LRRK2 kinaasi inhibiitor noorendab neuronaalsetes rakkudes oksüdatiivsest stressist põhjustatud rakkude vananemist, 1. osa

Palun võtke ühendustoscar.xiao@wecistanche.comrohkem informatsiooni

Taust.Leutsiinirikas korduvkinaas 2 (LRRK2) mängib Parkinsoni tõve (PD) patogeneesis kriitilist rolli. Vananemine on PD progresseerumise kõige kriitilisem riskitegur. On kindlaks tehtud seos vananemise ja rakkude vananemise vahel. Rakkude vananemine on korrelatsioonis proteolüütilise raja düsregulatsiooni ja mitokondriaalse düsfunktsiooniga, mis on samuti seotud -sünukleiini ( -syn) agregatsiooniga.Meetodid. Inimese dopamiinergilised neuronilaadsed rakud (diferentseerunud SH-SY5Y rakud) töödeldi rotenooniga LRRK2 kinaasi inhibiitori GSK2578215A (GSK-KI) juuresolekul või puudumisel 48 tundi. Rakulise vananemise markerid, sealhulgas p53, p21Wafi/Cip1(p21), -galaktosidaas (-gal), Rb fosforüülimine, vananemisega seotud (SA) -gal aktiivsus jalüsosomaalnetegevust, uuriti. Kriipsrakke ja roti primaarseid kortikaalseid neuroneid töödeldi -syn fibrillidega 30 minutit enne ravi rotenooniga GSK-KI juuresolekul või puudumisel 48 tundi. Hiirtele süstiti intraperitoneaalselt rotenooni ja MLi-2 (LRRK2 kinaasi inhibiitor) üks kord iga kahe päeva järel kahe nädala jooksul. Tulemused. Rotenoon reguleeris üles LRRK2 fosforüülimise ja -gal taset, aktiveerides p53-p21 signaalitelje ja vähendades Rb fosforüülimist. Lisaks reguleeris rotenoon SA-gal aktiivsust, reaktiivsete hapnikuliikide taset ja LRRK2fosforüülimineja inhibeeris lüsosoomide aktiivsust. Rotenooni poolt indutseeritud LRRK2 ülesreguleerimine kahjustas a-syn fibrillide kliirensit. Ravi LRRK2 inhibiitoriga leevendas rotenooni poolt indutseeritud rakkude vananemist ja -syn akumulatsiooni. Järeldused. Rotenooni poolt indutseeritud LRRK2 kinaasi aktiivsuse ülesreguleerimine soodustas rakkude vananemist, mis suurendas -syn akumulatsiooni. LRRK2 kinaasi inhibiitori manustamine noorendas aga rotenooni poolt indutseeritud raku vananemist.

Lisateabe saamiseks klõpsake siin

1. Sissejuhatus

Parkinsoni tõbe (PD), mis on kõige levinum neurodegeneratiivne haigus, iseloomustab motoorse kontrolli halvenemine[1]. PD[2-5] patogeneesi aitavad kaasa mitmed geneetilised ja keskkonnategurid. LRRK2, PD peamine geneetiline riskifaktor, avaldab nii GTPaasi kui ka kinaasi aktiivsust [6]. LRRK2 G2019S mutant, millel on suurenenud kinaasi aktiivsus, soodustab PD progresseerumist [7]. Patsientidel, kellel on G2019S mutant, suureneb PD tekke risk vanusega [8], kuna vananemist seostatakse neurodegeneratiivsete haiguste progresseerumisega [9]. Varem olime teatanud, et LRRK2 kinaasi aktiivsus soodustas rakkude vananemist ja pärssis alfa-sünukleiini (-syn) agregaatide lagunemist [10]. -Syn on Lewy kehade (LB) või Lewy neuriitide põhikomponent, mis on PD surmajärgsed markerid. -syn halvenenud lagunemine põhjustab selle agregatsiooni [11].

