Makrofaagide aktiveerimine Cistanche Deserticola madala molekulmassiga sahhariidide abil

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com

［ Absttegu!

Uurida madala molekulmassiga sahhariidide immuunsüsteemi aktiveerivat toimet ja mehhanismiCistanche deserticola(LMSC) hiire peritoneaalsetel makrofaagidel, RAW264. 7 rakku. RAW264. 7 rakku jagati normaalseks kontrollrühmaks, LPS-positiivseks kontrollrühmaks ja LMSC-ga ravirühmadeks. RAW264. 7 rakku töödeldi erineva kontsentratsiooniga LMSC-ga vahemikus 3,91 kuni 62,5 g · 1. Makrofaagide fagotsüütilise aktiivsuse tuvastamiseks kasutati neutraalset punast testi. NO vabanemine tuvastati NO komplekti ja makrofaagide aktiveerimisega seotud valgu ekspressioonitasemete (TNF-, IL-6, IKK, p-IKK, IkB, p-IkB, NF-κB ja p-NF-κB) abil. tuvastati Western blot abil. Tulemused näitasid, et LMSC-l oli makrofaagidele aktiveeriv toime; see võib oluliselt suurendada NO vabanemist RAW264-s. 7 rakke ja soodustavad tsütokiinide TNF- ja IL-6 ekspressiooni. Veelgi enam, LMSC suurendas märkimisväärselt IKK, IKB ja NF-κB p65 fosforüülimist. Lisaks suurendas mannitool LMSC üks peamisi koostisosi oluliselt makrofaagide fagotsüütilist aktiivsust. Need tulemused näitasid, et LMSC võib aktiveerida makrofaage, reguleerides NF-κB signaalirada, ja mannitool võib olla LMSC üks peamisi aktiivseid komponente.

［Märksõnad］ Madala molekulmassiga sahhariidid; Cistanche deserticola; immuunsüsteemi aktiveerimine; makrofaagid; põletikuline tegur; NF-κB

Cistanche deserticola YC Maon perekonda kuuluv taimCistanche deserticolaYC Ma. Selle lihakat vart saab kasutada ravimina. Sellel on neeru yangi toitmine, essentsi ja vere toitmine ning soolte niisutamine. Seda tuntakse kui "kõrbe ženšenn". Cistanche keemiliste komponentide hulka kuuluvad fenüületanoidglükosiidid, iridoidglükosiidid, suhkrud, lignaanid ja paljud muud tüübid. Kaasaegsed farmakoloogilised uuringud on leidnud, et Cistanche'il on palju bioloogilisi toimeid, nagu neuroprotektsioon, kasvajavastane, immuunregulatsioon, põletikuvastane ja antioksüdant [1]. Uuringud on näidanud, et Cistanche ja polüsahhariidide keetmine võib oluliselt parandada makrofaagide fagotsüütivõimet ja sekretsioonifunktsiooni [2-3]. Siiski puudub aruanne selle madala molekulmassiga süsivesikute tegevusuuringute kohta. Seetõttu kasutati selles uuringus RAW264 in vitro kultuurisüsteemi. 7 hiire peritoneaalset makrofaagi, et uurida Cistanche madala molekulmassiga süsivesikute immunomoduleerivat aktiivsust ja sellega seotud mehhanisme. See uurimus võib anda rohkem eksperimentaalseid tõendeid igakülgseks mõistmiseksCistanche'i immunomoduleeriv toimetulevikus, et suunata selle kliinilist rakendamist.

