 ja 380 nm (emissiooni lainepikkus 505 nm) seadmes {{{19Elmer LS }} spektrofluoromeeter (PerkinElmer Life and Analytical Sciences). Andmed registreeriti 5-sekundiliste intervallidega[47].

4.4. Kvantitatiivne polümeeri ahelreaktsioon (qPCR)

RBL{{0}}H3 rakud istutati 3,5 cm kultiveerimisnõusse. Pärast seda, kui rakud kasvasid 90 protsendini, kasvatati rakke staatilises olekus 24 tundi. Pärast rakkude 20-minutilist eeltöötlemist stimuleeriti neid TNF-a / IFN-y-ga vastavalt 1 või 24 tundi. Rakud kaabiti ära, tsentrifuugiti (16,000×g, 10 min, 4 kraadi) ja supernatant ekstraheeriti. RNA puhastamiseks kasutati kogu RNA isolatsioonikomplekti (GeneDirex@, Vegas, NV, USA). Skripti cDNA sünteesikomplekti (BIO-RAD) tööprotseduuri kohaselt lisati reagendid järjekorras ja neid kasutati vastavalt näidatud tingimustele, et muuta RNA cDNA-ks. Lisaks kasutati PowerUpTM SYBRTM Green Master Mix (Applied BiosystemsTM). Lisati kokku 7,5 uL ddH20, 2 uL cDNA-d, 0,25 μLof päri- ja tagurpidi praimereid ning 10 uL SYBR GREENi ja segati ühtlaseks. Praimeri järjestused on näidatud tabelites 1 ja 2. Seejärel kvantifitseeriti RNA, kasutades ABI StepOnePlusTM Real-time PCR süsteemi.

4.5. Western blot test

Western blot analüüsi kasutatakse erinevate valkude muutuste analüüsimiseks rakkudes. RBL{{0}}H3 rakud külvati 3,5 cm kultiveerimisnõusse. Pärast seda, kui rakud kasvasid 90 protsendini ja neid nälgiti 24 tundi, töödeldi neid 20 minutit võrdlusega ja seejärel stimuleeriti TNF-a või IFN-y-ga vastavalt 30 minutit või 1 tund. Pärast kraapimist pulbristati need ultraheliga ja tsentrifuugiti (13 200 pööret minutis, 10 min, 4 kraadi). Pärast tsentrifuugimist võeti supernatant ja valk kvantifitseeriti Pierce'i valguanalüüsi komplektiga (Pierce, Rockford, IL, USA). Seda elektroforeesiti 10% SDS-polüakrüülamiidgeelil ja seejärel elektroporeeriti PVDF membraaniga. Pärast ülekande lõpetamist pandi PVDF membraan TBS-T (Tris-puhverdatud soolalahus/0,05% Tween 20) lahusesse, mis sisaldas 5% lõssipulbrit, ja loksutati 1 tund, et vältida mittespetsiifilist seondumist. Seejärel kasutati TBS-T pesemiseks 3 korda, iga kord 10 minutit. Seejärel lisati primaarsed antikehad (lahjendus 1:1000) ja asetati ööseks temperatuurile 4 kraadi ning pesti seejärel 3 korda TBS-T-ga iga 10 minuti järel. Pärast sekundaarsete antikehade (lahjendatud 1:1000) lisamist 1 tunni jooksul pesti PVDF membraani 3 korda TBS-T-ga iga kord 10 minutit. Lõpuks lisati ilmuti ja membraan asetati pildistamiseks keemilise luminestsentsi ekstraheerimissüsteemi (BIOSTEP Celvin).