Rakkude vananemine kahjustab valkude lagundamise masinaid[12-14]. Kokkupuude väikeses annuses rotenooniga, mis väidetavalt indutseerib PD-d, soodustab rakkude vananemist inimese trabekulaarse võrgu rakuliinis [15]. Lisaks reguleerib rotenoon üles LRRK2 kinaasi aktiivsust neuronites [16]. Seetõttu oletasime, et rotenoon soodustab LRRK2 kinaasi aktiveerimise kaudu rakkude vananemist ja suurendab järelikult -syn agregatsiooni.

Cistanche võib parandada immuunsust

2. Meetodid ja materjalid

2.1. Rakukultuur ja ravi.

Inimese neuroblastoomi rakuliini (SH-SY5Y rakud) kultiveeriti kasvusöötmes (Dulbecco modifitseeritud Eagle'i sööde (DMEM;10-013-CV; Corning cellgro, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), millele oli lisatud 1{{ 48}} protsenti veise loote seerumit (FBS, 35-010-CV, Corning cellgro), 1 protsenti penitsilliini/streptomütsiini (P/S, 10378-016, Gibco, Thermo Fisher Scientific) ja 1 protsenti mükoplasma eemaldamise reaktiivi (KOMA)) 37 kraadi juures 5% CO inkubaatoris (Thermo Fisher Scientific). Diferentseerunud SH-SY5Y rakud (dSH-rakud) saadi pärast töötlemist 10 μM all-trans-retinoehappega (R2625-100MG, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), mis valmistati kasvusöötmes iga kahe järel. päeva seitse päeva. 7. päeval pärast retinoidhappega töötlemist töödeldi rakke rotenooniga (1 uM) ja GSK2572815A (GSK-KI); LRRK2 kinaasi inhibiitor; 1 μM) ettevalmistatud kasvusöötmes 48 tundi. Dimetüülsulfoksiidi (DMSO) kasutati rotenooni ja GSK-KI vehiikulina. -syn fibrillid puhastati nagu eelnevalt kirjeldatud [10]. Rotenooni ja GSK-KI-ga töödeldud rakke töödeldi a-syn fibrillidega (70 nM). Roti primaarseid kortikaalseid neuroneid töödeldi rotenooniga (1 μM), GSK-KI (1 μM) ja a-syn fibrilliga (70 nM) 48 tundi. Roti primaarsete kortikaalsete neuronite ravitingimused olid identsed dSH puhul kasutatavatega. Rakke pesti kaks korda jääkülma fosfaatpuhverdatud soolalahusega (PBS) ja lüüsiti 1x proovipuhvris (50 mM Tris-HCl (pH 6,8), 2 protsenti naatriumdodetsüülsulfaati, 10 protsenti glütserooli, 1 protsenti merkaptoetanooli ja 0,02 protsenti protsent bromofenoolsinist).

2.2. Primaarsete kortikaalsete neuronite eraldamine ja kultiveerimine E16 roti embrüotest.

Rasedad rotid surmati CO, gaasiga. Emakas lõigati lahti ja lootekottidest looted pandi jääkülma HBSS-/-(14175-079, Gibco, Thermo Fisher Scientific). Kolju kooriti tangidega ja ajukoored lõigati välja kogu ajust. Pärast ajukelme eemaldamist inkubeeriti ajukoore 0,25% trüpsiin-EDTA-ga (25200-056, Gibco, Thermo Fisher Scientific) temperatuuril 37 °C 20min. veevann. Järgmisena inkubeeriti ajukoore 40 ug/ml DNaas I-ga (DN25, Sigma-Aldrich), segati õrnalt keerisega ja inkubeeriti 5 minutit 37-kraadises veevannis. Suurem osa supernatandist eemaldati imemisega ja proove inkubeeriti seerumi inhibiitorit sisaldava MEM-iga (11090-08, Gibco, Thermo Fisher Scientific), 1,5% DMEM-iga, 5% FBS-iga, 2,5 mg/ml veise seerumi albumiiniga. (BSA; A7906, Sigma-Aldrich) ja 2,5 mg/ml trüpsiini inhibiitorit (T9253, Sigma-Aldrich). Seerumi inhibiitor eemaldati ja rakusade resuspendeeriti kasvusöötmega 10-kordses mahus. Kasvukeskkonna koostis oli järgmine: neurobasaalne sööde (21103-049, Corning cellgro, Thermo Fisher Scientific), 2% B-27(17504044, Corning cellgro, Thermo Fisher Scientific) ja 1x GlutaMAX{ {34}}(35050-061, Corning cellgro, Thermo Fisher Scientific). Eraldatud roti primaarsed kortikaalsed neuronirakud (3 × 10 kraadi süvendi kohta) külvati 12-süvendiga plaadile (SPL30012, SPL Life Sciences, Pochoen, Lõuna-Korea) ja kultiveeriti kasvusöötmes 37 kraadi juures 5 °C juures. protsenti CO, inkubaatoris 24 tundi. Kultuurisööde asendati kasvusöötmega, millele oli lisatud 0,2 mg/ml 5-fluoro-2'-desoksüuridiini (F0503, Sigma-Aldrich) ja 96 ug/ml uridiini (U3750, Sigma-Aldrich). pärsivad mitoosi. 6. päeval töödeldi rakke 48 tundi 1 uM rotenooni, 1 uM GSK-KI ja 70 nM -syn fibrillidega ning koguti lx proovipuhvriga.