Cistanche deserticolal on palju mõjusid, lisateabe saamiseks klõpsake siin

1. Materjalid

RAW264. 7 rakku osteti Hiina Meditsiiniteaduste Akadeemia rakukeskusest; veiseloote seerum (FBS) osteti ettevõttelt PAN Biotech, Saksamaa; antibiootikumid ja DMEM sööde osteti ettevõttelt Zhongke Machen Technology Co., Ltd. Escherichia coli O55:B5 (LPS) lipopolüsahhariid osteti firmalt Sigma Company, USA. Lämmastikoksiidi (NO) komplekt osteti Nanjing Jianchengi biotehnoloogia instituudist. ECL kemoluminestsentsi komplekt osteti firmalt Thermo Fisher, USA; antikeha osteti ettevõttest Cell Signaling Technology, USA; Cistanche cistanche üldglükosiidid, cistanche madala molekulmassiga suhkrud ja cistanche polüsahhariidid valmistas meie uurimisrühm ise. Tistanche koguglükosiidide massiosa oli 78,76 protsenti. Madala molekulmassiga suhkrute massiosaCistanche deserticolaon 58. 00 protsenti ja massiosaCistanche deserticolapolüsahhariide on 65. 24 protsenti . Tanon-5200Multi geelkujutise split süsteem osteti ettevõttelt Shanghai Tianneng Technology Co., Ltd.; Sunrise-Basic mikroplaadilugeja osteti ettevõttelt TECAN.

2. Meetod

2. 1 Neutraalne punane meetod makrofaagide fagotsüütilise aktiivsuse mõõtmiseks

Võtke hiire kõhukelme makrofaagid logaritmilises kasvufaasis, pärast trüpsiniseerimist loendage rakud, reguleerige rakkude arv 5 × 104 rakku/ml ja inokuleerige need 96-süvendiga rakukultuuri plaadile, 100 μL süvendi kohta. , temperatuuril 37 kraadi Kultiveeritud 5% CO2 tingimustes, pärast rakkude kleepumist seina külge visake kultuuri supernatant ära, lisage DMEM söödet (10% FBS pluss 1% P/S), LPS (1 mg·L - 1) ja Cistanche vastavalt cistanche koguglükosiidid,Cistanchekultiveeriti üldpolüsahhariide ja Cistanche cistanche madala molekulmassiga suhkruid (vastavalt 3,91 ~ 62,5 g·L -1, filtreeriti enne manustamist filtermembraaniga). Pärast 48-tunnist kultiveerimist lisage igasse süvendisse 100 μL 0,075% neutraalset punast füsioloogilist soolalahust, jätkake kultiveerimist 4 tundi, aspireerige supernatant, peske 3 korda PBS-ga, lisage rakulüsaat (jää-äädikhape). -etanool 1:1) 100 μL, asetage see 2 tunniks 4 kraadi juurde ja mõõtke neelduvus (A540 nm) pärast rakkude lüüsimist.

2. 2 NO vabanemise koguse tuvastamine raku supernatandis

Inokuleerige RAW264. 7 rakku 48-süvendiga plaadile (1 × 105 rakku/ml, 500 μL süvendi kohta), aspireerige rakukultuuri sööde pärast üleöö inkubeerimist, lisage DMEM sööde (10 protsenti FBS pluss 1 protsent P/S), 500 μL kumbki LPS-i (1 mg·L -1) ja Cistanche cistanche glükosiide, polüsahhariide ja madala molekulmassiga suhkruid (vastavalt 3,91–62,5 g·L -1). Pärast 24-tunnist induktsioonikultuuri supernatant koguti. Määrake NO komplekti abil NO kontsentratsioon iga rühma raku supernatandis, järgige juhiseid ja lõpuks tuvastage neelduvus (A570 nm) mikroplaadilugejaga.

2. 3. Western blot

Inokuleerige RAW264. 7 rakku 6-süvendiga plaadile, aspireerige rakukultuuri sööde pärast üleöö inkubeerimist, lisage DMEM söödet (10% FBS pluss 1% P/S), LPS (1 mg·L–1) jaCistanchepolüsahhariide ja madala molekulmassiga suhkruid (3,91 ~ 62,5 g·L -1) oli kumbki 2 ml ja supernatant visati ära pärast 24-tunnist induktsioonikultuuri. Rakke pesti kaks korda PBS-ga ja visati ära. Pärast trüpsiinimist pipeteeritakse rakud alla. Tsentrifuugige, eemaldage supernatant, lisage 100 μL NP40 lüüsipuhvrit ja lüüsige jääl 40 minutit. Pärast tsentrifuugimist võeti supernatant ja valgu kontsentratsioon määrati BCA meetodil ning iga histooni valgu kontsentratsioon reguleeriti ühtlaselt. Võtke sama kogus valguproove ja eraldage need 12% SDS-PAGE abil konstantse rõhu all. Seejärel kasutage Bio-Rad ülekandeelektroforeesipaaki membraani ülekandmiseks konstantse vooluga 350 mA 1 tunni jooksul ja kandke valk PVDF membraanile (PVDF membraani eeltöötlus: leotage metanoolis ja tasakaalustage ülekandepuhvriga). Pärast 5-protsendilise lõssi (konfigureeritud TBST-ga, mis sisaldab 0,1 protsenti Tween-20) 1-tunnist blokeerimist toatemperatuuril, pesti membraani kolm korda TBST-ga ja membraani inkubeeriti valgu primaarses antikeha lahjendis 4 °C juures. kraadi üleöö. Membraani pesti 3 korda TBST-ga igal teisel päeval ja lisati vastav lahjendi, et inkubeerida 1 tund. Membraani pesti 3 korda TBST-ga ja ribad töötati välja ECL kemoluminestsents arendajaga.