4.6. Dinitroklorobenseen(2,4-Dinitrokloroben2een, DNCB) Atoopilise dermatiiditaoline nahapõletik hiirtel

Esiteks jagati hiired nelja rühma: kontrollrühm, DNCB rühm (negatiivne rühm), võrdlusrühm (3 mg/kg ja 10 mg/kg) DNCB rühmaga ning deksametasoon (0,2 mg/kg) koos DNCB rühmaga. DNCB rühm (positiivne rühm). Deksametasoon on kortikosteroidhormoon, mis võib vähendada turset ja allergilisi reaktsioone. Selles in vivo katses lahustati nii etalon- kui ka deksametasoon DMSO-s, samas kui DNCB lahustati 75-protsendilises etanoolis ultrahelišokiga. Esimest manustati intraperitoneaalse süstina ja teise jaoks kanti seljanahale 100 uL ja paremasse kõrva 20 μL. Kolm päeva enne katset hiired tuimastati ja seljakarvad eemaldati ning hiire tagajalgade tagaküljele kinnitati väike mõõtemagnet (SCT-MAG-TF).cistanche tšingis-khaanPärast kolmepäevast puhkamist kinnitati, et hiired olid heas füüsilises seisukorras ja seljadepilatsioonipiirkonna nahk normaalne ning katset alustati. Katse käigus tehti naha välimuse muutuste jäädvustamiseks fotod. Esimene etapp ({{0}} päeva) oli allergilise atoopilise dermatiidi periood. Pärast DNCB rühma, võrdlusrühma (3 ja 10 mg/kg) ja DNCB katserühma ning deksametasooni 0,2 mg/kg ja DNCB katserühma hiirte põhiväärtuste mõõtmist kanti 1% DNCB ühtlaselt seljanahale ja parem kõrv. Viiendal päeval süstiti intraperitoneaalselt ravimite võrdlusravimit ja deksametasooni. Teine etapp (5. päev kuni 14. päev) oli atoopilise dermatiidi taasindutseerimine.cistanche eluea pikendamineKolmes katserühmas määriti hiirte seljanahale ja paremale kõrvale ühtlaselt 0,5 protsenti DNCB-d. Järgmisel päeval tehti ja registreeriti naha füsioloogilised väärtused ja pildid. Pärast hiirte surmamist liigse süsinikdioksiidiga (CO2) 15. päeval eemaldati dorsaalne nahakude järgnevaks eksperimentaalseks analüüsiks.

4.7. Ühend 48/80-BALB/c hiirte põhjustatud kriimustuskäitumine

Hiire selja naha karvad lõigati ja süstiti intrakutaanselt 20 μL ühendi 48/80 lahust. Kontrollhiired said selle asemel soolalahuse süsti. Kohe pärast süstimist pandi loom vaatluspuuri (läbimõõt 11 cm, MicroAct, Neuroscience, Tokyo, Jaapan) ning hiire kriimustuskäitumine tuvastati ja hinnati automaatselt ja objektiivselt. Kriimustuste käitumist mõõdeti 60 min. MicroAct kasutab hiirte pidevale kriimustuskäitumisele vastavate lainete tuvastamiseks järgmisi analüüsiparameetreid: lävi, 0,05 V; sündmuste vahe,0,05 s; minimaalne kestus,0,25 s; maksimaalne sagedus, 30 Hz; minimaalne sagedus 5Hz. 4.8.Statistiline analüüs

Statistiliseks analüüsiks kasutati tarkvara Sigma-Plot (versioon 10.0).cistanche nzAndmed on väljendatud keskmisena ± SEM, (*) ja (#) märkustena. Andmete statistilist olulisust analüüsiti paaritute, kahepoolsete Studenti t-testide.p väärtustega, mis olid väiksemad kui 0.05 ja 0,01 peeti oluliseks.

5. Kokkuvõtted

Selles uuringus tegime kindlaks, et referents pärsib tõhusalt nuumrakkude degranulatsiooni ja vähendab põletikueelsete tsütokiinide ekspressiooni, mis võib vähendada atoopilise dermatiidiga sarnaseid sümptomeid, taastada naha barjääri ja vähendada naha kriimustamist. Lisaks oleme tõestanud, et viide ei mõjuta mitte ainult naha keratinotsüüte, vaid mõjutab ka nuumrakkude aktiveerimist. Sellel on suurem potentsiaal kasutada allergiliste ja põletikuliste nahahaiguste korral.

See artikkel on välja võetud artiklist Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 10994. https://doi.org/10.3390/ijms222010994 https://www.mdpi.com/journal/ijms