2.3. Western Blot.

Western blotting viidi läbi nagu eelnevalt kirjeldatud [17]. Western blot analüüsis kasutati järgmisi antikehi: küüliku anti-LRRK2 fosfo-S935 monoklonaalne (ab133450, Abcam, Cambridge, UK), küüliku anti-LRRK2 fosfo-S1292 monoklonaalne (ab203181, Abcam), hiire monokloonne anti-LR (Abcam) N241A/34, Neu-roMab, UC Davis, CA, USA), hiire anti-p53 monoklonaalne (inimese p53:sc-126; hiire p53:sc-393031 jaoks; Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA), hiire anti-p21wafi/-Ccip1(p21) monoklonaalne (CM5131, ECM Biosciences, Ver-sailles, KY, USA), hiire anti-Rb monoklonaalne (#9309S, Cell Signaling Technology (CST), Danvers, MA , USA), anti-fosfoRb (Ser807/811) (#9308S, CST), hiire anti-- -galaktosidaasi monoklonaalne (sc-377257, Santa Cruzi biotehnoloogia), hiire anti-p62 monoklonaalne (ab56416) ,Abcam), hiire anti- -aktiini monoklonaalne (sc-47778; Santa Cruzi biotehnoloogia), küüliku anti-LC3B polüklonaalne (#2775S; CST), hiire anti- -sün (kloon) 42) monoklonaalne (610786; BD Bio-sciences, San Jose, CA, USA),anti-fosfotreoniin-argi-nine (#2351S, CST), anti-p53 (SC-99, Santa Cruzi biotehnoloogia), anti-LaminB (SC-6216, Santa Cruzi biotehnoloogia), kitse peroksidaasiga konjugeeritud AffiniPure anti-hiire IgG(H pluss L)(#115-035-003;Jackson Immunoresearch Laboratories Inc., West Grove, PA, USA) ja kitsperoksidaasiga konjugeeritudAffiniPure küülikuvastased IgG(H pluss L)(#1l1-035-144; Jackson Immunoresearch Laboratories Inc.) antikehad. Immunoreaktiivsed signaalid nitrotselluloosmembraanis töötati välja Luminata Crescendo Western HRP-ga (#WBLUR0500, Merck & Co. Inc., Kenilworth, NJ, USA) ja pildid jäädvustati MicroChemi4.2 kaameraga (Shimadzu, Kyoto, Jaapan).