2. 4 andmete analüüs

Andmed on väljendatud kujul x ± s ja erinevuse olulisust testitakse GraphPad Prism 6 statistilise tarkvaraga ühesuunaliseks dispersioonanalüüsiks. Võtke P<0.01 as="" a="" very="" significant="" difference,="" and=""><0.05 as="" a="" significant="">

3. Tulemused

3. 1. Cistanche cistanche madala molekulmassiga suhkrute, glükosiidide ja polüsahhariidide üldsisalduse mõju RAW264 fagotsüütilisele aktiivsusele. 7 rakku

Cistanche keemiliste komponentide uuringud näitavad sedaCistanchesisaldab peamiseltfenüületanoidglükosiidid, iridoidglükosiidid ja süsivesikud. Selles katses valitakse tsistanche glükosiidid (sealhulgas fenetüülalkoholi glükosiidid ja iridoidglükosiidid), madala molekulmassiga suhkrud ja suhkrud. Kogu polüsahhariidide kolme aktiivset saiti uuriti nende mõju osas RAW264 aktiveerimisele. 7 rakku. Nii Cistanche cistanche polüsahhariid kui ka cistanche madala molekulmassiga suhkur võivad märkimisväärselt suurendada RAW264 fagotsüütilist aktiivsust. 7 rakke, kuid kogu glükosiidide manustamise rühma fagotsüütiline aktiivsus oluliselt ei muutu. Lisaks parandas positiivne kontrollravim LPS oluliselt ka RAW264 fagotsüütilist aktiivsust. 7 rakke, nagu on näidatud joonisel 1. Ülaltoodud tulemused viitavad sellele, et Cistanche madala molekulmassiga suhkrud ja polüsahhariidid võivad avaldada RAW264 aktiveerivat toimet. 7 rakku.

3. 2. Cistanche'i üldglükosiidide, madala molekulmassiga suhkrute ja üldpolüsahhariidide mõju lämmastikoksiidi (NO) sisaldusele raku supernatandis

Cistanche kolme aktiivse saidi aktiveerimismõju edasiseks uurimiseks RAW264-l. 7 rakkudes määrati NO sisaldus erinevate ravimitega stimuleeritud raku supernatantides. Tulemused näitasid, et NO vabanemine LPS-i rühmas oli oluliselt suurem kui tühja kontrollrühmas (P<0.01); the="" release="" of="" no="" in="" the="" 5="" doses="" of="" low="" molecular="" sugar="" and="" polysaccharides="" in="" the="" cistanche="" cistanche="" group="" was="" significantly="" higher="" than="" that="" in="" the="" control="" group="" (p=""><0.01) ),="" and="" was="" dose-dependent;="" the="" total="" glycosides="" of="">Cistancheei avaldanud olulist mõju. Ülaltoodud tulemused näitavad, et nii Cistanche polüsahhariidid kui ka madala molekulmassiga suhkrud võivad soodustada NO vabanemist RAW264-st. 7 rakku. Nende hulgas on eriti oluline Cistanche madala molekulmassiga suhkrute mõju, nagu on näidatud joonisel 2.