2.4. Läheduse ligeerimise test (PLA) ja immunofluorestsents (IF).

PLA viidi läbi kasutades Duolink⑨ In Situ Detection Reagents Green (DUO{0}}RXN, Sigma-Aldrich), DuolinkeIn in Situ PLA4Probe Anti-Mouse MINUS antikeha (DUO92002-100RXN, Sigma-Aldrich) ja Anti-Rabbit Plus antikeha (DUO92004-100RXN, Sigma-Aldrich), järgides tootja juhiseid. SH-SY5Y rakud, mis olid külvatud 96-kaevu mustadele plaatidele (655077, Greiner Bio-One, Krems-münster, Austria), diferentseeriti ning diferentseerunud rakke töödeldi rotenooni ja GSK-KI-ga 7. päeval. Rakke loputati kaks korda jääkülma Dulbecco PBS-ga (DPBS), fikseeriti 4% paraformaldehüüdiga 30 minutit toatemperatuuril (RT) ja loputati kolm korda jääkülma DPBS-ga. Järgmisena muudeti rakud permeabiliseerituks, kasutades DPBS-is valmistatud 0,1% Triton X-100. Pärast kolmekordset pesemist külma DPBS-ga inkubeeriti rakke tilga blokeeriva lahusega temperatuuril 37 °C 1 tund. Blokeeriv lahus eemaldati ja rakke inkubeeriti antikehadega (50 µl) 37 kraadi juures 3 tundi. Antikehade segu koosnes komplekti kuuluvast antikehade lahjendist (PLA jaoks kasutatud antikehad: hiire LRRK2-vastane monoklonaalne (1:20) antikeha ja küüliku anti-LRRK2 fosfo-S1292 monoklonaalne (1:20) antikeha; antikeha IF-testis kasutatud: kana anti- -gal polüklonaalne antikeha (1:400, ab9361, Abcam)). IF-testis lisati antikeha kogu protsessi vältel kuni PLA pealekandmisetapini. Seejärel pesti proove kaks korda 1x pesupuhvriga A 5 minutit. Sondilahuse valmistamiseks segati Duolink⑧In Situ PLA· Probe Anti-Mouse Minus ja Anti-Rabbit Plus antikeha lahjendiga (1:5). IF-testi jaoks lisati segule ka anti- -gal-antikeha (1:400). Rakke inkubeeriti 50 µl sondilahusega temperatuuril 37 °C 1 tund. Järgmisena pesti rakke kaks korda lx pesupuhvriga A 5 minutit. IF-testi jaoks segati ligaasi (40:1) ja anti- -gal-antikeha (400:1) ligeerimispuhvris. Rakke inkubeeriti ligeerimislahusega (50 µl) 37 kraadi juures 30 minutit ja pesti kaks korda lx pesupuhvriga A 5 minutit. IF-testi jaokspolümeraas(1:4{11}}) inkubeeriti kitse kanavastase IgY H pluss L(Alexa Fluor② 594; ab150172) sekundaarse antikehaga (1:500) 100 minutit temperatuuril 37 °C. Rakke pesti kaks korda 1x pesupuhvriga B 10 minutit, millele järgnes pesemine 0,01x pesupuhvriga B 1 min. Tuuma värvimiseks inkubeeriti rakke DPBS-s valmistatud Hoechst 33342 (1:1000;62249, Thermo Fisher Scientific) toatemperatuuril 10 minutit. Rakkude kujutised 96-kaevu mustadel plaatidel jäädvustati konfokaalse laserskaneeriva mikroskoobiga (LSM 700, Carl Zeiss Jena, Saksamaa).

2.5.Immunosadestamine.

Rotenooniga (1 μM) ja GSK-KI (1 uM) töödeldud dSH-rakkude täisrakulüsaadid valmistati ette lüüsilahusega (PBS, 1% Triton X-100, 1x proteaasi inhibiitori kokteil ja lx fosfataas inhibiitorite kokteil). Lüsaate tsentrifuugiti 4,000g ja 4 kraadi juures 5 minutit ning supernatanti inkubeeriti anti-p53 antikehaga (554293, BD Biosciences) ja PierceProtein G agaroosiga (20398, Thermo Fisher Scientific). resuspendeeriti lüüsilahuses 12 tundi. Helmeid pesti kaks korda lüüsilahusega ja helmeste-valgu kompleks denatureeriti lx proovipuhvriga.

2.6. Tuumafraktsioneerimine.

Tuumafraktsioon eraldati, kasutades NE-PERr tuuma- ja tsütoplasmaatilise ekstraktsiooni reagente (78833, Thermo Fisher Scientific), järgides tootja juhiseid.