3. 3. Cistanche cistanche madala molekulmassiga suhkru mõju TNF- ja IL-6 valgu ekspressioonile RAW264-s. 7 rakku

TNF- on oluline põletikumediaator, mis ilmneb RAW264 aktiveerimisprotsessis. 7 rakke, mis võivad soodustada teiste tsütokiinide (nagu IL-6) sünteesi ja vabanemist. Tulemused näitasid, et TNF- ja IL-6 ekspressioon suurenes oluliselt pärast Cistanche cistanche madala molekulmassiga suhkru stimuleerimist, mis viitab sellele, et Cistanche madala molekulmassiga suhkur võib soodustada TNF ekspressiooni. - ja IL{11}} RAW264-s. 7 rakke, aktiveerides seeläbi rakulise immuunsuse fagotsütoosi, vt joonis 3.

3. 4. Cistanche cistanche madala molekulmassiga suhkru regulatiivne toime IKK /IκB /NF-κB signaalirajale

Selleks, et uurida Cistanche cistanche madala molekulmassiga suhkrute potentsiaalset mehhanismi RAW264 aktiveerimisel. 7 rakke, uurisid autorid selle regulatiivset mõju IKK / IκB / NF-κB klassikalisele signaalirajale. Cistanche cistanche madala molekulmassiga suhkur võib märkimisväärselt suurendada NF-κB fosforüülimist ja selle ülesvoolu võtmesignaalvalkude IKK ja IκB fosforüülimist ning vähendada kogu IκB valgu ekspressiooni, mis näitab, et sellel on aktiveeriv toime IKK / IκB / NF-κB signaalirada. Sarnane reguleeriv toime on ka positiivsel kontrollravimil LPS. Kokkuvõttes võivad Cistanche madala molekulmassiga suhkrud aktiveerida IKK /IκB /NF-κB signaaliraja, põhjustades seeläbi tsütokiinide, nagu TNF- ja IL{13}} sünteesi ja vabanemist ning lõpuks immuunsüsteemi. RAW264 aktiveerimine. 7 lahtrit, vt joonis 4.

3. 5. Makrofaage aktiveeriva toimega toimeainete sõelumine Cistanche madala molekulmassiga suhkrutes

Meie labor on analüüsinud sisalduvaid madala molekulmassiga suhkruidCistanchevarases staadiumis ja leidis, et see sisaldab peamiselt mannitooli (16,53 protsenti), sahharoosi (8,34 protsenti), fruktoosi (25,38 protsenti) ja glükoosi (7,75 protsenti) ja muid koostisosi. Seega kasutas autor neutraalse punase meetodit ülaltoodud komponentide makrofaagidele avalduva aktiveerimismõju skriinimiseks. Mannitool võib oluliselt suurendada makrofaagide fagotsüütilist aktiivsust annusest sõltuval viisil, samas kui teiste komponentide mõju ei ole oluline. See viitab sellele, et mannitool võib olla üks peamisi aktiivseid komponente Cistanche cistanche madala molekulmassiga suhkrutes makrofaagide aktiveerimiseks, nagu on näidatud joonisel 5.

4. Arutelu

On teatatud, et Lydanaceae sugukonna parasiittaimel Cistanche cistanche on immunomoduleeriv toime, seega peaks see sisaldama immunomoduleerivaid aineid. Selles katses uuris autor hiire kõhukelme makrofaagide fagotsüütilist aktiivsust erinevatel puhastatud osadel.Cistancheja leidis, et Cistanche madala molekulmassiga suhkrud ja polüsahhariidid avaldavad makrofaagide aktiveerimise mõju, kuid Cistanche'i glükosiidide kogusumma ei ole ilmne. Samal ajal leidis autor, et madala molekulmassiga suhkrud võivad aktiveerida makrofaage madalamate kontsentratsioonide korral, mistõttu valisid autoridCistanchemadala molekulmassiga suhkrud on järgnevate uuringute keskmes.