2.7. mRNA valmistamine ja kvantitatiivne reaalajas polümeraasi ahelreaktsioon (qRT-PCR).

mRNA eraldati rotenoon/GSK-KI-ga töödeldud dSH rakkudest, kasutades komplekti RNeasy Plus Mini (74134, QIAGEN, Hilden, Saksamaa). Järgmisena pöördtranskribeeriti mRNA komplementaarseks DNA-ks (cDNA), kasutades TOPscript cDNA sünteesikomplekti (EZ005S, Enzynomics, Daejeon, Korea Vabariik). cDNA-le viidi läbi qRT-PCR, kasutades TOPreal"qPCR 2x Pre-MIX (SYBR Green madalaga). ROX, UDG plus) (RT500M, Enzynomics). qRT-PCR jaoks kasutati järgmisi praimereid: inimese p21,5'-ATG AAA TTC ACC CCC TTT CC-3'(edasi)) ja 5'-CCC TAG GCT GTG CTC ACT TC-3'(tagurpidi); inimese p16INK4(p16),5'-CCC AAC GCA CCG AAT AGT TAC-3'(edasi) ja 5'-CAC GGG TCG GGT GAG AGT -3'(tagurpidi).qRT-PCR viidi läbi Mic qPCR tsükliga (MIC-4, BioMolecular Systems, Upper Coomera, Austraalia).

2.8. Vananemisega seotud (SA) galaktosidaasi (-Gal) aktiivsuse, reaktiivsete hapnikuliikide (ROS) ja lüsosoomi aktiivsuse mõõtmine.

30 minutit pärast töötlemist värviti elusad dSH rakud 2 μM GlycoGREEN-Gal (GC611, Goryo Chemical Inc., Hokkaido, Jaapan), 5 uM 2',7'-diklorofluorestseiindiatsetaadiga (DCFDA; 287810, Calbio-chem, San Diego USA）, 2 μM LysoSensorm Blue DND-167 (L7533, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ja 1 μM Hoechst 33342 vastavalt SA -gal aktiivsuse, ROS-i, aktiivsete lüsosoomide ja tuuma uurimiseks. Värvitud rakud olid. monteeritud ProLongDiamond Antifade Mountantiga (P36965, Invitrogen) ja pildistatud konfokaalse laserskaneeriva mikroskoobiga Diferentsiaalse interferentsi kontrastsed kujutised saadi konfokaalse laserskaneeriva mikroskoobi abil. 2.9.SA -Gal aktiivsuse test. SA -gal aktiivsust uuriti { {21}}kaevu raku vananemise analüüsi komplekt (CBA-213, Cell Biolabs Inc., San Diego, CA, USA), järgides tootja juhiseid.

2.10.Hiire käitlemine ja ravimiamet.

Hiiri käideldi nagu eelnevalt kirjeldatud [18] vastavalt Dankooki loomaeetika komitee (Dankook IACUC,18-026) juhistele. 16 nädala vanustele isastele C57BL/6] hiirtele süstiti intraperitoneaalselt rotenooni (0). 0,75 mg/kg kehamassi kohta) ja MLi-2 (LRRK2 kinaasi inhibiitor; 1 mg/kg kehakaalu kohta) üks kord iga kahe päeva järel kahe nädala jooksul.

2.11.Rotarodi test ja ajukoe ettevalmistamine.

14. päeval pärast töötlemist asetati hiired pööratavale silindrikujulisele vardale. Põrandale kukkumiseks kuluv aeg registreeriti. Rotarod-testi üksikasju on kirjeldatud mujal [18]. Järgmisena hiired surmati ja perfuseeriti transkardiaalselt jääkülma HBSS-ga, mis sisaldas Ca2 ja Mg. Keskaju lõigati mikrokääride ja pintsettidega. Kuded lüüsiti PBS-is, mis sisaldas 1 protsenti Triton X-100, 1xXpert proteaasi inhibiitori kokteililahust (P3100, GenDEPOT, Katy, TX, USA) ja lx Xpert fosfataasi inhibiitori kokteililahust (P3200, GenDEPOT). Proovid homogeniseeriti Pellet Pestle Cordless Motor (Sigma-Aldrich) abil. Supernatant allutati Western blot analüüsile, SA-gal aktiivsuse analüüsile ja ensüümiga seotud immunosorbentanalüüsile (ELISA).

2.12.ELISA oligomeer-syn.

Varem olime loonud sandwich-ELISA fibrillaarsete -syn oligomeeride analüüsimiseks, kasutades antikeha, mis tunneb ära -syn agregaatide filamentse konformatsiooni [17]. Keskaju toorlüsaadid allutati ELISA-le ja -syn agregaadid kvantifitseeriti, kasutades -syn fibrillide standardeid.

2.13. Piltide ja andmete analüüsid.

PLA ja elusrakkude värvimise intensiivsust mõõdeti Zen 2012 (Carl Zeiss) abil. Sihtvalkude densitomeetria viidi läbi kasutades

JOONIS 1: Rotenooni poolt indutseeritud LRRK2 kinaasi aktiveerimine soodustab rakkude vananemist inimese diferentseeritud neuroblastoomi rakuliinis. 1 uM rotenooni või 1 uM GSK2578215A (GSK-K), LRRK2 kinaasi inhibiitoriga, töödeldud dSH-rakkude Western blot analüüs 48 tundi, kasutades sihtvalkude (a) vastaseid antikehi. Valkude tihedus normaliseeriti -aktiini (bg).n =3.(h) dSH-rakkudele, mida töödeldi 1 uM rotenooni või 1 uM GSK-KI-ga 48 tundi, viidi läbi proximity ligation test (PLA). fosfo-S1292 LRRK2 ja kogu IRRK2 (PIA-pS1292) ja -galaktosidaasi immunofluorestsents (TF) analüüs, tuumad värviti Hoechst 33342-ga. PLA ja IF värvimisel kasutatud kontrollid näitasid tulemuste paikapidavust (kaks parempoolset paneeli). PLA-pS1292(i) ja -galaktosidaasi (j) intensiivsused normaliseeriti 4',6-diamidino-2-phenylindole.n= 4 omadele; lahtrite arv= 12-17.

Multi Gauge (Fujilm, Tokyo, Jaapan). Kõiki andmekogumeid analüüsiti ja koostati graafik, kasutades Prism 8 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). dSH-rakkude ja roti primaarsete kortikaalsete neuronite abil tehtud katsete andmeid analüüsiti kahesuunalise analüüsi abil. dispersiooni (ANOVA), millele järgneb Bonferroni post hoc test(n=3). Vahepealthe data obtained from mouse experiments, live-cell stain-ing,and PLA in the dSH cells were analyzed using two-way ANOVA, followed by Tukey's post hoc test (n>3). Kõik andmed on esitatud kui keskmine ± keskmise standardviga. *lk<><><><0.0001,and n.s.="not">

JOONIS 2: LRRK kinaasi inhibiitor inhibeerib p53 aktivatsiooni inimese diferentseerunud neuroblastoomi rakuliinis. (a) Koguti täisrakulüsaadid (20 protsenti), mida kasutati immunosadestamise (IP) sisendina, ja tuumafraktsioon. Analüüs näitas, et 20 protsendi sisendi tulemused olid sarnased joonisel 1 täheldatutega. (b, c) IP proovid denatureeriti ja neile viidi läbi Western blot. TXR saidi fosforüülimise tasemed p53-s normaliseeriti p53 kogutasemele. n=3.(de)P53 kogutasemeid tuumas uuriti Western blot analüüsi abil. LaminB-d kasutati tuuma p53 taseme normaliseerimiseks. n=3. (f) p21 ja pl6 mRNA tasemed ravirühmas normaliseeriti vehiikuliga (dimetüülsulfoksiidiga) töödeldud rühmas olevate tasemetega, n =3.

See artikkel on välja võetud raamatust Hindawi Oxidative Medicine and Cellular Longevity Volume 2021, artikli ID 9969842, 16 lehekülge https://doi.org/10.1155/2021/9969842