Uurides madala molekulmassiga cistanche suhkru mõju tsütokiinide TNF- ja IL-6 ekspressioonile, leidsid autorid, et madala molekulmassiga cistanche-suhkur suurendas oluliselt TNF- ja IL-6 ekspressiooni, mis Lisaks tõestas, et madala molekulmassiga tsitanche-suhkrul on mõju hiirtele. Kõhukelme makrofaagidel on aktiveeriv toime. Nii uuris autor veelgi selle võimalikku toimemehhanismi. Tehke uuringuid

On näidatud, et bakteriaalne lipopolüsahhariid (LPS) võib indutseerida hiire makrofaagide ja hiire gliiarakkude aktivatsiooni selliste signaaliradade kaudu nagu JAK2/STAT3, NF-κB, p38/ERK ja MAPK [4-8]. NF-κB rada on tunnustatud klassikalise rajana, seega testiti selles katses sellel rajal olevaid signaalvalke. Tulemused näitasid, et Cistanche madala molekulmassiga suhkrud võivad märkimisväärselt suurendada NF-κB fosforüülimist ja peamiste ülesvoolu signaalivalkude IKK ja IκB fosforüülimist, mis viitab sellele, et madala molekulmassiga suhkrudCistanchevõib aktiveerida hiire kõhukelme hiiglasi IKK /IκB /NF-κB signaaliraja kaudu. Faagirakud vabastavad põletikulisi tsütokiine ja mängivad seejärel rolli rakulise immuunsuse aktiveerimisel.

Labori algstaadiumis uuritakse madala molekulmassiga suhkruekstrakti keemilist koostistCistanche deserticolaanalüüsiti süstemaatiliselt. On leitud, et madala molekulmassiga suhkrud sisaldavad peamiselt monomeere, nagu mannitool, sahharoos, fruktoos ja glükoos. Edasised uuringud näitasid, et mannitool võib oluliselt parandada makrofaagide fagotsüütilist aktiivsust. Seetõttu oletatakse, et mannitool võib olla madala molekulmassiga suhkrute põhikomponent, mis aktiveerib rakulise immuunfunktsiooni.

Kokkuvõttes kasutati selles uuringus makrofaage Vitro kultuurisüsteemis ja leiti, et madala molekulmassiga suhkrudCistancheomavad olulist aktiveerivat toimet makrofaagidele ja võivad aktiveerida hiire kõhukelme makrofaage NF-κB signaaliraja kaudu ja seejärel mängida rolli. Mannitool madala molekulmassiga suhkrutes võib mängida olulist rolli makrofaagide fagotsüütilise aktiivsuse aktiveerimisel.

Viited

[1] Tu Pengfei, Guo Yuhai. Cistanche kõrbe ja selle peremehe Tamarixi [M] kasvatamise tehnikad. Peking: Science Press, 2015:31.

[2] Gao Xiaoxia, Chen Jun, Peng Yanli. Uuringute ülevaade farmakoloogilistest mõjudestCistanche deserticolapolüsahhariid [J]. Food and Drugs, 2015, 17(2):136.

[3] Wang Xiangyan, Qi Yun, Cai Ruslan jt. Tistanche polüsahhariidi makrofaagide aktiveerimine [J]. Chinese Pharmacological Bulletin, 2009, 25(6):787.

[4] Liu Zhongyuan, Li Yanping. Bakteriaalse lipopolüsahhariidi bioloogiline aktiivsus ja mehhanism [J]. Medical Science Review, 2010, 16(2):166.

[5] Fu Zhihui, Xu Ling, Huang Jiao jt. LPS läbi p38 /MAPK raja ja NF-κB aktiveerimise indutseerib HIF-1 ekspressiooni RAW264-s. 7 lahtrit [J]. Chongqingi meditsiiniülikooli ajakiri, 2016, 41 (10): 1033.

[6] Hao Yutong, Chen Chunhai, Yang Xuesen jt. JAK2/STAT3 signaalirada on seotud lipopolü-suhkru poolt indutseeritud mikrogliia［J］ aktiveerimisega. Journal of the Third Military Medical University, 2009, 31(12):1119.

[7] Song Xiaomin, Liao Lixi, Dong Xin jt. Mulbascum glükosiidid inhibeerivad lipopolüsahhariididest põhjustatud BV-2 mikrogliia põletikku ja selle mehhanismi [J]. Chinese Journal of Traditional Chinese Medicine, 2016, 41(13): 2506.